Summary
Здесь мы представляем на основе Люцифераза биосенсора для количественного определения активности протеинкиназы большие опухолевые супрессоры (лат)-Центральный киназы в бегемота, сигнальный путь. Этот биодатчик имеет разнообразные применения в базовых и трансляционного исследования, направленные на расследование Бегемот путь регуляторы в пробирке и в естественных условиях.
Abstract
Бегемот, сигнальный путь является регулятором сохраняется размер органа и важную роль в биологии развития и рака. Из-за технических проблем по-прежнему трудно оценить деятельность этой сигнальный путь и интерпретировать его в биологическом контексте. В существующей литературе по большие опухолевые супрессоры (лат) опирается на методы, которые носят качественный характер и не может легко быть увеличен для скрининга. Недавно мы разработали на основе биолюминесценции биосенсора для мониторинга активности протеинкиназы ЛАТОВ а основного компонента Каскад киназы Бегемот. Здесь мы описываем процедуры как это биосенсор ЛАТОВ (ЛАТОВ-BS) может использоваться для характеристики Бегемот путь регуляторы. Во-первых мы предоставляем подробный протокол для расследования эффект гиперэкспрессия белка кандидата (например, VEGFR2) на активность ЛАТОВ, используя ЛАТОВ-BS. Затем мы покажем, как ЛАТОВ-BS может использоваться для небольших киназы ингибитора экрана. Этот протокол реально может быть увеличен для выполнения больших экранов, которые несомненно будут определены новые регуляторы Бегемот пути.
Introduction
Бегемот, сигнальные пути была впервые выявлена у дрозофилы как Роман регулятор роста клеток и животных размер1,2. С момента ее первоначального открытия, монтаж доказательства убедительно показал, что бегемот путь играет важнейшую роль в развитии (например, раннего эмбрионального развития, орган управления размер и трехмерные [3-D] Морфология), опухолей () например, развитие опухоли, метастазы, ангиогенез, иммунных уклонение, геномной нестабильности, реакции на стресс и лекарственной устойчивости) и ткани гомеостаза (например, обновление стволовых клеток и дифференциации и регенерации тканей после травмы) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. Бегемот сигнализации это часто dysregulated в различных раков7,8,9,10,,1112. Таким образом изучение функций Бегемот пути в биологии рака и терапии и регенеративной медицины стал одним из горячих районах в биомедицинских исследований.
В краткое, Бегемот пути, после активации регуляторами вверх по течению (например, контакт ячеек, биогенного стресса и внеклеточного матрикса [ECM]), киназы Серин/треонин (S/T) MST1/2 (MST; млекопитающих гомолог дрозофилы бегемота) фосфорилировать/активировать адаптер белки hMOB1 и WW45, а также киназы LATS1/2 (в ЛАТАХ), которые, впоследствии, фосфорилировать транскрипционный анализ совместного активатор YAP и его paralog таз на сохранение HX(H/R/K)XX(S/T) (H, гистидина; R, аргинин; K, лизин; S, серина; T, треонин; X, любой аминокислоты) мотивы, включая яп-S127 и таз-S8911,12. S127 фосфорилированных YAP (яп pS127) и S89-фосфорилированных таз (таз pS89) деградировавших в результате ubiquitination или привязку цитоплазматического белка 14-3-3 и лишены возможности взаимодействия с TEAD1-4 транскрипционные факторы в ядре для transactivate вниз по течению генов, участвующих в пролиферации и апоптоза (рис. 1). Несмотря на огромный интерес к Бегемот пути, существует несколько инструментов для измерения Бегемот сигналов и те, которые были исторически ограничивается журналистами транскрипционный анализ вывода YAP/таз/TEAD. Действительно, до недавнего времени, были не инструменты для измерения динамики и деятельности Бегемот сигнализации компоненты в количественных, реального времени, высокой пропускной способности и неинвазивным способом в пробирке и в естественных условиях.
