Summary
Här presenterar vi ett luciferas-baserade biosensor för att kvantifiera kinase aktiviteten av stora tumörsuppressor (LATS)-en central kreatinkinas i flodhästen signalering utbildningsavsnitt. Detta biosensor har skilda tillämpningar i grundläggande och translationell forskning som syftar till att utreda Hippo väg regulatorer in vitro- och in-vivo.
Abstract
Flodhästen signaling pathway är en bevarade regulator av orgel storlek och har viktiga roller i utveckling och cancer biologi. På grund av tekniska utmaningar, det är fortfarande svårt att bedöma aktiviteten av denna signalväg och tolkar det i ett biologiska sammanhang. Den befintliga litteraturen på stora tumörsuppressor (LATS) förlitar sig på metoder som är kvalitativ och kan inte enkelt kan skalas upp för screening. Nyligen har vi utvecklat en Mareld-baserade biosensor för att övervaka aktiviteten kinase av LATS-en kärnkomponent i Hippo Kinas kaskad. Här, beskriver vi procedurer för hur denna LATS biosensor (LATS-BS) kan användas för att karaktärisera Hippo väg regulatorer. Först ger vi ett detaljerat protokoll för att undersöka effekten av en överuttryckt protein-kandidat (t.ex., VEGFR2) på LATS aktivitet med LATS-BS. Sedan visar vi hur LATS-BS kan användas för en småskalig kinase inhibitor skärm. Detta protokoll kan rimligen vara skalas upp att utföra större skärmar, som utan tvekan kommer att identifiera nya regulatorer av Hippo-vägen.
Introduction
Flodhästen signalering utbildningsavsnitt identifierades först i Drosophila som en roman regulator av celltillväxt och djurens storlek1,2. Sedan första upptäckten, montering bevis har övertygande visat att Hippo vägen spelar avgörande roller i utvecklingen (t.ex., tidig embryonal utveckling, orgel storlekskontroll och tredimensionella [3D] morfologi), tumourigenesis () t.ex., tumörutveckling, metastaser, angiogenes, immune evasion, genomisk instabilitet, stressreaktion och läkemedelsresistens), och vävnad homeostas (t.ex., stem cellförnyelse och differentiering och vävnadsregeneration efter skada) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. flodhäst signalering är ofta dysreglerad i olika cancerformer7,8,9,10,11,12. Därför har belysa funktioner av Hippo väg i cancerbiologi och therapeutics och regenerativ medicin blivit en av de hetaste områdena inom biomedicinsk forskning.
I kort, i flodhäst väg, vid aktivering av uppströms tillsynsmyndigheter (t.ex., cell-cell kontakt, näringsämne stress och extracellulär matrix [ECM]), MST1/2 (MST; däggdjur homologs i Drosophila Hippo) serin/treonin (S/T) kinaser fosforylera/aktivera adapter proteiner hMOB1 och WW45, samt LATS1/2 (LATS) kinaser, som därefter fosforylera transkriptionell samtidig aktivator YAP och dess paralog TAZ på bevarade HX(H/R/K)XX(S/T) (H, histidin; R, arginin; K, lysin; S, serine; T, treonin; X, alla aminosyror) motiv, inklusive YAP-S127 och TAZ-S8911,12. S127-fosforyleras YAP (YAP-pS127) och S89-fosforyleras TAZ (TAZ-pS89) förnedras av ubikvitinering eller binder till cytoplasma protein 14-3-3 och hindras från att interagera med TEAD1-4 transkriptionsfaktorer i kärnan till transactivate nedströms gener som är involverade i cellproliferation och apoptos (figur 1). Trots det enorma intressen i Hippo väg, finns några verktyg för att mäta Hippo signalering och dem som har varit historiskt begränsat till reportrar YAP/TAZ/utv transkriptionell produktion. Faktiskt, tills helt nyligen fanns det inga verktyg för att mäta dynamik och aktivitet av flodhästen signalering komponenter i en kvantitativ, realtid, hög genomströmning och icke-invasiv sätt både in vitro- och in vivo.
