Summary
Burada büyük tümör baskılayıcı (Latı) kinaz aktivitesinin ölçmek için bir luciferase tabanlı biyoalgılayıcı mevcut-Merkez kinaz yolu sinyal Hippo içinde. Bu biyoalgılayıcı temel ve translasyonel araştırma Hippo yol regülatörleri vitro ve in vivoaraştıran yönelik çeşitli uygulamalar vardır.
Abstract
Yol sinyal Hippo organ boyutu korunmuş bir Regülatörü ve geliştirme ve kanser biyolojide önemli rolleri vardır. Teknik sorunlar nedeniyle bu sinyal yolu etkinliğini değerlendirmek ve biyolojik bağlamında yorumlamak zor kalır. Büyük tümör baskılayıcı (Latı) varolan edebiyat nitel ve kolayca ölçekli-up can't tarama yöntemlerini kullanır. Son zamanlarda, su aygırı kinaz cascade Latı bir çekirdek bileşenidir kinaz etkinliğini izlemek için bir bioluminescence tabanlı biyoalgılayıcı geliştirdik. Burada, biz nasıl bu Latı biyoalgılayıcı (Latı-BS) su aygırı yol regülatörleri karakterize etmek için kullanılan yordamları açıklar. İlk olarak, biz ayrıntılı bir protokol (Örneğin, VEGFR2) bir overexpressed protein aday etkisini araştıran için Latı-BS kullanarak Latı faaliyete sağlar. O zaman, biz nasıl Latı-BS-ebilmek var olmak kullanılmış için bir küçük ölçekli kinaz inhibitörü ekran göster. Bu protokolü feasibly ölçekli-up şüphesiz Hippo yolun roman düzenleyiciler tanımlayacak daha büyük ekranlar gerçekleştirmek için olabilir.
Introduction
Hippo sinyal yolu ilk hücre büyümesi ve hayvan boyutu1,2yeni bir düzenleyici Drosophila içinde tanımlanmıştır. Onun ilk keşif beri montaj kanıt inandırıcı Hippo yol geliştirme (Örneğin, erken embriyonik gelişme, organ boyut kontrolü ve üç boyutlu [3-b] morfoloji), kritik rol oynar göstermiştir tumorigenesis () Örneğin, tümör gelişimi, metastaz, anjiogenez, bağışıklık kaçırma, genomik istikrarsızlık, stres tepkisi ve ilaç direnci) ve doku homeostasis (Örneğin, kök hücre yenileme ve farklılaşma ve doku rejenerasyonu yaralanma sonra) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. su aygırı sinyal olduğunu sık sık çeşitli kanserlerin7,8,9,10,11,12dysregulated. Bu nedenle, işlevleri ve tedavi ve rejeneratif tıp kanser biyoloji Hippo döngüsünün elucidating sıcak yerlerindendir Biyomedikal araştırma olmuştur.
Buna kısa, ters yönde düzenleyiciler (Örneğin, hücre-hücre iletişim, besin stres ve hücre dışı matriks [ECM]), tarafından etkinleştirme üzerine su aygırı yolu içinde MST1/2 (MST; Drosophila Hippo memeli homologs) (S/T) serin/treonin kinaz fazdan/harekete geçirmek adaptör protein hMOB1 ve WW45, hem de olan, daha sonra transkripsiyon Co aktivatörü YAP ve onun paralog korunmuş HX(H/R/K)XX(S/T) (H, histidin; TAZ fazdan LATS1/2 (Latı) kinaz R, arginin; K, lizin; S, serin; T, treonin; X, herhangi bir amino asitler) motifleri, YAP-S127 ve TAZ-S8911,12de dahil olmak üzere. S127 fosforile YAP (YAP-pS127) ve S89 fosforile TAZ (TAZ-pS89) ubiquitination tarafından bozulmuş veya sitoplazmik protein 14-3-3 bağlama ve TEAD1-4 transkripsiyon faktörleri aşağı transactivate çekirdeği ile etkileşim engellenir genler hücre çoğalması ve Apoptozis (Şekil 1). Hippo yolu büyük ilgi rağmen Hippo sinyal ölçme kaç araç var ve bu da tarihsel olarak YAP/TAZ/TEAD transkripsiyon çıkışı gazetecilere sınırlı olmuştur. Gerçekten de, yakın zamana kadar vardı dinamikleri ve bileşenleri bir nicel, gerçek zamanlı, yüksek üretilen iş ve non-invaziv bir şekilde sinyal Hippo etkinliğini ölçmek için bir araç yoktur vitro ve içinde vivo.