Учитывая наши новые понимания роли белок белковых взаимодействий в физиологии и патологии, есть большой интерес к разработке инструментов, которые могут быть использованы для изучения этих взаимодействий в количественных и реального времени13, 14,,1516. Действительно достигнут значительный прогресс в развитии био аналитических стратегий, в том числе (Y2H) 2 гибрида дрождей17, поверхностного плазмон резонанс (СРП)18и Фёрстер резонанс энергии передачи (ЛАДА)19 анализов, для оценки взаимодействия протеин протеина. Однако эти подходы нести ограничение требует оптимизации репортер ориентации, таким образом, что многие конструкции должен быть испытан найти эффективный один. Кроме того эти подходы также имеют сравнительно низкое соотношение сигнал шум, таким образом, что взыскательных правда позитивных сигналов может быть сложным.
Белка дополнения анализов были разработаны, чтобы преодолеть эти ограничения. Первое поколение белка дополнения анализов был основан на Сплит многоцветной флуоресцирование белками и не может решить вышеупомянутые ограничения20. Многоцветная флуоресценции белков состоят из одного домена, что делает его трудно разделить их на две отдельные фрагменты стабильной с низкого сродства и фоновый шум21. Впоследствии Светлячок Люцифераза была определена как новый кандидат для использования при разработке Сплит белка дополнения анализов. В этом подходе Светлячок Люцифераза делится на два фрагмента (Люцифераза [NLuc и CLuc] N- и C-терминала) с каждого фрагмента, сливается с целевого белка интереса. Если NLuc и CLuc принесены в близости при взаимодействии двух целевых белков, воссоздана Люцифераза активность и биолюминесцентных свет генерируется при наличии люциферин субстрата и СПС22. В 2001 году выполняя комбинаторной скрининг с использованием библиотеки, содержащие NLuc и CLuc фрагменты разрезать на различных сайтах и придает белков с различными компоновщики, Paulmurugan и Гамбхир Стэнфордского университета разработали оптимизированные Сплит Светлячок Люцифераза фрагмент при содействии взаимодополняемости системы для взаимодействий протеин23. В этой системе Светлячок Люцифераза разрезается на аминокислоты (aa) 398 сформировать NLuc и CLuc, которые прикреплены к два протеинов интереса, с использованием гибких компоновщика восьми глицин остатков и остатков два серина.
Используя аналогичный подход, мы недавно разработали новый ЛАТОВ-BS путем сплавления NLuc до 15 АА штата Яп, окружающие место фосфорилирование ЛАТОВ на S127 (YAP15) и CLuc с 14-3-3. Полнометражный YAP белка не использовался, чтобы избежать смешанных сигналов, столб-поступательные изменения других вышестоящих регуляторами штата Яп (например, фосфорилирование на других сайтах и ubiquitination). ЛАТ-BS, представленные здесь неинвазивно может контролировать Бегемот сигнализации деятельности как в пробирке в живых клетках и в естественных условиях в мышей20,24 (рис. 2). Здесь мы описываем подробный протокол для измерения ЛАТОВ киназы активность в пробирке с помощью ЛАТОВ-BS. Во-первых мы покажем, как ЛАТОВ-BS может использоваться для исследовать эффект гиперэкспрессия белка на активность ЛАТОВ. Затем мы покажем, как биосенсор может использоваться для мониторинга активности Бегемот путь после лечения с агентами, регулирующие Бегемот путь. Этот протокол может использоваться для выявления и характеристики сигнальных путей или стимулы, регулирующие деятельность киназы ЛАТОВ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. расследование разоблачало регулятора Бегемот сигнализации с помощью ЛАТОВ BS
-
Обшивка и transfection клеток
- Подготовка клеточной культуры
- Тепло 1 x PBS, DMEM, содержащие 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина и трипсин 0.25%-ЭДТА до 37 ° C в водяной бане около 30 мин.
- Тщательно очистите биобезопасности кабинет с 70% этиловом спирте.
- Место культуры ткани блюда, пипетки Пастера, серологические пипетки и наконечники в культуре ткани капюшон при необходимости.
- Взять 1 x PBS, средства массовой информации и трипсин ЭДТА из водяной бани, чистить их с 70% этиловом спирте и поместите их в капот.