Med tanke på vår framväxande förståelse för rollen som protein-protein interaktioner i fysiologi och patologi, finns det stort intresse i utvecklingen av verktyg som kan användas för att studera dessa interaktioner i en kvantitativ och realtid sätt13, 14,15,16. Faktiskt har det skett betydande framsteg i utvecklingen av bioanalytiska strategier, inklusive de jäst två-hybrid (Y2H)17, ytan plasmon resonans (SPR)18och Förster resonans energi överföring (bandet)19 analyser, att utvärdera protein-protein interaktioner. Dock bär dessa synsätt begränsning av som kräver betydande optimering av reporter orientering, sådan att många konstruktioner måste testas för att hitta en effektiv en. Ytterligare, dessa metoder har också en relativt låg signal-brus-förhållande, sådan att kräsna en sant positiva signalering kan vara en utmaning.
Protein komplettering analyser utvecklades för att övervinna dessa begränsningar. Den första generationen av protein komplettering analyserna baserades på split multicolor fluorescens proteiner och kunde inte lösa de ovannämnda begränsningar20. Multicolor fluorescens proteiner består av endast en domän, vilket gör det svårt att dela dem i två separata stabil fragment med låg affinitet och bakgrund buller21. Därefter identifierades firefly luciferas som ny kandidat för användning i utveckla split protein komplettering analyser. I denna strategi, är firefly luciferas uppdelad i två fragment (N-terminal och C-terminal luciferas [NLuc och CLuc]) med varje fragment som smält till ett målprotein sevärdheter. Om den NLuc och CLuc förs in närheten på samspelet mellan de två målprotein, luciferas verksamhet bereds och självlysande ljus genereras i närvaro av luciferin substrat och ATP22. I 2001, genom att utföra en kombinatorisk screening använder ett bibliotek som innehåller NLuc och CLuc fragment klipp vid olika platser och bifogas proteiner med olika linkers, Paulmurugan och Maja vid Stanford University utvecklat en optimerad split-firefly luciferas fragment-assisted komplettering system för protein-protein interaktioner23. I detta system skärs firefly luciferas på aminosyra (aa) 398 bilda NLuc och CLuc, som är kopplade till två proteiner av intresse med hjälp av en flexibel länkare av åtta glycin rester och två serine rester.
Använda en liknande strategi, vi nyligen utvecklat ett nytt LATS-BS av fusing NLuc till 15 aa för YAP kring webbplatsen LATS fosforylering på S127 (YAP15) och CLuc med 14-3-3. Fullängds YAP proteinet användes inte, att undvika störande signaler av post-translationella modifieringar av YAP (t.ex., fosforylering på andra webbplatser och ubikvitinering) av andra uppströms tillsynsmyndigheter. LATS-BS presenteras här kan icke-invasivt övervaka Hippo signalering verksamhet både in vitro i levande celler och i vivo i möss20,24 (figur 2). Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för mätning av LATS Kinas aktivitet in vitro- med LATS-BS. Vi visar först hur LATS-BS kan användas för att undersöka effekten av ett överuttryckt protein på LATS aktivitet. Sedan visar vi hur biosensor kan användas för att övervaka aktiviteten hos Hippo vägen efter behandling med medel som reglerar Hippo vägen. Detta protokoll kan användas för att identifiera och karaktärisera signalering vägar eller stimuli som reglerar LATS Kinas aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. undersökningen av en förmodad Regulator av Hippo signalering med LATS-BS
-
Plätering och transfection celler
- Beredning av cellodling
- Värm 1 x PBS, DMEM innehållande 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin och 0,25% trypsin-EDTA till 37 ° C i ett vattenbad i ca 30 min.
- Ren noggrant ett biosäkerhet skåp med 70% etanol.
