Summary
Denne protokol beskriver brugen af plastik chips til kultur og inddeler primære murine neuroner. Disse chips er hovedmeningen, brugervenlig og kompatibel med høj opløsning, lever, og fluorescens billeddannelse. Denne protokol beskriver, hvordan plade rotte hippocampus neuroner i disse chips og udføre fluidic isolering, axotomy og immunfarvning.
Abstract
Microfabricated metoder til at inddeler neuroner er blevet afgørende værktøjer for mange neuroforskere. Denne protokol beskriver brugen af et kommercielt tilgængelige formonteret plast chip til compartmentalizing kulturperler primære rotte hippocampus neuroner. Disse plastik chips, indeholdt i fodaftryk af et standard objektglas, er forenelig med høj opløsning, lever, og fluorescens billeddannelse. Denne protokol demonstrerer, hvordan retrograd etiket neuroner via isolerede axoner ved hjælp af en modificeret rabiesvirus kodning en fluorescerende proteiner, oprette isolerede microenvironments i et rum og udføre axotomy og immuncytokemi på chip. Neuroner er kulturperler > 3 uger inden for de plastik chips, illustrerer foreneligheden af disse chips for langsigtet neuronal kulturer.
Introduction
Traditionelle neuron kultur metoder resulterer i tilfældige udvækst af axoner og dendrites, som forhindrer studiet af neuroner i deres enestående polariserede morfologi. Microfabricated multicompartment enheder er blevet veletableret og godt brugt forskningsværktøjer til neuroforskere i de sidste 10-15 år (udvalgte high-profil publikationer er der refereres til1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). disse enheder inddeler neuroner og levere en metode for at fysisk og kemisk manipulere subcellulært regioner af neuroner, herunder somata, dendritter, axoner og synapser18,19. De giver også flere eksperimentelle paradigmer, som ikke er muligt ved hjælp af tilfældige kulturer, herunder studier af cytoskeletale transport, cytoskeletale proteinsyntesen, skade eller regenerering af axon, og axon til soma signalering. Den grundlæggende konfiguration af 2-rum består af to parallelle mikrofluid kanaler adskilt af en række mindre vinkelret på microgrooves. Primære eller stamcelle-afledt neuroner er belagt i en af mikrofluid kanalerne, bosætte sig og vedhæfte til bunden overfladen af enheden og udvide neurites i løbet af dage. Mange vækst kegler finder vej til microgrooves, som er små nok, at de forhindrer celle organer fra indtastning. Fordi vækst kegler er fysisk begrænset og ikke kan dreje rundt inden for microgrooves, vokser de lige ind i det tilstødende rum (cytoskeletale rum) hvor de er isoleret.
Historisk set har er disse enheder har været støbt ved hjælp af poly(dimethylsiloxane) (PDMS) fra en photolithographically mønstrede master mold og enten lavet in-house i efterforskernes laboratorier eller købt kommercielt. En af de vigtigste ulemper ved hjælp af PDMS er dens hydrophobicity20. PDMS kan gøres hydrofile midlertidigt, men derefter bliver hurtigt hydrofobe inden for timer i en ikke-vandige miljø20. På grund af dette, skal enhederne knyttes til et glas coverslip eller andre passende underlag på tidspunktet for brug. Formonterede plast multicompartment chips er nu kommercielt tilgængelige (f.eks.XonaChips) i sprøjtestøbte plast. Disse chips er lavet permanent hydrofile, forenkle enhed fugtning og tillader før samling af chip med en tynd film af cykliske olefin copolymer (COC) omslutter mikrofluid kanalerne på bunden. Disse chips er fremstillet i en optisk gennemsigtig plast egnet til høj opløsning fluorescens billeddannelse.
Formålet med denne protokol er at demonstrere brugen af formonterede plast mikrofluid chips til flere eksperimentelle paradigmer udføres ved hjælp af murine hippocampus eller kortikale neuroner. Denne protokol beskriver, hvordan retrograd etiket neuroner ved hjælp af en modificeret rabiesvirus i chippen. Axotomy for undersøgelser af axon skade og regenerering er også beskrevet. Endelig viser denne protokol sådan udføre fluorescens immunfarvning med enheden.
Protocol
Bemærk: En skematisk af plast multicompartment chippen er vist i figur 1A, B. Chippen er på størrelse med en standard objektglas (75 mm × 25 mm). Funktioner af chip, herunder vigtigste kanaler eller rum, brønde og microgrooves er mærket og leveres til fremtidig reference. Figur 1 c er et fotografi af chippen demonstrerer fluidic isolation af rum.