- Техническое обслуживание и покрытие для transfection клетки
- Выберите линии клетки с высоким трансфекции эффективности (например, HEK293) для эксперимента. Проверить для выражения Бегемот путь компонентов в этой линии клетки, Западная помарка, чтобы убедиться, что бегемот сигнализация активна.
- Растут HEK293 клеток в среде DMEM в чашках Петри 10 см в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2. Контролировать каждый день клетки под микроскопом. Проход клетки, как описано ниже, когда наблюдается confluency 80-90%.
- Вымойте клетки, добавив 5 мл ПБС в тарелку, нежно закрученного пластину и аспирационных СМИ полностью.
- Добавьте 1 mL трипсина-ЭДТА к пластине. Вихрем пластину для обеспечения что трипсин равномерно покрывает клетки.
- Инкубируйте клетки при 37 ° C в инкубатор CO2 для 5 минут или до тех пор, пока все клетки отсоединены.
- Добавить 4 мл СМИ (с 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина) для нейтрализации трипсина, Ресуспензируйте клетки, закупорить вверх и вниз несколько раз и обходиться одной десятой (0,5 мл) клеток на новые пластины 100 мм (для прохождения соотношение 1:10) содержащий 9,5 мл Полная СМИ.
- Для transfection ЛАТОВ-BS граф с использованием Горяева и пластины 2 x 105 клеток в каждой скважине 12-ну пластины 24 h перед transfection клетки.
Примечание: Использование выше числа клеток может увеличить биолюминесцентных сигнала фона как Бегемот сигнализации что деятельность регулируется confluency клеток. Используя меньше числа клеток может увеличить чувствительность клеток к трансфекции реагентов и увеличить клеток смерть24.
- Трансфекция ЛАТОВ-BS самостоятельно или совместно с кандидатом гена
- Алкалический ЛАТОВ-BS свежие плазмид (NLuc-YAP15-pcDNA3.1 гигро и 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro) из жидкой культуры бактерий DH5a (необходимо для достижения оптимального ЛАТОВ-BS выражение).
- 1 ч до трансфекции, аспирационная среднего от пластины, 500 мкл полный рост среднего для каждой скважины 12-ну плит и возвращение клетки в инкубатор.
Примечание: Следующий протокол описывает методы трансфекции, использование коммерчески доступных на полимерной основе трансфекции реагента. Другие реагенты трансфекции также могут быть пригодны для transfection; Однако мы не еще не проверили их. - Сделайте решения A и B, как описано в таблице 1. Для N transfections, сделать (N + 0,5) x решение B премикс.
- Немедленно Добавьте разбавленные на полимерной основе трансфекции реагента (решение B) ДНК (решение A). Пипетка вверх и вниз осторожно перемешать.
- Инкубируйте образца при комнатной температуре 15 минут позволить трансфекции комплексов к форме.
- Добавьте общий объем (76 мкл) трансфекции комплексов каплям каждой скважины 12-ну пластины с нежным закрученной.
- Инкубировать клетки на ночь (18 – 24 ч) при температуре 37 ° C.
Примечание: Для клетки, которые чувствительны к полимерной основе трансфекции реагентов, время инкубации может быть уменьшено до 5 ч. - На следующий день после трансфекции, удалите трансфекции комплекс содержащих СМИ и заменить его на свежий полный СМИ. Культура клетки при 37 ° C на другой день для выполнения Люцифераза assay.
- Подготовка клеточной культуры
-
Люцифераза пробирного
Примечание: Люцифераза репортер Assay системы обнаружения Светлячок и Renilla вместе в одном assay используется для Люцифераза анализов. Если Renilla не используется в качестве внутреннего контроля, выполняют одношаговый Люцифераза пробирного, добавив LARII без добавления реагента обнаружения Renilla .- Подготовка lysates клетки
- Разбавьте 5 x пассивной литического буфера (ПРБ) с дистиллированной водой следующим образом:
- Общий объем 1 x PLB требуется = N x (50 мкл 5 x ПРБ) + 200 мкл dH2O = мкл N x 250 1 x PLB за колодец 12-ну пластин (N = количество образцов).