Bizim protein-protein etkileşimleri fizyolojisi ve patoloji rolünün anlaşılmasını ortaya çıkan göz önüne alındığında, bu etkileşimler bir nicel ve gerçek zamanlı bir şekilde13eğitim için kullanılan araçları geliştirilmesi büyük ilgi olduğunu, 14,15,16. Nitekim, Maya iki-hibrid (Y2H)17, yüzey plasmon rezonans (SPR)18ve Förster rezonans enerji transferi (FRET)19 deneyleri de dahil olmak üzere biyo-analitik stratejileri geliştirilmesinde önemli ilerlemeler kaydedilmiştir, protein-protein etkileşimleri değerlendirmek için. Ancak, öyle ki birçok yapıları verimli bir bulmak için test edilmesi gereken bu yaklaşımlardan önemli optimizasyon muhabir yönünün gerektiren sınırlaması taşırlar. Daha fazla, öyle ki gerçek bir olumlu sinyal yüksek beklentileri karşılayan zor olabilir bu yaklaşımlar da nispeten düşük sinyal-gürültü oranı var.
Protein uluslara deneyleri bu sınırlamalarının üstesinden gelir için geliştirilmiştir. Protein uluslara deneyleri ilk nesil üzerinde bölünmüş çok renkli floresan proteinler dayanıyordu ve yukarıda belirtilen sınırlamalar20çözmek değil. Çok renkli floresan proteinler düşük benzeşme ve arka plan gürültü21ile iki ayrı istikrarlı parçalara bölüp önlemek üzere yalnızca bir etki alanı oluşur. Daha sonra ateş böceği luciferase bölünmüş protein uluslara deneyleri gelişmekte olan kullanım için yeni bir aday olarak tespit edilmiştir. Bu yaklaşım, iki parçaları (N-terminal ve C-terminal luciferase [NLuc ve CLuc]) ilgi için bir hedef protein erimiş her parçası ile ateş böceği luciferase ayrılır. İki hedef proteinler arasındaki etkileşimin üzerine yakınlık içine NLuc ve CLuc getirdiysen luciferase etkinliği yeniden düzenlendi ve kollarındaki ışık biyoluminesans substrat ve ATP22huzurunda oluşturulur. 2001 yılında yaparak NLuc ve CLuc parçaları içeren kitaplığı kullanarak bir birleşimsel tarama çeşitli sitelerde kesme ve proteinler için farklı halkalı ile bağlı, Paulmurugan ve Gambhir Stanford Üniversitesi'nde geliştirilen en iyi duruma getirilmiş bir split-ateş böceği protein-protein etkileşimleri23luciferase tamamlayıcı parçası destekli sistem. Bu sistemde, amino asit (aa) NLuc ve CLuc, faiz sekiz glisin kalıntılarının esnek bir bağlayıcı kullanarak iki protein için eklenen forma 398 ve iki serin artıkları ateş böceği luciferase kesilir.