- Placera vävnadsodling rätter, Pasteur-pipetter, serologiska pipetter och pipettspetsar i vävnadsodling huven som krävs.
- Ta ut 1 x PBS, media och den trypsin-EDTA från vattenbadet, rengör dem med 70% etanol och placera dem i huven.
- Underhåll och plätering av cellerna för transfection
- Välja en cell fodrar med en hög transfection-effektivitet (t.ex., HEK293) för experimentet. Kontrollera om uttrycket av Hippo väg komponenter i denna cellinje genom western blot kontrollera Hippo signalering är aktiv.
- Odla HEK293 cellerna i DMEM i 10 cm petriskålar i en inkubator på 37 ° C och 5% CO2. Övervaka cellerna i Mikroskop varje dag. Passagen cellerna som beskrivs nedan när 80-90% konfluens observeras.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 5 mL 1 x PBS till en platta, försiktigt virvlande plattan och aspirera media helt.
- Tillsätt 1 mL av trypsin-EDTA till plattan. Snurra på plattan för att säkerställa att trypsin jämnt täcker cellerna.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i en CO2 inkubator för 5 min eller tills alla celler är fristående.
- Tillsätt 4 mL media (med 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin) att neutralisera trypsin, Omsuspendera cellerna genom pipettering upp och ner flera gånger, och fördela en tiondel (0,5 mL) av cellerna i nya 100 mm plattor (för en förbigående ratio 1:10) innehållande 9,5 mL komplett media.
- För LATS-BS transfection, räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och plattan 2 x 105 celler i varje brunn 12-well platta 24 h innan transfection.
Obs: Använder högre cell nummer kan öka bakgrunden självlysande signalen som Hippo signalering verksamhet är reglerad av cell konfluens. Använda lägre cell nummer kan öka cellen känslighet för transfection reagenser och öka cell död24.
- Transfection av LATS-BS ensam eller tillsammans med den kandidat genen
- Miniprep LATS-BS plasmider (NLuc-YAP15-pcDNA3.1-Hygro och 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro) färskt från DH5a bakterier flytande kultur (nödvändigt för att uppnå en optimal LATS-BS-uttryck).
- 1 h innan transfection, aspirera på medellång från plattan, tillsätt 500 µL komplett odlingsmedium i varje brunn av 12-väl pläterar och återgå cellerna till inkubatorn.
Obs: Följande protokoll beskriver transfection metoder använder en kommersiellt tillgänglig polymerbaserade transfection reagens. Andra transfection reagenser kan också vara lämplig för transfection; men har vi inte ännu testat dem. - Se lösningar A och B såsom beskrivs i tabell 1. För N transfections, göra (N + 0,5) x lösning B premix.
- Tillsätt omedelbart efter utspädning polymerbaserade transfection reagens (lösning B) i DNA (lösning A). Pipettera upp och ner försiktigt för att blanda.
- Inkubera provet vid rumstemperatur för 15 min till tillåta transfection komplex form.
- Tillsätt den totala volymen (76 µL) av transfection komplex droppvis till varje brunn av 12-väl plattan med försiktig omskakning.
- Inkubera cellerna över natten (18 – 24 h) vid 37 ° C.
Obs: För celler som är känsliga för polymerbaserade transfection reagenser, inkubationstiden kan minskas till 5 h. - Dagen efter transfection, ta bort transfection komplex-som innehåller media och ersätta det med frisk komplett media. Odla cellerna vid 37 ° C för en annan dag att utföra luciferas assay.
- Beredning av cellodling
-
Luciferas assay
Obs: Luciferas Reporter Assay systemet upptäcka firefly och Renilla tillsammans i en analys används för luciferas analyserna. Om Renilla inte används som intern kontroll, utföra one-step luciferas analys genom att lägga till LARII utan att lägga till Renilla upptäckt reagensen.- Beredning av den cell lysates
- Späd 5 x passiv lyseringsbuffert (PLB) med destillerat vatten enligt följande:
- Total volym av 1 x PLB krävs = N x (50 μL av 5 x PLB) + 200 μL dH2O = N x 250 μL av 1 x PLB per brunn av 12-väl pläterar (N = antal prover).
