Summary
Her presenterer vi en luciferase-baserte biosensor for å kvantifisere kinase aktiviteten til store tumor suppressor (LATS)-en sentral kinase i Hippo signalveien. Denne biosensor har forskjellige programmer i grunnleggende og translasjonsforskning forskning å undersøke Hippo veien regulatorer i vitro og vivo.
Abstract
Hippo signalveien er en bevart regulator orgel størrelse og har viktige roller i utviklingen og kreft biologi. På grunn av tekniske utfordringer, er det fortsatt vanskelig å vurdere aktiviteten til denne signalveien, og tolk i en biologisk sammenheng. Eksisterende litteratur om store tumor suppressor (LATS) er avhengig av metoder som er kvalitativ og kan lett bli skalert opp til screening. Vi har nylig utviklet en bioluminescens-baserte biosensor å bruke kinase LATS-en sentral komponent i Hippo kinase cascade. Her beskriver vi prosedyrer for hvordan denne LATS biosensor (LATS-BS) kan brukes til å karakterisere Hippo veien regulatorer. Først, vi gir en detaljert protokoll for å undersøke effekten av en overexpressed protein kandidat (f.eksVEGFR2) på LATS aktiviteten bruker LATS-BS. Deretter viser vi hvordan LATS-BS kan brukes for en småskala kinase inhibitor skjerm. Denne protokollen kan feasibly skalert opp til å utføre større skjermer, som utvilsomt vil identifisere romanen regulatorer av Hippo veien.
Introduction
Hippo signalering veien ble først identifisert i Drosophila som en roman regulator av cellevekst og dyr størrelse1,2. Siden oppdagelsen sin første montering bevis overbevisende vist at Hippo veien spiller viktige roller i utviklingen (f.eksembryonale utviklingen, orgel Størrelseskontroll og tredimensjonale [3D] morfologi), tumorigenesis ( f.eks, tumor utvikling, metastasering, angiogenese, immun evasion, genomisk ustabilitet, stressrespons og resistens), og vev homeostase (f.eks, stem cellefornyelse og differensiering og vev regenerasjon etter skade) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. hippo signalnettverk er ofte dysregulated i ulike kreftformer7,8,9,10,11,12. Derfor har Klargjørende funksjoner av Hippo veien i kreft biologi og legemiddelselskap og regenerativ medisin blitt en av de varmeste områdene i biomedisinsk forskning.
I korte, i Hippo veien, ved aktivering av oppstrøms regulatorer (f.eks, celle-celle kontakt, Nærings stress og ekstracellulær matrix [ECM]), MST1/2 (MST, pattedyr homologs Drosophila flodhesten) serine/threonin (S/T) kinaser phosphorylate/aktivere adapter proteiner hMOB1 og WW45, samt LATS1/2 (LATS) kinaser som deretter phosphorylate transcriptional co aktivator YAP og dens paralog TAZ på bevarte HX(H/R/K)XX(S/T) (H, histidin; R, arginine; K, lysin; S, serine; T, threonin; X, alle aminosyrer) motiver, inkludert YAP-S127 og TAZ-S8911,12. S127-fosforylert YAP (YAP-pS127) og S89-fosforylert TAZ (TAZ-pS89) ved ubiquitination eller binder cytoplasmatiske protein 14-3-3 og er forhindret fra å kommunisere med TEAD1-4 transkripsjonsfaktorer i kjernen til transactivate nedstrøms gener involvert i celle spredning og apoptose (figur 1). Til tross for den enorme interessen i Hippo veien, finnes noen verktøy for å måle Hippo signalering og de som vært historisk begrenset til journalister av YAP/TAZ/TEAD transcriptional. Faktisk inntil ganske nylig, var det ingen verktøy for å måle dynamikk og aktivitet flodhesten signalering komponenter i en kvantitativ, sanntid, høy gjennomstrømming og ikke-invasiv måte både i vitro og i vivo.