Benzer bir yaklaşım kullanarak, biz son zamanlarda yeni bir Latı BS NLuc 15'e eritme tarafından geliştirilen Latı fosforilasyon sitede S127 çevreleyen YAP, aa (YAP15) ve CLuc ile 14-3-3. Tam uzunlukta YAP protein, YAP (Örneğin, diğer siteler ve ubiquitination fosforilasyon) post-translational modifications tarafından diğer ters yönde düzenleyiciler tarafından sinyalleri semptomlarıdır önlemek için kullanılmadı. Burada sunulan Latı-BS non-invaziv içinde vitro canlı hücreler içinde ve in vivo fareler20,24 (Şekil 2) içinde iki etkinlik sinyal Hippo izleyebilirsiniz. Burada, biz Latı kinaz aktivitesi vitro Latı-BS kullanarak ölçmek için detaylı bir protokol tanımlamak. İlk olarak, Latı-BS overexpressed bir protein Latı etkinliği üzerindeki etkisini araştırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Sonra biyoalgılayıcı Hippo yolu etkinliğini Hippo yolu düzenleyen ajanlarla tedavi sonrasında izlemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu iletişim kuralı tanımlamak ve sinyal yolları veya Latı kinaz aktivitesi düzenleyen uyaranlara karakterize etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. su aygırı Latı-BS kullanarak sinyal sözde bir regülatör incelenmesi
-
Kaplama ve transfection hücre
- Hücre kültürü hazırlanması
- 1 x PBS, % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin ve % 0.25 tripsin-EDTA ile 37 ° C arasında yaklaşık 30 dakika için bir su banyosunda içeren DMEM sıcak.
- İyice bir Biyogüvenlik kabini % 70 etanol ile temizleyin.
- Doku kültürü yemekleri, Pasteur Pipetler, serolojik Pipetler ve pipet ipuçları doku kültürü hood gerektiği gibi yerleştirin.
- 1 x PBS, medya ve tripsin-EDTA su banyosu üzerinden çıkar, % 70 etanol ile temizlemek ve mahallede yer onları.
- Bakım ve transfection için hücre kaplama
- Bir hücre kültürünü deneme için bir yüksek transfection verimlilik ile (Örneğin, HEK293) seçin. Hippo yol bileşenleri bu hücre satırı ifade tarafından Batı leke Hippo sinyal etkin olduğundan emin olmak için denetleyin.
- 10 cm Petri yemeklerinde bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2DMEM HEK293 hücreleri büyümek. Hücreleri mikroskop altında her gün izlemek. Hücrelerin % 80-90 confluency gözlenen aşağıda açıklandığı gibi geçiş.
- Hücreleri 5 mL 1 x PBS de bir tabak ekleme, yavaşça dönen plaka ve medya tamamen aspirating yıkayın.
- Tripsin-EDTA 1 mL plaka ekleyin. Tripsin eşit olarak hücreleri kapsar emin olmak için plaka girdap.
- 5 dk ya kadar tüm hücreleri müstakil bir CO2 kuluçka 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
- Medya (ile % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin) 4 mL ekleyin tripsin nötralize, hücreleri yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından resuspend ve onda biri (0.5 mL) hücrelerinin yeni 100 mm plakalar (için geçen oranı 1:10) içine dağıtmak 9.5 mL içeren Medya tamamlandı.
- Latı-BS transfection için 12-şey plaka transfection önce 24 saat her kuyuya hemasitometre ve plaka 2 x 105 hücreleri kullanarak hücreleri saymak.
Not: daha yüksek hücre sayıları kullanarak faaliyet hücre confluency tarafından düzenlenmiş Hippo sinyal olarak arka plan kollarındaki sinyali artırabilir. Alt hücre sayıları kullanarak transfection reaktifler hücre duyarlılığı artırmak ve hücre ölüm24artırmak.
- Transfection Latı-BS tek başına ya da aday gen ile birlikte
- Miniprep Latı-BS plazmid (NLuc-YAP15-pcDNA3.1-Hygro ve 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro) taze DH5a bakteri sıvı Kültür (optimum Latı-BS ifade elde etmek için gerekli).
- 1 saat önce transfection, plaka ortamından Aspire edin, tam büyüme ortamının 500 µL 12-şey plakaları her şey için eklemek ve hücreleri kuluçka makinesi için dönmek.