- Аспирационная СМИ полностью. Добавьте 1 mL ПБС в каждой скважине. Вихрем пластину осторожно, чтобы удалить отдельные клетки и остаточного роста средств массовой информации. Аспирационная ПБС полностью. Убедитесь, что нет остаточных 1 x PBS остается перед добавлением 1 x PLB.
- Добавить 250 мкл 1 x ПРБ/хорошо.
- Поместите пластины для культуры на качающейся платформе с плавное покачивание обеспечить полную и даже освещение монослоя клеток с 1 x PLB. Рок-культуры пластин при комнатной температуре 15 минут позволить Лизируйте клетки.
- Трансфер lysate пробки microcentrifuge 1,5 мл.
- Измерение сигнала биолюминесцентных
- Вывезти LARII (20 мкл/образец) от-80 ° C и сбалансировать его до комнатной температуры.
- Подготовка Renilla обнаружения реагент для N анализов: добавить (N + 1) x 0.4 мкл 50 x субстрата (N + 1) x 19.6 мкл буфера.
- Predispense 10 мкл каждой ячейки lysate для 1.5 мл пробирок.
- Программа Люминометр выполнять 2-s суппорты задержки, последовал период 10-s измерения для каждого двойной Люцифераза assay.
Примечание: Первого и второго измерения будет соответствовать ЛАТОВ-BS сигнала и сигнала внутреннего контроля Renilla , соответственно. Можно использовать любой совместимый с одиночной или двойной Люцифераза люминометра. - Тщательно передачи 20 мкл Реагента LARII в одну трубу и быстро Пипетка вверх и вниз 3 x, чтобы смешать его.
- Сразу же поместить трубку в Люминометр и начать чтение.
- Удалить образец трубки из Люминометр, сразу же добавить 20 мкл Реагента Renilla и смешивать, закупорить вверх и вниз 3 x. Образец в Люминометр и начать следующий чтения. Запись измерения.
- Отменить реакции трубки и перейти к следующему образцу.
- Подготовка lysates клетки
2. экран для выявления Бегемот путь регуляторов с помощью ЛАТОВ-BS
-
Культура клеток и transfections
- Культура клетки HEK293AD, как описано в разделе 1.1.
Примечание: HEK293AD является более сторонником, чем другие HEK293 клеточных линий, что делает его хорошим клеток линии для использования в экранах. - Отсоедините клетки, как описано в разделе 1.1.2. Граф и пластины 2 х 106 клеток в 100 мм пластин 24 h перед transfection.
- 1 ч до трансфекции, аспирационная СМИ от плиты и заменить их с 5 мл свежего полный рост средств массовой информации.
- Сделайте решения A и B, как описано в таблице 2.
- Немедленно Добавьте разбавленные на полимерной основе трансфекции реагента (решение B) ДНК (решение A). Пипетка вверх и вниз, чтобы смешать.
- Инкубируйте образца при комнатной температуре 15 минут позволить трансфекции комплексов к форме.
- Добавьте общий объем (500 мкл) трансфекции комплексов каплям клетки с нежным закрученной.
- Инкубировать клетки на ночь на 37 ° C.
- На следующий день, trypsinize и подсчитать количество ячеек. Пластина4 1 x 10-2 x 104 клеток в каждой скважине 96-луночных пластине в суммарный объем 100 мкл СМИ за хорошо. Инкубируйте на другой день.
- Следующий день, добавьте агентов и малых молекул, регулирующих Бегемот путь в конечной концентрации 10 мкм до каждой скважины, 1 – 4 h перед выполнением Люцифераза assay.
Примечание: Для большинства малых молекул/агентов, 4 h лечения на 10 мкм не влияет на жизнеспособность клеток. Если используется более низкой концентрации, лечения может быть продлен для более длительного периода времени.
- Культура клетки HEK293AD, как описано в разделе 1.1.
-
Люцифераза пробирного
-
В vitro пробирного Люцифераза
- Аспирационная СМИ от клетки полностью. Вымойте клетки с 100 мкл ПБС в каждой скважине. Аспирационная полностью.