- Aspirera media helt. Tillsätt 1 mL 1 x PBS i varje brunn. Snurra plattan försiktigt att ta bort fristående celler och kvarvarande tillväxt medier. Aspirera 1 x PBS helt. Kontrollera att inga kvarvarande 1 x PBS resterna före tillsats av 1 x PLB.
- Tillsätt 250 μL 1 x PLB per brunn.
- Placera kultur plattorna på en gungande plattform med mild gunga för att säkerställa fullständig och jämn täckning av den cell enskiktslager med 1 x PLB. Rock kulturen plattor i rumstemperatur i 15 min så att cellerna att lysera.
- Överföra den lysate till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Mäta självlysande signalen
- Ta ut LARII (20 μL/prov) från-80 ° C och temperera den vid rumstemperatur.
- Förbereda Renilla upptäckt reagens för N analyser: Lägg till (N + 1) x 0.4 μL 50 x substrat till (N + 1) x 19,6 μL av sin buffert.
- Predispense 10 μL av varje cell lysate 1,5 mL rör.
- Programmera en luminometer att utföra en 2-s premeasurement fördröjning, följt av en 10 s mätperiod för varje dubbla luciferas assay.
Obs: De första och andra mätningarna kommer att motsvarande LATS-BS signalen Renilla interna styrsignal, respektive. Någon luminometer som är kompatibel med en enkel eller dubbel luciferas kan användas. - Försiktigt överför 20 μL av LARII reagens till en tub och snabbt Pipettera upp och ner 3 x att blanda.
- Omedelbart placera röret i luminometern och initiera behandlingen.
- Ta bort provet röret från luminometern omedelbart Tillsätt 20 μL av Renilla reagens och blanda genom pipettering upp och ner 3 x. Ta provet i luminometern och inleda nästa läsning. Spela in mätningarna.
- Kassera reaktionsröret och gå vidare till nästa provet.
- Beredning av den cell lysates
2. en skärm att identifiera Hippo Pathway tillsynsmyndigheter använda LATS-BS
-
Cellodling och transfections
- Kultur HEK293AD celler som beskrivs i avsnitt 1.1.
Obs: HEK293AD är mer vidhäftande än andra HEK293 cellinjer, vilket gör det en bra cellinje för användning i skärmar. - Lossa cellerna som beskrivs i avsnitt 1.1.2. Räkna och tallrik 2 x 106 celler i 100 mm plattor 24 h innan transfection.
- 1 h innan transfection, sug ut media från plattan och ersätta dem med 5 mL av färska komplett tillväxt medier.
- Se lösningar A och B såsom beskrivs i tabell 2.
- Tillsätt omedelbart efter utspädning polymerbaserade transfection reagens (lösning B) i DNA (lösning A). Pipettera upp och ner för att blanda.
- Inkubera provet vid rumstemperatur för 15 min till tillåta transfection komplex form.
- Tillsätt den totala volymen (500 µL) transfection komplex droppvis till celler med försiktig omskakning.
- Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C.
- Nästa dag, trypsinize och räkna cellerna. Tallrik 1 x 104 till 2 x 104 celler i varje brunn av en plattan med 96 brunnar i en total volym av 100 µL av media per brunn. Inkubera i en annan dag.
- Nästa dag, lägga till agenter/små molekyler som reglerar Hippo vägen med en slutlig koncentration på 10 µM till varje brunn, 1 – 4 h innan du utför luciferas analysen.
Obs: För de flesta små molekyler/agenter, en 4 h-behandling på 10 µM inte påverkar cellernas viabilitet. Om en lägre koncentration används, kan behandlingen förlängas för en längre tidsperiod.