Not: Aşağıdaki protokol piyasada bulunan transfection polimer esaslı reaktif kullanarak transfection yöntem açıklanır. Diğer transfection reaktifler da transfection için uygun olabilir; Ancak, biz henüz onları test etmedim. - Çözümler A ve B Tablo 1' de açıklandığı gibi olun. N transfections için yapmak (N + 0.5) çözüm B Premiks x.
- Hemen seyreltilmiş polimer esaslı transfection reaktifi (çözüm B) DNA'yı (a çözüm) ekleyin. Yukarı ve aşağı yavaşça karıştırmak için pipet.
- Örnek transfection kompleksleri formu için izin vermek 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Toplam hacim (76 µL) transfection kompleksleri dropwise her şey yumuşak swirling ile 12-şey plaka ekleyin.
- Hücreleri gecede (18-24 h) 37 ° C'de kuluçkaya
Not: polimer esaslı transfection reaktifler için hassas hücreler için 5 h için kuluçka süresi azaltılabilir. - Transfection, ertesi gün transfection kompleks içeren medyayı çıkarın ve taze tam medya ile değiştirin. Luciferase tahlil gerçekleştirmek başka bir gün için 37 ° C'de hücreler kültür.
- Hücre kültürü hazırlanması
-
Luciferase tahlil
Not: Luciferase muhabir tahlil firefly ve Renilla birlikte bir tahlil algılama sistemi luciferase deneyleri için kullanılır. Renilla bir iç kontrol kullanılan değildi, tek adımlı luciferase tahlil Renilla algılama reaktif eklemeden LARII ekleyerek gerçekleştirin.- Hücre lysates hazırlanması
- Distile su ile 5 x pasif lizis tampon (PLB) aşağıdaki gibi seyreltik:
- 1 hacmi x PLB gerekli = N x (5 x PLB 50 μL) + dH2O 200 μL N x 250 μL 1 = 12-şey plakalar kuyusu başına x PLB (N = örnekleri sayısı).
- Medya tamamen Aspire edin. 1 mL 1 x PBS her kuyunun içine ekleyin. Plakasına yavaşça kaldır müstakil hücreleri ve artık büyüme medya girdap. 1 x PBS tamamen Aspire edin. Hiçbir kalıntı 1 x 1 eklenmesi önce PBS kalır emin olun x PLB.
- 1 250 μL eklemek PLB/iyi x.
- Hücre monolayer 1 tam ve hatta kapsama sağlamak için hafif sallanan ile sallanan bir platform üzerinde kültür tabak koyun x PLB. Rock kültür parçalayıcı hücrelere izin vermek 15 dakika oda sıcaklığında tabaklar.
- Lysate 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
- Kollarındaki sinyal ölçme
- LARII almak (20 μL/örnek)-80 ° c ve oda sıcaklığında equilibrate.
- Renilla algılama reaktif N deneyleri için hazırlamak: Ekle (N + 1) 0.4 μL 50 x x x 19,6 μL onun arabelleği (N + 1) substrat.
- 10 μL her hücrenin 1.5 mL tüpler için lysate predispense.
- Her çift luciferase tahlil için bir 10-s ölçüm döneme göre takip 2-s premeasurement gecikme, gerçekleştirmek için bir luminometer programı.
Not: Birinci ve ikinci ölçümleri Latı-BS sinyal ve Renilla iç kontrol sinyali sırasıyla karşılık. Tek veya çift luciferase ile uyumlu herhangi bir luminometer kullanılabilir. - Dikkatle LARII reaktif 20 μL bir tüpün içine aktarmak ve hızlı bir şekilde karıştırarak için yukarı ve aşağı 3 x pipet.
- Hemen tüp içinde luminometer yerleştirin ve okuma işlemini başlatın.
- Luminometer örnek tüpü çıkarması, hemen Renilla reaktif 20 μL ve yukarı ve aşağı 3 x pipetting karıştırın. Örnek luminometer getirmek ve sonraki okuma işlemini başlatın. Ölçümleri kaydetmek.