1. forberedelse og overfladebehandling af Multicompartment Chips
- I et bio-sikkerhed kabinet, Placer chippen i en petriskål eller andre passende steril beholder.
- Tilsæt 100 µL af pre belægning løsning til øverste venstre godt chip og lad det flyde gennem den vigtigste kanal ind i den tilstødende godt.
Bemærk: Før belægning løsning bruges til at pre pels mikrofluid kanaler for at fjerne mulighederne for fældefangst luftbobler i chippen. - Udfyld nederst venstre godt med 100 µL af pre belægning løsning. Vent 5 min. til at tillade løsning til at flyde gennem microgrooves.
- Tilsæt 100 µL af pre belægning løsning til øvre lige godt og lad det flyde gennem den vigtigste kanal ind i den tilstødende godt. Fyld den lavere ret godt med 100 µL af pre belægning løsning.
- Opsug løsningen fra hver brønd. Opsug fra de vigtigste kanaler for at undgå at fjerne væske fra de vigtigste kanaler (figur 2A). Straks tilføje 150 µL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til øverste venstre godt. Vente 1,5 min.
Forsigtig: Ikke Aspirér alle væske fra de lukkede hovedkanaler. - Tilføj 150 µL PBS til nederste venstre godt. Vent 5 min. for at tillade væsker at strømme gennem microgrooves. Tilføj 150 µL PBS til øvre lige godt. Tilføj 150 µL PBS til at sænke lige godt. Vente 10 min.
- Gentag trin 1,5-1,6 for en anden PBS vask.
- Kontrollere chip under en vævskultur mikroskop for bobler i de vigtigste kanaler. Hvis bobler er til stede, udføre procedurerne nedenfor. Hvis ingen bobler er til stede, springe til trin 1.9.
- Opsug PBS fra brøndene lystfiskeri afpipetteres tip fra kanalen åbning (figur 2A).
- Der afpipetteres 100 µL af pre belægning løsning i den øverste brønd, Lystfiskeri spidsen af afpipetteres nær kanalen åbning (figur 2B). Boblerne bør flytte gennem kanalen i den nederste brønd. Vente 1,5 min.
- Gentag trin 1.3-1.8.
- Opsug PBS fra brøndene lystfiskeri afpipetteres tip fra kanalen åbning (figur 2A).
- Tilføje 100 µL af 0,5 mg/mL poly d-lysin (PDL) til øverste venstre godt af chippen. Vente 1,5 min. Fyld nederst venstre godt med 100 µL af PDL.
- Tilføje 100 µL af PDL til den øverste højre godt af chippen. Vente 1,5 min. tilsættes 100 µL til den lavere ret godt.
- Luk petriskålen og placerer chippen i en inkubator ved 37 ° C i 1 time.
- Gentag PBS vask trin 1,5-1,6 to gange for at fjerne overskydende PDL.
- Opsug PBS fra enheden.
- Straks tilføje 100 µL af celle kultur medier til øverste venstre godt af chippen. Vente 1,5 min. Tilføj medier til nederste venstre godt. Tilføj medier til øvre lige godt. Vente 1,5 min. tilsættes 100 µL medium til den lavere ret godt af chippen.
- Placer chippen i 37° C inkubator indtil klar til plade celler.
2. såning neuroner i de Multicompartment Chips
- Forberede cellesuspension af dissocierede rotte hippocampus neuroner ifølge etablerede protokoller21,22 til at give en massefylde på ~ 12 × 106 celler/mL.
Bemærk: Brug af celle suspension tætheder mellem 3 og 12 × 106 celler/mL er muligt. Benyttes en lavere massefylde, kan mængden af cellesuspension tilføjes til chippen forhøjes (se nedenfor). Nedenstående fremgangsmåde er gældende for murine dissocierede kortikale eller hippocampus neuroner. Optimal celle tætheder for andre neuron typer kan variere. - Fjerne fleste af medierne i hvert hul i chippen, forlader ca 5 µL i hver brønd. Opsug fra de vigtigste kanaler for at undgå at fjerne væske fra de vigtigste kanaler (figur 2A).