- 20 мкл 1 x PLB (подготовлен как описано в шаге 1.2.1.1) в каждой скважине 96-луночных плит.
- Поместите пластины для культуры на качающейся платформе с плавное покачивание при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Тщательно перевести 20 мкл Реагента LARII в каждой скважине и Пипетка вверх и вниз 3 x смешивать.
- Сразу же Установите пластину в тарелку чтение Люминометр и начать чтение.
- Assay Люцифераза живые клетки
- Сделать 11 x D-люциферин фондовой следующим: растворяют 1,5 мг D-люциферин порошка в 1 мл раствора нормальной культуры средств массовой информации.
- Передача 10 мкл 11 x D-люциферин в каждый хорошо и осторожно перемешать его с средствами массовой информации, которая уже находится в колодец.
- Замените клеток в инкубатор для 10 мин.
- Установите пластину в Люминометр и начать чтение.
Примечание: Если интенсивность сигнала не достаточно сильны на этой концентрации D-люциферин, еще 10 мкл D-люциферин акций могут быть добавлены к клеткам.
-
В vitro пробирного Люцифераза
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ЛАТ-BS был cotransfected с различными генами, чтобы оценить их влияние на активность ЛАТОВ (рис. 3). В этом эксперименте Renilla был использован как внутреннего контроля. Переходных выражение яп 5SA, учредительный активной формы YAP, причины повышения уровня яп транскрипционный анализ целей и последующее увеличение активности протеинкиназы ЛАТОВ через установленные обратной связи путь25. MST, вверх по течению активатор ЛАТОВ в бегемота пути (рис. 1), также увеличивает интенсивность сигнала биодатчик. Однако гиперэкспрессия БЕСПРОГРЕССИВНУЮ, который вызывает PI3K/MAPK сигнализации, препятствует ЛАТОВ и снижает интенсивность сигнала ЛАТОВ-BS.
Во втором протоколе лат-BS был transfected в HEK293AD и через 24 часа после transfection клетки были переданы в 96-луночных пластины. 40 ч после transfection клетки относились с различными известными малые молекулы регуляторы Бегемот сигнализации, следуют Люцифераза пробирного (рис. 4). БЕСПРОГРЕССИВНУЮ, PI 3-киназы и клеточный уровень энергии являются три известных негативных регуляторы ЛАТОВ киназы24. В этом эксперименте, GDS0941, PI 3-киназы ингибитора, axitinib и SU4312 ингибиторы БЕСПРОГРЕССИВНУЮ и глюкозы 2-D, который вызывает стресс энергии путем ингибирования АТФ производства и метаболизм глюкозы, были использованы для того чтобы активировать ЛАТОВ-BS. Обратно LPA, S1P и ДТС были использованы для подавления ЛАТОВ-BS. Этот эксперимент показывает, что ЛАТОВ-BS может использоваться для измерения активации и ингибирование эффект маленькой молекулы на активность протеинкиназы ЛАТОВ.
| Решение A | |
| pCDNA3.1 гигро-NLuc-YAP15 | 1 мкл (50 нг) |
| pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc | 1 мкл (50 нг) |
| Плазмиды, выражая кандидат ген (например MST) | 1 мкл (400 нг) |
| или пустой вектор (например , pcDNA3.1 гигро) | |
| Renilla вектор (ПРЛ ТЗ) (опционально) | 1 мкл (20 нг) |
| DMEM (не сыворотки/антибиотики) | 34 МКЛ |
| Общий объем | 38 МКЛ |
| Решение B | |
| Реагент на основе полимеров Трансфекция | 1.5 МКЛ |
| (3:1 соотношение с общей мкг ДНК) | |
| DMEM (не сыворотки/антибиотики) | 36.5 МКЛ |
| Общий объем | 38 МКЛ |
Таблица 1: Протокол для принятия решения A и B, с использованием полимерной основе трансфекции реагент для расследования предполагаемого регулятор Бегемот путь с ЛАТОВ-BS.
| Решение A | |
| pCDNA3.1 гигро-NLuc-YAP15 | 10 мкл (3 мкг) |
| pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc | 10 мкл (3 мкг) |
| DMEM (не сыворотки/антибиотики) | 230 МКЛ |
| Общий объем | 250 МКЛ |
| Решение B | |
| Реагент на основе полимеров Трансфекция | 18 МКЛ |
| (3:1 соотношение с общей мкг ДНК) | |
| DMEM (не сыворотки/антибиотики) | 232 МКЛ |
| Общий объем | 250 МКЛ |
Таблица 2: Протокол для принятия решения A и B, с использованием полимерной основе трансфекции реагент для скрининга для выявления регуляторы Бегемот пути, с помощью ЛАТОВ-BS.