- Tepki tüp atmak ve bir sonraki örneğe devam edin.
- Hücre lysates hazırlanması
2. bir ekran tanımlamak Hippo yolu düzenleyiciler kullanarak Latı-BS
-
Hücre kültürü ve transfections
- 1.1 bölümünde açıklandığı gibi kültür HEK293AD hücreleri.
Not: HEK293AD ekranları kullanımı için bir iyi hücre hattı kılan diğer HEK293 hücre hatları daha fazla yapışık. - Hücreleri 1.1.2 bölümünde açıklandığı gibi ayırmak. Saymak ve 100 mm plakalar transfection önce 24 h 2 x 106 hücrelerde plakası.
- 1 saat önce transfection, plaka medyadan Aspire edin ve eski yerine koymak onları ile 5 mL taze tam büyüme ortamının.
- Çözümler A ve B Tablo 2' de açıklandığı gibi olun.
- Hemen seyreltilmiş polimer esaslı transfection reaktifi (çözüm B) DNA'yı (a çözüm) ekleyin. Yukarı ve aşağı pipet karıştırmak için.
- Örnek transfection kompleksleri formu için izin vermek 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Toplam hacim (500 µL) transfection kompleksleri yumuşak swirling hücreler dropwise ekleyin.
- Gecede 37 ° C'de hücreler kuluçkaya
- Ertesi gün, trypsinize ve hücreleri saymak. 1 x 104 2 x 104 hücrelere bir 96-şey tabak medya iyi başına 100 µL toplam hacmi içinde her kuyuya plaka. Başka bir gün için kuluçkaya.
- Ertesi gün, her şey, 1-4 luciferase tahlil yapmadan önce h için 10 µM son bir konsantrasyon Hippo yolu düzenleyen ajanlar/küçük moleküller ekleyin.
Not: en küçük moleküller/maddeleri, için hücre canlılığı 10 µM bir 4 h tedavi etkilemez. Daha düşük bir konsantrasyon kullandıysanız, tedavi daha uzun bir süre için uzatılabilir.
- 1.1 bölümünde açıklandığı gibi kültür HEK293AD hücreleri.
-
Luciferase tahlil
-
Vitro luciferase tahlil
- Hücreleri ortamdan tamamen Aspire edin. 1 x PBS her iyi 100 µL hücrelerle yıkayın. Tamamen Aspire edin.
- 1 20 µL ekleyin (açıklandığı adım 1.2.1.1 olarak hazırlanmış) x PLB 96-şey plakaların her kuyuya.
- Kültür plakaları ile 15 dakika oda sıcaklığında hafif sallanan sallanan bir platform üzerine yerleştirin.
- Dikkatle her kuyuya LARII reaktif 20 µL aktarmak ve karıştırmak için yukarı ve aşağı 3 x pipet.
- Hemen bir plaka okuma luminometer plaka yerleştirin ve okuma işlemini başlatın.
- Canlı hücre luciferase tahlil
- 11 x D-biyoluminesans hisse senedi aşağıdaki gibi yapın: D-biyoluminesans tozu 1 ml normal kültür ortamının 1.5 mg geçiyoruz.
- D-biyoluminesans her şey ve karışımı yavaşça zaten kuyuda olan medya ile 11 x 10 µL aktarın.
- Hücrelerin içine 10 dk da kuluçka yerini alır.
- Plaka luminometer içinde yer ve okuma işlemini başlatın.
Not: sinyal yoğunluğu bu konsantrasyon D-biyoluminesans yeterince güçlü değilse, başka bir 10 µL D-biyoluminesans stokunun hücrelere eklenebilir.