Gitt vår nye forståelse av rollen som protein-protein interaksjoner i fysiologi og patologi, er det stor interesse for utvikling av verktøy som kan brukes til å studere disse interaksjoner i en kvantitativ og sanntids måte13, 14,15,16. Faktisk, det har vært betydelig fremgang i utviklingen av bio-analytiske strategier, inkludert de gjær to-hybrid (Y2H)17, overflate plasmon resonans (SPR)18og han selvmord resonans energi overføring (bånd)19 analyser, evaluere protein-protein interaksjoner. Men bære disse tilnærmingene begrensning av krever betydelig optimalisering av reporteren orientering, slik at mange konstruksjoner må testes for å finne en effektiv en. Videre har disse metodene også en relativt lav signal-til-støy-forhold, slik at kresne en sann positiv signaliserte kan være utfordrende.
Protein complementation analyser ble utviklet for å overvinne disse begrensningene. Den første generasjonen av protein complementation analyser basert på split multicolor fluorescens proteiner og ikke kunne løse de nevnte begrensninger20. Flerfarget fluorescens proteiner består av bare ett domene, gjør det vanskelig å dele dem i to separate stabil fragmenter med lav tilhørighet og bakgrunn støy21. Deretter ble firefly luciferase identifisert som en ny kandidat for bruk i å utvikle delt protein complementation analyser. I denne tilnærmingen, er firefly luciferase delt i to fragmenter (N-Terminus og C-terminalen luciferase [NLuc og CLuc]) med hver fragment smeltet til et mål protein av interesse. Hvis den NLuc og CLuc bringes inn i nærheten på samspillet av de to mål proteinene, luciferase aktivitet er rekonstruert og bioluminescent lys genereres i nærvær av luciferin substrat og ATP22. I 2001, ved å utføre en kombinasjon screening ved hjelp av et bibliotek med NLuc og CLuc fragmenter klipp ulike nettsteder og knyttet til proteiner med forskjellige linkers, Paulmurugan og Gambhir ved Stanford University utviklet en optimalisert split-firefly luciferase fragment-assistert complementation system for protein-protein interaksjoner23. I dette systemet kuttet firefly luciferase aminosyre (aa) 398 å danne NLuc og CLuc, som er knyttet til to proteiner av interesse ved hjelp av et fleksibelt linker av åtte glysin rester og to serine rester.
Bruker en lignende tilnærming, vi nylig utviklet en ny LATS-BS kombinerer NLuc til 15 aa av YAP rundt LATS fosforylering området på S127 (YAP15) og CLuc med 14-3-3. Full lengde YAP protein ble ikke brukt å unngå confounding signaler av post-translasjonell modifikasjoner av YAP (f.eks, fosforylering på andre nettsteder og ubiquitination) av andre oppstrøms regulatorer. LATS-BS presenteres her kan ikke-invasively overvåke Hippo signalering aktivitet både i vitro i levende celler og vivo i mus20,24 (figur 2). Her beskriver vi en detaljert protokoll for å måle LATS kinase aktivitet i vitro med LATS-BS. Først viser vi hvordan LATS-BS kan brukes å undersøke effekten av en overexpressed protein på LATS aktivitet. Deretter viser vi hvordan biosensor kan brukes til å overvåke aktiviteten til Hippo veien etter behandling med agenter regulere Hippo veien. Denne protokollen kan brukes til å identifisere og karakterisere signalnettverk trasé eller stimuli regulere LATS kinase aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. undersøkelse av en antatte Regulator Hippo signalnettverk bruker LATS-BS
-
Plating og transfection celler
- Utarbeidelse av cellekultur
- Varme 1 x PBS, DMEM som inneholder 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin og 0,25% trypsin-EDTA 37 ° c i et vannbad i ca 30 min.
- Rengjør en biosafety skap med 70% etanol.