Forsigtig: Ikke Aspirér væske fra de lukkede hovedkanaler. Luftbobler kan blive fanget i chippen, hvis væsken er indsugning fra de vigtigste kanaler. - Indlæse 5 µL af cellesuspension i øvre lige godt og en anden 5 µL af cellesuspension i den lavere ret godt (~ 120.000 celler i alt). Indlæse cellerne ved dispensering tæt på den vigtigste kanal (figur 2B). Se under et mikroskop for at sikre, at neuroner i den vigtigste kanal. Vente på 5 min at tillade cellerne til at vedhæfte.
Bemærk: Neuroner kan indlæses i begge rum. Til forklaring formål, det somatiske rum er den vigtigste kanal på højre side, men enten rum kan bruges som den somatiske rum. Brug af lavere celle tætheder ned til 60.000 celler pr. chip er muligt. Op til 10 µL af celle suspension kan tilføjes til hver godt af den somatiske rum i kombination med en cellesuspension med færre celler end beskrevet ovenfor. - Tilføje ca 150 µL af neuronal dyrkningsmedier til hver af de øverste og nederste højre brønde, og derefter Tilføj 150 µL af medier til hver af de øverste og nederste venstre brønde. Placer chippen i befugtet bakke i en 5% CO2 37 ° C inkubator.
- Efter 24 timer, skal du udføre en media ændring ved at fjerne medier fra brøndene. At sikre den vigtigste kanal forbliver fyldt. Tilsæt 150 µL af medier til hver top brønd, og derefter udfylde de nederste brønde.
- Placer chippen tilbage i inkubatoren for det ønskede antal dage.
Bemærk: Overvåge medierne hver par dage for at sikre det forbliver lys pink. Hvis medierne er gullige, erstatte 50% af det med friske medier. Hvis væske er lavt, Sørg for der er tilstrækkelig luftfugtighed og passende sekundære indeslutning af chips til at forhindre fordampning. Minimere eller endog fjerne medieændringer er muligt ved hjælp af sekundære indeslutning og/eller dækker skålen som indeholder chip med polytetrafluorethylen (PTFE)-FEP film.
3. retrograd mærkning af neuroner i chippen
Bemærk: Retrograd mærkning kan udføres ved hjælp af flere teknikker, herunder ved hjælp af modificerede kolera toksin og rabies virus. Nedenfor er vejledning for mærkning neuroner med G-slettet Rabies-mCherry eller -eGFP virus. Håndtere potentielt infektiøse materialer ifølge den lokale organisation retningslinjer. Yderligere træning kan være påkrævet.
- Varm frisk neuronal dyrkningsmedier til 37 ° C. Anslå ~ 400 µL af medier pr. chip.
- Fortyndet 100.000 viral enheder af modificerede rabiesvirus i alt 50 µL ved hjælp af media taget fra enten godt af den cytoskeletale rum.
Bemærk: Bortskaffe tips og rør i kontakt med virus efter organisation-godkendte protokol. - Forsigtigt pipette de resterende medier fra brøndene cytoskeletale rum og butik i en centrifuge rør ved 37 ° C.
- Tilføj 150 µL af frisk varm medier og de 50 µL fortyndet virus at den cytoskeletale rum. Der inkuberes i 2 timer ved 37 ° C inkubator.
- Fjerne medier indeholdende virus og bortskaffe det korrekt.
Bemærk: Luftbobler kan blive fanget i chippen, hvis væsken er indsugning fra de vigtigste kanaler. - Forsigtigt tilføje 75 µL af friske medier til ét axon godt og lad det flyde til andre axon godt.
- Fjern gennemstrømnings-fra den anden axon godt og bortskaffes korrekt.
- Gentag trin 3.6 og 3.7 én gang.
- Tilføje tilbage lagrede medier til den cytoskeletale rum. Tilføje ca 50 µL friske medier, hvis nødvendigt for at opretholde passende volumen og returnere cellerne til rugemaskine.
Bemærk: Fluorescerende proteiner udtryk er synlige ved 48 h og fortsætter i op til 8 dage. Neuroner kan være afbildet i op til 30 min ved stuetemperatur i neuronal dyrkningsmedier. Kultur medier kan også udskiftes med varmede CO2-uafhængige dvale E med B27 og afbildet længere. Neuroner kan også være afbildet i et godt befugtet miljømæssige kammer ved 37 ° C og 5% CO2. I dette tilfælde er befugtning kritisk for at minimere fordampning underskud inden for chipsene, som forværres ved opvarmning og kan kompromittere neuron sundhed.