-
Vitro luciferase tahlil
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Latı-BS Latı etkinlik (Şekil 3) üzerindeki etkileri değerlendirmek için farklı genler ile cotransfected. Bu deneyde, Renilla bir iç denetimi olarak kullanıldı. YAP-5SA geçici ifade, YAP, bir bünye etkin form Latı kinaz aktivitesi ile kurulan geribildirim yolu25YAP transkripsiyon hedefleri ve bir sonraki artış düzeyleri artan nedenler. MST, Latı ters yönde harekete geçirmek Hippo yolu (Şekil 1), içinde de biyoalgılayıcı sinyal şiddeti artar. Ancak, PI3K/MAPK sinyal tetikler, VEGFR overexpression Latı engeller ve Latı-BS sinyal yoğunluğu azalır.
İkinci protokolü Latı-BS HEK293AD transfected ve 24 saat transfection sonra hücreleri 96-şey kalıplara geçirildi. 40 h transfection sonra hücreleri su aygırı luciferase tahlil (Şekil 4) tarafından takip sinyali, farklı bilinen küçük molekül düzenleyiciler ile tedavi edildi. VEGFR, PI 3-kinaz ve hücresel enerji seviyesi üç bilinen olumsuz düzenleyiciler Latı kinaz24vardır. Bu deney, GDS0941, bir PI 3-kinaz inhibitörü, axitinib ve SU4312, enerji stres bir glikoz metabolizması ve ATP üretimi inhibisyonu tarafından nedenleri, 2-B glikoz ve VEGFR yavaşlatıcılar Latı-BS etkinleştirmek için kullanılmıştır. Ters, LPA, S1P ve TPA Latı-BS etkisizleştirmek için kullanılmıştır. Bu deney Latı-BS belgili tanımlık harekete geçirmek ve Latı kinaz aktivitesi üzerinde bağlanabilecek küçük bir moleküldür inhibisyon etkisini ölçmek için kullanılabileceğini gösterir.
| Çözüm A | |
| pCDNA3.1-Hygro-NLuc-YAP15 | 1 μL (50 ng) |
| pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc | 1 μL (50 ng) |
| Plazmid bir aday gen (örneğin MST) ifade | 1 μL (400 ng) |
| ya da boş vektör (Örneğin pcDNA3.1-Hygro) | |
| Renilla vektör (pRL-TK) (isteğe bağlı) | 1 μL (20 ng) |
| DMEM (hiçbir serum/antibiyotik) | 34 μL |
| Toplam hacim | 38 μL |
| Çözüm B | |
| Polimer esaslı transfection reaktif | 1,5 μL |
| (Toplam μg DNA ile 3:1 oranı) | |
| DMEM (hiçbir serum/antibiyotik) | 36,5 μL |
| Toplam hacim | 38 μL |
Tablo 1: Protokolü çözümleri A ve B Hippo yolun Latı-BS ile sözde bir regülatör soruşturma için bir polimer esaslı transfection reaktif kullanarak yapmak için.
| Çözüm A | |
| pCDNA3.1-Hygro-NLuc-YAP15 | 10 μL (3 μg) |
| pCDNA3.1-Hygro-14-3-3-CLuc | 10 μL (3 μg) |
| DMEM (hiçbir serum/antibiyotik) | 230 μL |
| Toplam hacim | 250 μL |
| Çözüm B | |
| Polimer esaslı transfection reaktif | 18 μL |
| (Toplam μg DNA ile 3:1 oranı) | |
| DMEM (hiçbir serum/antibiyotik) | 232 μL |
| Toplam hacim | 250 μL |
Tablo 2: Protokolü çözümleri A ve B düzenleyiciler Latı-BS kullanarak Hippo yolu tanımlamak için bir polimer esaslı transfection reaktifi tarama kullanarak yapmak için.