- Plasser vev kultur retter, Pasteur Pipetter, serologisk Pipetter og pipette-spisser i vev kultur panseret som kreves.
- Ta ut 1 x PBS, media og trypsin-EDTA i vannbad, rengjøre dem med 70% etanol og plassere dem i panseret.
- Vedlikehold og plating av celler for hva
- Velg en celle linje med høy transfection effektivitet (f.eksHEK293) for eksperimentet. Sjekk for uttrykket av Hippo veien komponentene i denne cellen linje ved western blot sørge Hippo signalnettverk er aktiv.
- Vokse HEK293 celler i DMEM i 10 cm Petri retter i en inkubator på 37 ° C og 5% CO2. Overvåke cellene under et mikroskop hver dag. Passasje cellene som beskrevet nedenfor når 80-90% confluency er observert.
- Vask cellene ved å legge 5 mL 1 x PBS inn en plate, forsiktig virvlende platen og aspirating media fullstendig.
- Legg 1 mL av trypsin-EDTA til platen. Snurr den slik at trypsin jevnt dekker cellene.
- Inkuber cellene på 37 ° C i en CO2 inkubator i 5 minutter eller til alle cellene er koblet fra.
- Legg 4 mL av media (med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin) å nøytralisere trypsin, resuspend cellene av pipettering opp og ned flere ganger, og dispense én tiendedel (0,5 mL) i cellene i nye 100 mm plater (for bestått forholdet 1:10) inneholder 9,5 mL komplett medier.
- For LATS-BS transfection, telle celler ved hjelp av en hemocytometer og plate 2 x 105 celler i hver brønn av en 12-vel plate 24 timer før transfection.
Merk: Høyere celle tall kan øke bakgrunnen bioluminescent signalet som Hippo signalering aktivitet er regulert av celle confluency. Lavere celle tall kan øke celle følsomhet transfection reagenser og øke celle død24.
- Hva de LATS-BS alene eller sammen med kandidat genet
- Miniprep LATS-BS plasmider (NLuc-YAP15-pcDNA3.1-Hygro og 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro) frisk fra DH5a bakterier flytende kultur (nødvendig for å oppnå optimal LATS-BS uttrykk).
- 1 time før transfection, Sug opp mediet plate, tilsett 500 µL av komplett vekst medium hver brønn av 12-vel platene og tilbake cellene til inkubator.
Merk: Følgende protokollen beskriver hva metoder ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig polymer-baserte transfection reagens. Andre transfection reagenser kan også være passende for hva; men har vi ennå ikke testet dem. - Gjør løsninger A og B som beskrevet i tabell 1. N transfections, gjøre (N + 0,5) x løsning B premix.
- Straks legge utvannet polymer-baserte transfection reagensen (løsning B) til DNA (løsning A). Pipetter forsiktig opp og ned for å blande.
- Inkuber prøven ved romtemperatur i 15 min tillate transfection komplekser skjemaet.
- Legge til det totale volumet (76 µL) av hva komplekser dropwise i hver brønn av 12-vel plate med mild virvler.
- Inkuber cellene natten (18 – 24 h) på 37 ° C.
Merk: For celler som polymer-baserte transfection reagenser, inkubasjon tid kan bli redusert til 5 h. - Dagen etter transfection, fjerne transfection kompleks-inneholder media og erstatte den med ferske komplett medier. Kultur cellene på 37 ° C for en annen dag til å utføre luciferase analysen.
- Utarbeidelse av cellekultur
-
Luciferase analysen
Merk: Luciferase Reporter analysen systemet oppdager firefly og Renilla sammen i ett analysen brukes til luciferase analyser. Hvis Renilla ikke ble brukt som en intern kontroll, utføre ettrinns luciferase analysen ved å legge til LARII uten å legge Renilla gjenkjenning reagensen.- Utarbeidelse av cellen lysates
- Fortynne 5 x passiv lyseringsbuffer (PLB) med destillert vann som følger:
- Totalt volum 1 x PLB kreves = N x (50 μL av 5 x PLB) + 200 μL av dH2O = N x 250 μL 1 x PLB per brønn av 12-vel platene (N = antall eksempler).