- Kultur HEK293AD celler som beskrivs i avsnitt 1.1.
-
Luciferas assay
-
In vitro luciferas assay
- Aspirera media från cellerna helt. Tvätta cellerna med 100 µL av 1 x PBS i varje brunn. Sug upp helt.
- Tillsätt 20 µL av 1 x PLB (förberedd som beskrivs i steg 1.2.1.1) till varje brunn av 96 brunnar pläterar.
- Placera kultur plattorna på en gungande plattform med mild gunga i rumstemperatur i 15 min.
- Försiktigt över 20 µL av LARII reagens i varje brunn och Pipettera upp och ner 3 x att blanda.
- Omedelbart Placera plattan i en tallrik-läsning luminometer och initiera behandlingen.
- Levande cellen luciferas assay
- Gör 11 x D-luciferin lager enligt följande: Lös 1,5 mg D-luciferin pulver i 1 mL normal kultur media.
- Över 10 µL av 11 x D-luciferin i varje brunn och blanda försiktigt med media som är redan i brunnen.
- Byt ut cellerna i inkubatorn i 10 min.
- Placera plattan i luminometern och initiera behandlingen.
Obs: Om signal intensiteten inte är stark nog på denna koncentration av D-luciferin, en annan 10 µL av D-luciferin beståndet kan läggas till cellerna.
-
In vitro luciferas assay
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LATS-BS var cotransfected med olika gener att utvärdera deras inverkan på LATS aktivitet (figur 3). I detta experiment användes Renilla som intern kontroll. Övergående uttryck för YAP-5SA, en konstitutiv aktiv form av YAP, orsakar ökande nivåer av YAP transkriptionell mål och en efterföljande ökning i LATS Kinas aktivitet genom en etablerad feedback väg25. MST, uppströms aktivator av LATS i Hippo väg (figur 1), ökar också biosensor signal intensiteten. Dock VEGFR överuttryck, som utlöser PI3K/MAPK signalering, hämmar LATS och minskar signal intensiteten i LATS-BS.
I det andra protokollet, LATS-BS var transfekterade in HEK293AD och 24 timmar efter transfection, celler passerades i plattor med 96 brunnar. 40 h efter transfection, cellerna behandlades med olika kända småmolekylära regulatorer av Hippo signalering följt av ett luciferas assay (figur 4). VEGFR, PI 3-Kinas, och cellulär energinivå är tre kända negativa regulatorer av LATS kinase24. I detta experiment, GDS0941, PI 3-tyrosinkinashämmare, axitinib och SU4312, användes hämmare av VEGFR och 2-D-glukos, vilket orsakar energi stress av en hämning av glukosmetabolism och ATP produktionen, för att aktivera LATS-BS. Omvänt, användes LPA, S1P och TPA att hämma LATS-BS. Detta experiment visar att LATS-BS kan användas för att mäta både aktivering och hämning effekten av en liten molekyl på aktiviteten LATS tyrosinkinashämmare.
| Lösning A | |
| pCDNA3.1-Hygro-NLuc-YAP15 | 1 μL (50 ng) |
| pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc | 1 μL (50 ng) |
| Plasmid uttrycker en kandidat genen (e.g. MST) | 1 μL (400 ng) |
| eller tom vektor (t.ex. pcDNA3.1-Hygro) | |
| Renilla vektor (pRL-TK) (tillval) | 1 μL (20 ng) |
| DMEM (inget serum/antibiotika) | 34 ΜL |
| Totala volymen | 38 ΜL |
| Lösning B | |
| Polymerbaserade transfection reagens | 1,5 ΜL |
| (3:1 förhållandet med totala μg DNA) | |
| DMEM (inget serum/antibiotika) | 36,5 ΜL |
| Totala volymen | 38 ΜL |
Tabell 1: Protokoll för att göra lösningar A och B med hjälp av polymerbaserade transfection reagens för att utreda en förmodad regulator av Hippo väg med LATS-BS.