4. fluidic Isolation af cytoskeletale rum inden for chippen
- Fjerne 20 µL fra nederst venstre godt af cytoskeletale rum og sted i øverste højre brønden af somatiske rum. Vente 2 min til flow inden for hver kanal til Reagensglasset.
- Fjerne 50 µL af medier fra den cytoskeletale rum. Tilføje 0,3 µL af 1 mM Alexa Fluor 488 maleinhydrazid til dette medie, mix via pipette og vende tilbage til den cytoskeletale rum. Chippen er klar til billedbehandling.
Bemærk: Andre forbindelser af interesse kan tilføjes. Tilføje et fluorescerende farvestof med en lignende molekylvægt som sammensat af interesse er anbefalet for at overvåge fluidic isolation over tid.
5. udførelse af Axotomy inden for chippen
- Fjerne medier fra den cytoskeletale rum at holde afpipetteres tip fra indgangen til den vigtigste kanal (figur 2A) og gemme det i et centrifugeglas.
- Opsug den cytoskeletale rum helt, placere aspiration afpipetteres i nærheden enten indgangen til den vigtigste kanal for den cytoskeletale rum (figur 2B). Fortsætte aspiration til 1-2 min. Sørg for, at løsningen er fjernet helt fra rummet.
Bemærk: Det vakuum pres for aspiration skal være mindst 18 tommer-Hg axotomy procedure kan fungere korrekt. - Erstatte den cytoskeletale rum med den lagrede medier og bekræfte at axoner er afbrudt ved at kigge på chip under et mikroskop.
Bemærk: Hvis bobler danner i den cytoskeletale rum, når du udskifter medier, Gentag trin 5.1-5.2. - Returnere chip til rugemaskine.
6. fluorescens immunfarvning inden for chippen
- Forbered 4% formaldehyd fiksering løsning i PBS (4% formaldehyd, 1 µM MgCl2, 0,1 µm CaCl2, 120 mM saccharose)
- Fjerne de fleste af medierne i wells af chippen (tør ikke indvendige rum).
- Straks tilføje 100 µL af fiksering løsning til de øverste wells af de cytoskeletale og somatiske rum.
- Efter 1 min, tilføje 100 µL af fiksering løsning til bunden brønde. Fix for 30 min ved stuetemperatur.
- Fjerne de fleste af løsningen fra brøndene chip (tør ikke indvendige rum). Straks tilføje 150 µL af PBS til hver af de øverste wells af de cytoskeletale og somatiske rum. Vente 2 min til PBS til at flyde ind i de nederste brønde.
- Gentag trin 6.5 to gange.
- Fjerne de fleste af PBS fra wells af chippen. Straks tilføje 150 µL af PBS med 0,25% TritonX-100 til hver af de øverste brønde cytoskeletale og somatiske rum. Vent i 15 min.
- Fjerne det meste af væsken fra brøndene chip og straks tilføje 150 µL blokerende opløsning (10% normal ged serum i PBS) til hver af de øverste wells af de cytoskeletale og somatiske rum. Vent i 15 min.
Bemærk: Effektiv blokering løsninger bør være specifikke for den sekundære antistof, fxfor et æsel anti-får sekundær antistof, bruge æsel serum i den blokerende løsning. - Fjerne det meste af væsken fra brøndene chip og straks tilføje 100 µL af primære antistof (eller antistoffer) i 1% normal ged serum i PBS til hver af de øverste wells af de cytoskeletale og somatiske rum. Dække for at minimere fordampning og vente 1 time ved stuetemperatur eller 4 ° C natten over.
- Fjerne de fleste af løsningen fra brøndene chip (tør ikke indvendige rum). Straks tilføje 150 µL af PBS til hver af de øverste wells af de cytoskeletale og somatiske rum. Vent 5 min. til PBS til at flyde ind i de nederste brønde.
- Gentag trin 6.10 to gange.
- Fjerne det meste af væsken fra brøndene chip og straks tilføje 100 µL af sekundær antistof (eller antistoffer) i PBS til hver af de øverste wells af de cytoskeletale og somatiske rum. Dække for at minimere fordampning og vente 1 time ved stuetemperatur.
Bemærk: Henvise til producentens anvisninger for den anbefalede fortynding af sekundært antistoffer. - Gentag trin 6.10-6.11.
- Hvis imaging inden for 1 dag af immunfarvning, holde chip fyldt med PBS. Hvis chip vil blive gemt længere end 1 dag før imaging, wrap fadet indeholdende chip paraffin film til at forhindre fordampning og opbevares ved 4 ° C indtil klar til afbildning.