- Sug opp media fullstendig. Legge til 1 mL 1 x PBS i hver brønn. Snurr den forsiktig å fjerne frittliggende celler og gjenværende vekst medier. Sug opp 1 x PBS helt. Kontroller at ingen gjenværende 1 x PBS gjenstår før tilsetning av 1 x PLB.
- Legge til 250 μL 1 x PLB/godt.
- Plasser kultur platene på en rocking plattform med milde rocking for å sikre fullstendig og selv dekning av celle-monolayer med 1 x PLB. Rock kultur platene i romtemperatur i 15 min til at cellene å lyse.
- Overføring av lysate til en 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Måle bioluminescent signalet
- Ta ut LARII (20 μL/sampling) fra-80 ° C og equilibrate det til romtemperatur.
- Forberede Renilla gjenkjenning reagens N analyser: legge (N + 1) x 0,4 μL 50 x substrat å (N + 1) x 19,6 μL bufferen.
- Predispense 10 μL av hver celle lysate til 1.5-mL rør.
- Programmet en luminometer utføre en 2-s premeasurement forsinkelse, etterfulgt av en 10-s tidsperiode for hver dobbelt luciferase analysen.
Merk: De første og andre mål vil være tilsvarende til LATS-BS signalet og Renilla internkontroll signalet, henholdsvis. Noen luminometer kompatibel med en eller to luciferase kan brukes. - Nøye overføre 20 μL LARII reagens til en tube og raskt Pipetter opp og ned 3 x å blande den.
- Umiddelbart sett røret i luminometer og starte lesing.
- Fjerne prøven røret fra luminometer, umiddelbart legge til 20 μL Renilla reagens og blande av pipettering opp og ned 3 x. Ta prøven i luminometer og starte neste lesing. Registrer målinger.
- Forkaste reaksjon røret og Fortsett til neste prøven.
- Utarbeidelse av cellen lysates
2. en skjermen for å identifisere Hippo Pathway regulatorer bruker LATS-BS
-
Cellekultur og transfections
- Kultur HEK293AD celler som beskrevet i avsnitt 1.1.
Merk: HEK293AD er mer tilhenger enn andre HEK293 linjer, som gjør det en god cellen linje for bruk i skjermer. - Koble celler som beskrevet i delen 1.1.2. Telle og plate 2 x 106 celler i 100 mm plater 24 timer før transfection.
- 1 time før transfection, Sug opp media fra platen og erstatte dem med 5 mL frisk komplett vekst medier.
- Gjør løsninger A og B som beskrevet i tabell 2.
- Straks legge utvannet polymer-baserte transfection reagensen (løsning B) til DNA (løsning A). Pipetter opp og ned for å blande.
- Inkuber prøven ved romtemperatur i 15 min tillate transfection komplekser skjemaet.
- Legge det totale volumet (500 µL) av hva komplekser dropwise til celler med mild virvler.
- Inkuber cellene overnatting på 37 ° C.
- Neste dag, trypsinize og telle celler. Plate 1 x 104 til 2 x 104 celler i hver brønn av en 96-brønns plate i et totalt volum på 100 µL av media per brønn. Inkuber for en annen dag.
- Neste dag, Legg agenter/små molekyler regulere Hippo veien i en siste konsentrasjon av 10 µM hver brønn, 1 – 4 h før du utfører luciferase analysen.
Merk: For de fleste små molekyler/agenter, 4 h behandling på 10 µM påvirker ikke cellen levedyktighet. Hvis en lavere konsentrasjon, kan behandling forlenges for en lengre periode.
- Kultur HEK293AD celler som beskrevet i avsnitt 1.1.