Рисунок 1: бегемот путь в млекопитающих. Бегемот путь ограничивает размер органа, phosphorylating и ингибирования яп и таз. Когда активируется путь Бегемот, SAV, LATS1/2 и ТОЛПА фосфорилированных и активированную MST1/2. Активированный LATS1/2 фосфорилирует YAP/таз на сохранившихся участках, серин содержащих. 14-3-3 взаимодействует с фосфорилированных YAP/таз, тем самым препятствуя их ядерной локализации и Сопредседатель transactivation течению гена целей через TEADs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: ЛАТОВ-BS Сплит белка дополнения assay основанный на Люцифераза. Люцифераза N - и C-конечная доменов (NLuc и CLuc) прикреплены к 15 амино кислоты окружающие яп-S127 и 14-3-3, соответственно. YAP15/14-3-3 привязки после фосфорилирования ЛАТОВ способствует Люцифераза комплементарности и излучение сигнала биолюминесценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: результаты от представителя эксперимент, оценке влияния гена на активность ЛАТОВ. Биосенсор может быть выражено в одиночку или вместе с другими генов в клетках HEK293AD расследовать их влияние на активность протеинкиназы ЛАТОВ (среднее ± SD; n = 3, **p < 0.01, ***p < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: результаты от представителя эксперимент, оценке влияния малых молекул на ЛАТАХ активность в клетках HEK293AD. HEK293AD клетки были transfected с ЛАТОВ-BS и следующими препаратами: ингибитор PI3K (GDC0941), 10 мкм для 4 ч; Ингибитор БЕСПРОГРЕССИВНУЮ (axitinib), 10 мкм для 4 ч; 2-deoxyglucose, 25 мм, за 1 ч; LPA, 10 мкм на 1 ч; сфингозин-1-phosphophate (S1P), 1 мкм 1 ч; 12-O-tetradecanoylphorbol-13-ацетат (ДТС), 5 Нм за 1 ч; Ингибитор БЕСПРОГРЕССИВНУЮ (SU4312), 10 мкм для 4 h (среднее ± SD; n = 3, **p < 0.01, ***p < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как Бегемот путь играет важную роль в различных биологических процессах, и регуляции Бегемот путь приводит к рака6, как Бегемот путь регулируется в ответ на различные стимулы полностью не поняты. Кроме того был не количественные, так и в реальном времени системы для оценки деятельности основных компонентов Бегемот. Недавно мы разработали и проверены Роман биосенсора для измерения активности протеинкиназы ЛАТОВ в бегемота путь24. Этот биодатчик может использоваться не только для количественно и качественно мониторинга Бегемот сигнализации деятельность в живых клетках, но и для экранов ориентация Бегемот путь для терапии рака наркотиков. Кроме того скрининг на основе биосенсор может привести к открытию новых генов, ответственных за регулирование Бегемот путь. Учитывая важность Бегемот сигнализации в рак, вывод решающую перекрестных помех между другими генами и Бегемот путь бы ценные исследования провести для всех рака биологов. Таким образом Этот биодатчик имеет потенциал, чтобы сделать инновации в текущем лечении рака и может послужить полезным новые терапевтические стратегии для успешного лечения рака.