- For længere opbevaring af prøver, kan montering medier (f.eks.Fluoromount-G) bruges.
- Fjerne det meste af væsken fra brøndene af chippen. Brug en engangs plast afpipetteres 1 mL til tilsættes 2 dråber montering medier til hver af de øverste brønde cytoskeletale og somatiske rum.
- Vippe chip for at fremme strømmen af montering medier gennem kanalerne. Efter 5 min. tilsættes 2 dråber bunden brønde. Vente 1 time før billeddannelse.
Bemærk: Efter montage medier det vil ikke være muligt at re probe for andre mål.
Representative Results
Efter ca. 5-7 dage af neuron vækst inden for chippen er cytoskeletale vækst indlysende. Chips er kompatibel med fasekontrast imaging som vist i figur 3, der viser neuronal vækst på 24 dage. Chips er også kompatibel med fluorescens imaging (figur 4, figur 5, figur 6og figur 7). Tre dage efter rabies virusinfektion via den cytoskeletale rum, blev mCherry-positive neuroner med axoner udvide i den cytoskeletale rum afbildet i chip (figur 4). For at demonstrere evnen til at fluidically isolere rum, blev en lav molekylevægt fluorescerende farvestof (Alexa Fluor 488 maleinhydrazid) føjet til den cytoskeletale rum. Disse resultater er sammenlignelige med PDMS-baserede afdeling17 og demonstrere egnetheden af plast-chip fase-kontrast og fluorescens billeddannelse.
For at illustrere neuronal vækst med plastik chips og PDMS enheder, vi kulturperler neuroner i begge platforme og overvåges neuronal vækst over tid. Figur 5 viser neuronal vækst fra 3 til 22 dage i kultur; disse resultater er repræsentant for 3 uafhængige forsøg. Neuronal vækst er sammenlignelige i de to platforme op til 15 dage i kultur, men på længere kultur aldre (> 21 dage) isolerede axoner inden for plast-chip vises sundere med mindre Perlebesat (figur 5A). Yderligere visualisere axoner i de cytoskeletale rum, vi immunostained for β-tubulin III, som viser sund cytoskeletale vækst inden for plastik chips på 22 dage i kultur (figur 5B).
Axon skade og regenerering undersøgelser er fælles hjælp mikrofluid opdelte enheder. For at vise egnethed af disse undersøgelser ved hjælp af chips, retrograd mærket neuroner blev afbildet før og 24 timer efter axotomy (figur 6). En retraktion pære og regenererende axon er både indlysende følgende axotomy. Disse resultater er svarende til offentliggjorte data ved hjælp af PDMS-baserede enheder14,17.
Immuncytokemi er en almindelig teknik udført inden for multi rum enheder til at visualisere protein lokalisering. Efter 24 dage i kultur, neuroner i chipsene var fast og farves til både excitatoriske og hæmmende synaptic markører, vGlut1 og vGat, henholdsvis (figur 7). Retrograd mærket mCherry neuroner var også afbildet (figur 7C). Imaging blev udført ved hjælp af spinning disk Konfokal med en 60 × silikone oliebestandighedsobjektet, demonstrere evne til at udføre høj opløsning billeddannelse. Vigtigere, var dendritiske pigge tydelige i et forstørret område, demonstrerer, at neuroner kulturperler inden for chips danner modne synapser.