-
Luciferase analysen
-
In vitro luciferase analysen
- Sug opp media fra cellene helt. Vask cellene med 100 µL av 1 x PBS i hver brønn. Sug opp helt.
- Legge til 20 µL av 1 x PLB (forberedt som beskrevet i trinn 1.2.1.1) i hver brønn av 96-brønns platene.
- Plass kultur platene på en rocking plattform med milde rocking i romtemperatur i 15 min.
- Nøye overføre 20 µL av LARII-reagensen i hver brønn og Pipetter opp og ned 3 x å blande.
- Umiddelbart plassere platen i en plate-lesing luminometer og starte lesing.
- Levende celle luciferase analysen
- Lag 11 x D-luciferin lager slik: oppløse 1.5 mg av D-luciferin pulver i 1 mL av normal kultur medier.
- Overfør 10 µL av 11 x D-luciferin i hvert godt og bland det forsiktig med media som er allerede i brønnen.
- Sett cellene i inkubator for 10 min.
- Plasser platen i luminometer og starte lesing.
Merk: Hvis signalet intensiteten ikke er sterk nok på denne konsentrasjonen av D-luciferin, en annen 10 µL av D-luciferin aksjer kan legges til cellene.
-
In vitro luciferase analysen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LATS-BS var cotransfected med ulike gener evaluere deres effekt på LATS aktivitet (Figur 3). I dette eksperimentet, ble Renilla brukt som en intern kontroll. Forbigående uttrykk for YAP-5SA, en konstituerende aktiv form for YAP, årsaker øker YAP transcriptional mål og en påfølgende økning i LATS kinase aktivitet gjennom en etablert tilbakemelding veien25. MST, oppstrøms aktivator av LATS i Hippo veien (figur 1), øker også biosensor signal intensiteten. Men VEGFR overuttrykte, som utløser PI3K/MAPK signalering, hemmer LATS og reduserer signal intensiteten av LATS-BS.
I den andre protokollen, LATS-BS ble transfekterte i HEK293AD og 24 timer etter transfection, celler ble vedtatt i 96-brønnen platene. 40 h etter transfection, cellene ble behandlet med ulike kjente små molekyl regulatorer Hippo signalnettverk etterfulgt av en luciferase analysen (Figur 4). VEGFR, PI 3-kinase og cellular energinivået er tre kjente negative regulatorer LATS kinase24. I dette eksperimentet, GDS0941, PI 3-kinase inhibitor, axitinib og SU4312, ble hemmere av VEGFR og 2D-glukose, som fører til energi stress av en hemming av glukose metabolisme og ATP produksjon, brukt til å aktivere LATS-BS. Omvendt, ble LPA, S1P og TPA brukt til å hemme LATS-BS. Dette eksperimentet viser at LATS-BS kan brukes til å måle både aktivering og hemming effekten av et lite molekyl på LATS kinase aktiviteten.
| Løsning en | |
| pCDNA3.1-Hygro-NLuc-YAP15 | 1 μL (50 ng) |
| pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc | 1 μL (50 ng) |
| Plasmider uttrykke en kandidat genet (f.eks MST) | 1 μL (400 ng) |
| eller tom vektor (f.eks pcDNA3.1-Hygro) | |
| Renilla vector (pRL-TK) (valgfritt) | 1 μL (20 ng) |
| DMEM (ingen serum/antibiotika) | 34 ΜL |
| Totalt volum | 38 ΜL |
| Løsning B | |
| Polymer-baserte transfection reagens | 1,5 ΜL |
| (3:1 ratio med totalt μg DNA) | |
| DMEM (ingen serum/antibiotika) | 36,5 ΜL |
| Totalt volum | 38 ΜL |
Tabell 1: Protokoll for å lage løsninger A og B bruker en polymer-baserte transfection reagens for å undersøke en antatte regulator av Hippo veien med LATS-BS.