Şekil 1: Hippo yolu memelilerde. Hippo yolu phosphorylating ve YAP ve TAZ inhibe organ boyutunu sınırlar. Hippo yolu etkinleştirildiğinde, SAV, LATS1/2 ve mafya fosforile ve MST1/2 oran ile harekete geçirmek. Aktif LATS1/2 YAP/TAZ korunmuş serin içeren sitelerde phosphorylates. 14-3-3 fosforile YAP/TAZ, böylece onların nükleer yerelleştirme ve aşağı akım gen hedeflerin TEADs ile ortak transactivation inhibe ile etkileşim kurar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Latı-BS split-protein uluslara tahlil dayalı luciferase. Luciferase N ve C terminus etki alanları (NLuc ve CLuc) 15 amino asit çevreleyen YAP-S127 ve 14-3-3, sırasıyla bağlı. YAP15/14-3-3 bağlama Latı fosforilasyon sonra luciferase uluslara ve bioluminescence sinyal emisyon teşvik etmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 3: bir genin etkisi Latı etkinlik değerlendirme temsilcisi bir deneme sonuçları. Biyoalgılayıcı tek başına veya diğer genler Latı kinaz aktivitesi (ortalama ± SD; üzerindeki etkileri araştırmak için HEK293AD hücrelerdeki birlikte ifade edilebilir n = 3, **p < 0,01, ***p < 0.001). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: küçük moleküller etkisi HEK293AD hücrelerdeki Latı etkinlik değerlendirme temsilcisi bir deneme sonuçları. HEK293AD hücreleri ile Latı BS transfected ve aşağıdaki ilaçlar ile tedavi: PI3K inhibitörü (GDC0941), 10 mikron 4 h; VEGFR inhibitörü (axitinib), 4 h için 10 mikron; 2-deoxyglucose, 1 h için 25 mM; LPA, 1 h için 10 mikron; sphingosine-1-phosphophate (S1P), 1 h için 1 mikron; 12-O-tetradecanoylphorbol-13-asetat (TPA), 5 nM 1 h; VEGFR inhibitörü (SU4312), 4 h (ortalama ± SD; 10 mikron n = 3, **p < 0,01, ***p < 0.001). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hippo yolu çeşitli biyolojik süreçleri kritik rol oynar ve kanser6için bozukluk Hippo yolu açar iken, nasıl su aygırı yolu çeşitli uyaranlara yanıt olarak düzenlenmiştir tamamen anlaşılamamıştır. Ayrıca, çekirdek Hippo bileşenleri etkinliğini değerlendirmek için hiçbir nicel ve gerçek zamanlı sistem olmuştur. Son zamanlarda, geliştirilen ve Latı kinaz aktivitesi Hippo yolu24ölçmek için bir roman biyoalgılayıcı doğrulanmış. Bu biyoalgılayıcı değil sadece nicelik ve doğru bir şekilde Hippo etkinliğini oturma hücrelerdeki sinyal izleme için aynı zamanda ekranlar ilaçların kanser tedavisi için su aygırı yolu hedefleme için kullanılabilir. Buna ek olarak, biyoalgılayıcı tabanlı tarama roman genler Hippo yol düzenlenmesi için sorumlu keşfi yol açabilir. Hippo kanserinde sinyal önemi göz önüne alındığında, diğer genler ve su aygırı yolu arasında çok önemli crosstalk bulma tüm kanser biyologlar için üstlenmek için değerli bir çalışma olacaktır. Bu nedenle, bu biyoalgılayıcı geçerli kanser tedavisinde yenilikler yapmak potansiyeline sahiptir ve yeni bir yararlı tedavi stratejisi başarılı kanser tedavisi sağlayabilir.