Есть несколько важных моментов, которые следует учитывать при использовании ЛАТОВ-BS. Во-первых наш опыт показывает, лат-BS имеет наибольшую чувствительность, когда плазмид, используемые для transfection извлекаются свежие от бактерий. Во-вторых количество плазмидов ЛАТОВ-BS transfected в клетки будет влиять на интенсивность ЛАТОВ-BS чувствительность и сигнал. Количество плазмидной ДНК может быть увеличена до 400 нг/фрагмент для ЛАТОВ-BS и 600 нг для гена интереса в колодец 12-ну плиты. В целом используя более плазмида даст более высокой интенсивности сигнала, но меньше чувствительность. В-третьих клеток confluency может повлиять на фоне сигнала ЛАТОВ-BS. В соответствии с установившимися роль Бегемот сигнализации в клеточных реакций на confluency, мы наблюдали, что клетки с выше confluency имеют высокий фон ЛАТОВ-BS сигнала благодаря активации эндогенного ЛАТОВ. Соответственно редко покрытием клетки показывают ниже фонового сигнала ЛАТОВ-BS. Confluency оптимальное ячейки могут быть выбраны в зависимости от цели эксперимента (высокой confluency для наблюдения за ЛАТОВ ингибитирование; низкий confluency для наблюдения за активации ЛАТОВ). В-четвертых Renilla может использоваться в качестве внутреннего контроля для эффективность трансфекции, и для жесткого transfect клетки (например, MCF10A), соотношение трансфекции реагента: ДНК могут быть изменены до 4:1. Наконец мы настоятельно рекомендуем cotransfecting MST2 как положительный контроль и яп-S127A как отрицательный контроль каждый раз, когда используется биодатчик.
Каждый инструмент имеет свои ограничения. ЛАТ-BS является искусственным субстратом эндогенного белка, который всегда можно переиграть истинный субстрата протеина интереса. Этот эффект известен как буферизации эффект биодатчик. Улучшение биосенсора с более высокой интенсивности сигнала и более низких уровнях выражение может помочь преодолеть эту проблему. Еще одним ограничением является, что пути обратной связи может осложнить интерпретации данных от лат-BS. Существует много линейного и нелинейного взаимодействия сигнальные пути, которые вероятно влияние сигнала ЛАТОВ-BS. ЛАТ-BS только демонстрирует совокупный эффект стимула на активность протеинкиназы ЛАТОВ. Следует отметить, однако, что это ограничение не является уникальной для ЛАТОВ-BS, но довольно часто встречается в исследования по молекулярной биологии. Таким образом лат-BS данные следует толковать в контексте несколько убедительных экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана от грантов от Канадского института медицинских исследований (КНИИЗ #119325, 148629) и Канадский Фонд рака молочной железы (CBCF) для XY. TA поддерживается Ванье Канада Магистратура стипендии и стипендии выпускников Международного Онтарио. HJJVR поддерживается королевы Елизаветы II выпускников стипендии в области науки и техники.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM with high glucose |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| 5x Passive lysis buffer | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo® Luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 ml kit |
| 20/20 luminometer | Turner Biosystems | 998-2036 | Single tube reader luminometer |
| GloMax®Navigator with dual injectors | Promega | GM2010 | 96-well plates reader luminometer |
References
- Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).
- Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The Hippo Pathway: Immunity and Cancer. Cancers. 10 (4), 94 (2018).
- Maugeri-Saccà, M., De Maria, R. The Hippo pathway in normal development and cancer. Pharmacology & Therapeutics. 186, 60-72 (2018).
- van Rensburg, H. J. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Yeung, B., Yu, J., Yang, X. Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis. International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).
- Zhao, Y., Yang, X. The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance. International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).
- Yu, F. -X., Guan, K. -L. The Hippo pathway: regulators and regulations. Genes & Development. 27 (4), 355-371 (2013).
- Yang, X., Xu, T. Molecular mechanism of size control in development and human diseases. Cell Research. 21 (5), 715 (2011).
- Visser, S., Yang, X. LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis. Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes & Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP. Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).
- Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein. Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).
- Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. Characterization of oligomer formation of amyloid-β peptide using a split-luciferase complementation assay. Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).
- Decock, M., et al. Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing. FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).
- Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1. European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).
- Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
- Pattnaik, P. Surface plasmon resonance. Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).
- Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
- Hu, C. -D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).
- Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).
- Azad, T., et al. A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis. Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).
- Moroishi, T., et al. A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis. Genes & Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).