| Løsning en | |
| pCDNA3.1-Hygro-NLuc-YAP15 | 10 μL (3 μg) |
| pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc | 10 μL (3 μg) |
| DMEM (ingen serum/antibiotika) | 230 ΜL |
| Totalt volum | 250 ΜL |
| Løsning B | |
| Polymer-baserte transfection reagens | 18 ΜL |
| (3:1 ratio med totalt μg DNA) | |
| DMEM (ingen serum/antibiotika) | 232 ΜL |
| Totalt volum | 250 ΜL |
Tabell 2: Protokoll for å lage løsninger A og B bruker en polymer-baserte transfection reagens for screening for å identifisere regulatorer av Hippo veien benytter LATS-BS.
Figur 1: The Hippo veien i pattedyr. Hippo veien begrenser orgel størrelse av phosphorylating og hemme YAP og TAZ. Når Hippo veien er aktivert, er SAV, LATS1/2 MOB fosforylert og aktivert av MST1/2. Aktivert LATS1/2 phosphorylates YAP/TAZ på bevarte serine-inneholder nettsteder. 14-3-3 samhandler med fosforylert YAP/TAZ, og dermed begrenser deres kjernefysiske lokalisering og co transactivation nedstrøms genet mål gjennom TEADs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: LATS-BS split-protein complementation analysen basert på luciferase. Luciferase N - og C-terminus domener (NLuc og CLuc) er knyttet til 15 amino acid omkringliggende YAP-S127 og 14-3-3, henholdsvis. YAP15/14-3-3 bindende etter LATS fosforylering fremmer luciferase complementation og bioluminesens signal utslipp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: resultater fra en representant eksperiment evaluere effekten av et gen på LATS aktivitet. Biosensor kan uttrykkes alene eller sammen med andre gener i HEK293AD celler å undersøke deres effekt på LATS kinase aktivitet (gjennomsnittlig ± SD; n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: resultater fra en representant eksperiment evaluere effekten av små molekyler på LATS aktivitet i HEK293AD celler. HEK293AD celler transfekterte med LATS-BS og behandlet med følgende narkotika: PI3K hemmer (GDC0941), 10 μM 4 h; VEGFR hemmer (axitinib), 10 μM 4 h; 2-deoxyglucose, 25 mM 1t; LPA, 10 μM 1t; sphingosine-1-phosphophate (S1P), 1 μM 1t; 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA), 5 nM 1t; VEGFR hemmer (SU4312), 10 μM 4 h (gjennomsnittlig ± SD; n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens Hippo veien spiller viktige roller i ulike biologiske prosesser, og feilregulering av Hippo veien fører til kreft6, er hvordan Hippo veien er regulert i respons på ulike stimuli ikke helt forstått. I tillegg har det vært ingen kvantitative og sanntids-system for å vurdere aktiviteten til Hippo kjernekomponenter. Nylig har vi utviklet og godkjent en ny biosensor for å måle LATS kinase aktivitet i Hippo veien24. Denne biosensor kan brukes ikke bare for kvantitativt og nøyaktig overvåking Hippo signalering aktivitet i levende celler, men også for skjermer av narkotika målretting Hippo veien for kreft terapi. I tillegg kan biosensor-basert screening føre til oppdagelsen av romanen gener ansvarlig for regulering av Hippo veien. Gitt viktigheten av Hippo signalering i kreft, ville finne avgjørende crosstalk mellom andre gener og Hippo veien være en verdifull studie for å gjennomføre for alle kreft biologer. Derfor denne biosensor har potensial til å gjøre innovasjoner i dagens behandling av kreft, og kan gi en nyttig ny terapeutiske strategi for vellykket behandling av kreft.