Latı-BS kullanırken düşünülmesi gereken birkaç önemli nokta vardır. İlk olarak, transfection için kullanılan plazmid bakterilerden taze ayıklandığında deneyim, Latı-BS en büyük duyarlılığa sahiptir. İkinci olarak, hücre içine transfected Latı-BS plazmid miktarı Latı-BS duyarlılık ve sinyal şiddeti etkiler. Latı-BS için 400 ng/parçası ve 600 plazmid DNA miktarı artırılabilir ng gene iyi bir 12-şey plaka başına ilgi için. Genel olarak, daha fazla plazmid kullanarak daha yüksek bir sinyal yoğunluğu daha az hassasiyet ama verecektir. Üçüncü olarak, hücre confluency Latı-BS sinyal arka plan etkileyebilir. Sinyal confluency, hücresel yanıt, hücreleri daha yüksek confluency ile endojen Latı aktivasyonu nedeniyle daha yüksek bir arka plan Latı-BS sinyal var gözlemledim Hippo köklü rolü ile tutarlı. Buna göre bir alt Latı-BS arka plan sinyal seyrek kaplama olan hücreleri gösterir. En iyi cep confluency deney (Latı inhibisyon; confluency Latı harekete geçirmek gözlemlemek için düşük gözlemlemek için yüksek confluency) amacına bağlı olarak seçilebilir. Dördüncü olarak, Renilla bir iç kontrol transfection verimlilik için kullanılabilir ve zor transfect hücreler için (Örneğin, MCF10A), transfection reaktif: DNA oranı 4:1 olarak değiştirilebilir. Son olarak, pozitif kontrol olarak cotransfecting MST2 ve YAP-S127A bir negatif kontrol olarak biyoalgılayıcı her kullanılışında öneririz.
Her aracın kendi sınırlamaları vardır. Latı-BS yapay substrat her zaman ilgi proteinin gerçek substrat kul endojen bir protein var. Bu etki biyoalgılayıcı bir arabelleğe alma etkisi bilinir. Biyoalgılayıcı daha yüksek sinyal şiddeti ve alt ifade düzeyleri ile iyileştirilmesi bu sorunun üstesinden gelmek için yardımcı olabilir. Geribildirim yolları Latı-BS verilerden yorumlanması karmaşık hale başka bir kısıtlamadır. Doğrusal ve doğrusal olmayan birçok etkileşim büyük olasılıkla etkisi Latı-BS sinyal yolları sinyal vardır. Latı-BS sadece bir uyarıcı kümülatif etkisi Latı kinaz aktivitesi olarak gösterir. Bu, ancak, bu sınırlama Latı-BS için benzersiz değil ama oldukça yaygın olarak moleküler biyoloji çalışmalarda karşılaşılan olması gerekmektedir. Böylece, Latı-BS veri birden çok kanıt deneyler bağlamında yorumlanmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser hibe--dan Kanada Enstitüsü Sağlık Araştırma (CIHR #119325, 148629) tarafından desteklenen ve XY için Kanada meme kanseri Vakfı (CBCF). TA Vanier Kanada Yüksek Lisans Burs ve Ontario Uluslararası Yüksek Lisans Bursu tarafından desteklenir. HJJVR Kraliçe Elizabeth II yüksek lisans burs bilimi ve teknolojisi tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM with high glucose |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| 5x Passive lysis buffer | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo® Luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 ml kit |
| 20/20 luminometer | Turner Biosystems | 998-2036 | Single tube reader luminometer |
| GloMax®Navigator with dual injectors | Promega | GM2010 | 96-well plates reader luminometer |
References
- Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).
- Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The Hippo Pathway: Immunity and Cancer. Cancers. 10 (4), 94 (2018).
- Maugeri-Saccà, M., De Maria, R. The Hippo pathway in normal development and cancer. Pharmacology & Therapeutics. 186, 60-72 (2018).
- van Rensburg, H. J. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Yeung, B., Yu, J., Yang, X. Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis. International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).
- Zhao, Y., Yang, X. The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance. International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).
- Yu, F. -X., Guan, K. -L. The Hippo pathway: regulators and regulations. Genes & Development. 27 (4), 355-371 (2013).
- Yang, X., Xu, T. Molecular mechanism of size control in development and human diseases. Cell Research. 21 (5), 715 (2011).
- Visser, S., Yang, X. LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis. Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes & Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP. Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).
- Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein. Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).
- Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. Characterization of oligomer formation of amyloid-β peptide using a split-luciferase complementation assay. Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).
- Decock, M., et al. Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing. FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).
- Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1. European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).
- Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
- Pattnaik, P. Surface plasmon resonance. Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).
- Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
- Hu, C. -D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).
- Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).
- Azad, T., et al. A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis. Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).
- Moroishi, T., et al. A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis. Genes & Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).