| Lösning A | |
| pCDNA3.1-Hygro-NLuc-YAP15 | 10 μL (3 μg) |
| pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc | 10 μL (3 μg) |
| DMEM (inget serum/antibiotika) | 230 ΜL |
| Totala volymen | 250 ΜL |
| Lösning B | |
| Polymerbaserade transfection reagens | 18 ΜL |
| (3:1 förhållandet med totala μg DNA) | |
| DMEM (inget serum/antibiotika) | 232 ΜL |
| Totala volymen | 250 ΜL |
Tabell 2: Protokoll för att göra lösningar A och B använder en polymer-baserade transfection reagens för screening identifiera regulatorer av Hippo väg med LATS-BS.
Figur 1: The Hippo clearanceväg däggdjur. Hippo vägen begränsar orgel storlek genom phosphorylating och hämma YAP och TAZ. När Hippo smittvägen är aktiverad, är SAV, LATS1/2 och MOB fosforyleras och aktiveras av MST1/2. Aktiverade LATS1/2 phosphorylates YAP/TAZ på bevarade serin-innehållande platser. 14-3-3 interagerar med fosforyleras YAP/TAZ, och hämmar därigenom sin cellkärnelokalisering och samtidig transkription av nedströms gen mål genom TEADs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: LATS-BS split-protein komplettering assay baserat på luciferas. Luciferas N - och C-terminus domäner (NLuc och CLuc) är kopplade till 15 amino acid omgivande YAP-S127 och 14-3-3, respektive. YAP15/14-3-3 bindande efter LATS fosforylering främjar luciferas komplettering och Mareld signal utsläpp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: resultat från ett representativt experiment som utvärderar effekten av en gen på LATS aktivitet. Biosensor kan uttryckas ensam eller tillsammans med andra gener i HEK293AD celler för att undersöka deras effekt på LATS Kinas aktivitet (medelvärde ± SD; n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: resultat från ett representativt experiment som utvärderar effekten av små molekyler på LATS aktivitet i HEK293AD celler. HEK293AD celler var transfekterade med LATS-BS och behandlas med följande läkemedel: PI3K hämmare (GDC0941), 10 μM för 4 h; VEGFR-hämmare (axitinib), 10 μM för 4 h; 2-deoxyglucose, 25 mM för 1 h; LPA, 10 μM för 1 h; sfingosin-1-phosphophate (S1P), 1 μM för 1 h; 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA), 5 nM för 1 h; VEGFR-hämmare (SU4312), 10 μM i 4 h (medelvärde ± SD; n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan Hippo vägen spelar avgörande roller i olika biologiska processer och dysreglering av Hippo väg leder till cancer6, är hur flodhästen vägen regleras i svar på olika stimuli inte helt klarlagda. Dessutom har man inga kvantitativa och realtid system för att bedöma aktiviteten av Hippo kärnkomponenter. Nyligen har vi utvecklats och validerats en roman biosensor för att mäta LATS Kinas aktivitet i Hippo väg24. Detta biosensor kan användas för kvantitativt och exakt övervakning Hippo signalering verksamhet i levande celler, men också för skärmar av droger inriktning Hippo smittvägen för cancerbehandling. Biosensor-baserad screening kan dessutom leda till upptäckten av nya gener som ansvarar för regleringen av Hippo smittvägen. Med tanke på vikten av Hippo signalering i cancer, skulle hitta avgörande överhörning mellan andra gener och Hippo vägen vara en värdefull studie att genomföra för alla cancer biologer. Därför denna biosensor har potential att göra innovationer i den nuvarande behandlingen av cancer och kan ge en användbar ny terapeutisk strategi för framgångsrik behandling av cancer.