Det er flere viktige punkter som bør vurderes når du bruker LATS-BS. Første i vår erfaring har LATS-BS største følsomheten når plasmider brukes for transfection pakkes fersk fra bakterier. Andre påvirker mengden LATS-BS plasmider transfekterte i celler LATS-BS følsomhet og signal intensiteten. Mengden av plasmider DNA kan økes til 400 ng/fragment for LATS-BS og 600 ng for genet av interesse per brønn av en 12-vel plate. Generelt, vil bruk mer plasmider gi en høyere signal intensitet men mindre følsomhet. Tredje kan celle confluency påvirke LATS-BS signal bakgrunnen. Samsvar med den veletablerte rollen flodhesten signalering i mobilnettet Svar å confluency, vi har observert at celler med høyere confluency har en høyere bakgrunn LATS-BS tapsfrie aktivering av endogene LATS. Følgelig Vis tynt-belagt celler et lavere LATS-BS bakgrunn signal. Optimal celle confluency kan velges avhengig av formålet av eksperimentet (høy confluency for å observere LATS hemming, lav confluency for å observere LATS aktivisering). Fjerde Renilla kan brukes som en intern kontroll for hva effektivitet, og for vanskelig å transfect celler (f.eksMCF10A), hva reagens: DNA forholdet kan endres til 4:1. Til slutt anbefaler vi sterkt cotransfecting MST2 som en positiv og YAP-S127A som en negativ kontroll hver gang biosensor brukes.
Hvert verktøy har sine begrensninger. LATS-BS er kunstig underlaget en endogen protein, som kan alltid utkonkurrere sant underlaget av protein av interesse. Denne effekten er kjent som en bufring effekt av biosensor. Forbedring av biosensor med høyere signal intensitet og lave uttrykk kan bidra til å løse dette problemet. En annen begrensning er at tilbakemelding trasé kan komplisere tolkningen av data fra LATS-BS. Det er mange lineære og ikke-lineære samspill signalnettverk trasé som sannsynlig påvirke LATS-BS signalet. LATS-BS viser bare den kumulative effekten av en stimulans LATS kinase aktivitet. Det bemerkes imidlertid at at begrensningen er ikke unikt for LATS-BS, men heller forekommer ofte i studier av molekylærbiologi. Dermed må LATS-BS data tolkes i sammenheng med flere probative eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av stipend fra Canadian Institute for Health Research (CIHR #119325, 148629) og den kanadiske Breast Cancer Foundation (CBCF) til XY. TA støttes av Vanier Canada Graduate stipend og Ontario International Graduate Scholarship. HJJVR støttes av dronning Elizabeth II Graduate stipend innen vitenskap og teknologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM with high glucose |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| 5x Passive lysis buffer | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo® Luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 ml kit |
| 20/20 luminometer | Turner Biosystems | 998-2036 | Single tube reader luminometer |
| GloMax®Navigator with dual injectors | Promega | GM2010 | 96-well plates reader luminometer |
References
- Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).
- Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The Hippo Pathway: Immunity and Cancer. Cancers. 10 (4), 94 (2018).
- Maugeri-Saccà, M., De Maria, R. The Hippo pathway in normal development and cancer. Pharmacology & Therapeutics. 186, 60-72 (2018).
- van Rensburg, H. J. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Yeung, B., Yu, J., Yang, X. Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis. International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).
- Zhao, Y., Yang, X. The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance. International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).
- Yu, F. -X., Guan, K. -L. The Hippo pathway: regulators and regulations. Genes & Development. 27 (4), 355-371 (2013).
- Yang, X., Xu, T. Molecular mechanism of size control in development and human diseases. Cell Research. 21 (5), 715 (2011).
- Visser, S., Yang, X. LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis. Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes & Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP. Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).
- Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein. Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).
- Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. Characterization of oligomer formation of amyloid-β peptide using a split-luciferase complementation assay. Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).
- Decock, M., et al. Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing. FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).
- Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1. European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).
- Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
- Pattnaik, P. Surface plasmon resonance. Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).
- Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
- Hu, C. -D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).
- Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).
- Azad, T., et al. A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis. Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).
- Moroishi, T., et al. A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis. Genes & Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).