I området i närheten finns det flera viktiga punkter som bör beaktas när du använder LATS-BS. Första vår erfarenhet har LATS-BS störst känslighet när de plasmider som används för transfection extraheras färska från bakterier. För det andra påverkar mängden LATS-BS plasmider transfekterade celler LATS-BS känslighet och signal intensiteten. Beloppet av plasmid DNA kan ökas till 400 ng/fragment för LATS-BS och 600 ng för genen sevärdheter per brunn 12-bra platta. I allmänhet får använder mer plasmid en högre signalintensitet men mindre känslighet. Det tredje kan cell konfluens påverka LATS-BS signal bakgrunden. Konsekvent med Hippo signalering i cellulära svar till konfluens, har vi observerat att celler med högre konfluens har en högre bakgrund LATS-BS signal på grund av aktivering av endogena LATS väletablerad roll. Glest-plated celler visar således en lägre LATS-BS bakgrund signal. Optimal cell konfluens kan väljas beroende på syftet med experimentet (hög konfluens för observation LATS hämning; låg konfluens för observation LATS aktivering). Fjärde Renilla kan användas som intern kontroll för transfection effektivitet, och för hård-till-transfect celler (t.ex., MCF10A), transfection reagens: DNA förhållandet kan ändras till 4:1. Slutligen, vi rekommenderar starkt cotransfecting MST2 som positiv kontroll och YAP-S127A som en negativ kontroll varje gång biosensor används.
Varje verktyg har sina begränsningar. LATS-BS är den artificiella substraten av en endogen protein, som alltid kan konkurrera ut den sanna substraten av proteinet av intresse. Denna effekt är känd som en buffring effekten av biosensor. Förbättra biosensor med högre signalintensitet och lägre nivåer kan bidra till att lösa detta problem. En annan begränsning är att feedback vägar kan komplicera tolkningen av data från LATS-BS. Det finns många linjära och icke-linjära interagerar signalering vägar som sannolikt påverkar LATS-BS signalen. LATS-BS visar bara den kumulativa effekten av ett stimulus på LATS Kinas aktivitet. Det bör dock noteras att denna begränsning inte är unik för LATS-BS men snarare påträffas ofta i studier av molekylär biologi. LATS-BS data bör således tolkas i samband med flera bevisvärde experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidrag från kanadensiska Institutet för hälsa forskning (CIHR #119325, 148629) och den kanadensiska Breast Cancer Foundation (CBCF) till XY. TA stöds av Vanier Kanada Graduate stipendiet och Ontario International Graduate stipendiet. HJJVR stöds av drottning Elizabeth II Graduate stipendium inom vetenskap och teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM with high glucose |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| 5x Passive lysis buffer | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo® Luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 ml kit |
| 20/20 luminometer | Turner Biosystems | 998-2036 | Single tube reader luminometer |
| GloMax®Navigator with dual injectors | Promega | GM2010 | 96-well plates reader luminometer |
References
- Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).
- Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The Hippo Pathway: Immunity and Cancer. Cancers. 10 (4), 94 (2018).
- Maugeri-Saccà, M., De Maria, R. The Hippo pathway in normal development and cancer. Pharmacology & Therapeutics. 186, 60-72 (2018).
- van Rensburg, H. J. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Yeung, B., Yu, J., Yang, X. Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis. International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).
- Zhao, Y., Yang, X. The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance. International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).
- Yu, F. -X., Guan, K. -L. The Hippo pathway: regulators and regulations. Genes & Development. 27 (4), 355-371 (2013).
- Yang, X., Xu, T. Molecular mechanism of size control in development and human diseases. Cell Research. 21 (5), 715 (2011).
- Visser, S., Yang, X. LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis. Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes & Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP. Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).
- Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein. Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).
- Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. Characterization of oligomer formation of amyloid-β peptide using a split-luciferase complementation assay. Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).
- Decock, M., et al. Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing. FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).
- Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1. European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).
- Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
- Pattnaik, P. Surface plasmon resonance. Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).
- Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
- Hu, C. -D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).
- Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).
- Azad, T., et al. A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis. Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).
- Moroishi, T., et al. A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis. Genes & Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).