Figur 1 : En pre-samlet, plast to-rum mikrofluid chip til compartmentalizing neuroner. (A) skematisk repræsentation af multicompartment chippen viser placeringen af de øvre og nedre brønde. (B) en udvidet skematisk chip viser de vigtigste kanaler (eller segmenter) og microgrooves, som forbinder rum. De vigtigste kanaler er ca 1,5 mm × 7 × 0.060 mm (W × L × H). Bredden og højden af microgrooves er cirka 0,01 mm × 0,005 mm henholdsvis. Længden af microgrooves varierer afhængigt af konfiguration, 0,15 mm til 0,9 mm. (C) A fotografi af et repræsentativt multicompartment chip som indeholder frugtfarve farvestof i hvert vigtigste kanal eller rum demonstrere evne til at fluidically isolere hver kanal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Pipettering teknik ved brug af plast multicompartment chips. (A) når tilføjelse og sugning medier for vasker, afpipetteres tip bør vinkles væk fra indgangen til den vigtigste kanal, som vist. (B) når lastning neuroner eller udfører axotomy, afpipetteres tip bør være vinklet mod indgangen til den vigtigste kanal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : En fase kontrast Mikrograf viser typiske neuronal vækst inden for chippen på 24 dage i kultur. Embryonale hippocampus neuroner var seedede i den højre somatiske rum. Axon vækst er synlige i den cytoskeletale rum begyndelsen på 5-7 dage. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Retrograd mærket neuroner express mCherry fluorescerende proteiner og udvide axoner til en fluidically isoleret cytoskeletale rum. (A) en flettede fluorescens Mikrograf viser live retrograd mærket neuroner inficeret via en modificeret mCherry rabiesvirus kort anvendes til den cytoskeletale rum. Neuroner blev afbildet 3 dage efter infektionen på 21 dage i kultur. At skabe et isoleret mikromiljø inden for den cytoskeletale rum er påvist ved anvendelse af en lav molekylevægt farvestof, Alexa Fluor 488 maleinhydrazid. (B) en flettede billede af (A), herunder en differential interferens kontrast (DIC) billede for at visualisere microgrooves region af chippen. Billeder blev erhvervet med laser scanning Konfokal mikroskop ved hjælp af en 30 × / 1,05 N.A. silikone olie (ne = 1.406) mål linse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Side-by-side sammenligning af neuronal vækst inden for multicompartment PDMS enheder og plastik chips. (A) fase kontrast micrographs af begge platforme, taget på 3, 7, 15 og 22 dage i kultur. Nederst er en højere forstørrelse region taget fra billeder på 22 dage medtaget for at illustrere cytoskeletale vækst i denne alder inden for begge platforme. Axoner i chippen er mere vedvarende og vises sundere end i PDMS enhed i denne alder. (B) en Inverter immunofluorescens Mikrograf af β-tubulin III farves axoner i den cytoskeletale rum både PDMS enhed og plast chip på 22 dage i kultur. Billeder blev erhvervet med en roterende disk Konfokal imaging system ved hjælp af en 20 x / 0,45 N.A. mål linse. Alle skala barer er 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Axotomy og regenerering af hippocampus neuroner i den plast multicompartment chip. (Top) Neuroner blev retrograd mærket ved hjælp af en modificeret mCherry rabiesvirus og derefter afbildet før axotomy på 24 dage i kultur. Billeder blev pseudocolored ved hjælp af 'Brand' farve look-up table. (Nederst) Den samme neuron afbildet i toppanelet var afbildet 24 h post-axotomy. Hvide stiplede linjer Vis kanter af microgroove barrieren. Axotomy opstod på placeringen af den venstre stiplet linje. Hvid pilespidsen viser en retraktion pære. Den hvide pil angiver en regenererende axon. Billeder blev erhvervet med en roterende disk Konfokal imaging system ved hjælp af en 20 × / 0,45 N.A. mål linse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Synapser form mellem hippocampus neuroner kulturperler inden for plast multicompartment chips. Immunfarvning blev udført på 24 dage i kultur og afbildet i den somatiske rum ved hjælp af en 60 × silikone olie fordybelse linse. Neuroner express (A) excitatoriske synapse markør, vGlut1 (grøn) og (B) hæmmende synapser markør, vGAT (blå). (C) retrograd mærket mCherry neuroner (rød) blev inficeret via modificerede rabiesvirus påføres den cytoskeletale rum. (D) en flettede fluorescens Mikrograf af vGlut1, vGat og mCherry. (E) den forstørrede region i (D) er angivet med en hvid boks viser dendritiske pigge, de websteder, der modtager synaptic input fra andre neuroner. Billeder blev erhvervet med en roterende disk Konfokal imaging system ved hjælp af en 60 × / 1.3 N.A. silikone olie (ne = 1.406) mål linse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Plast multicompartment chips | PDMS multicompartment enheder |
| isolere axoner | isolere axoner |
| oprette microenvironments | oprette microenvironments |
| axotomize neuroner | axotomize neuroner |
| optisk gennemsigtig | optisk gennemsigtig |
| kompatibel med høj opløsning imaging | kompatibel med høj opløsning imaging |
| kompatibel med Fluorescens mikroskopi | kompatibel med Fluorescens mikroskopi |
| fuldt samlet | assembly til substrat kræves |
| sund axoner > 21 dage | sund axoner > 14 dage |
| hydrofile dyrkningsbaserede overflade | hydrofobe |
| gas vandtætte | gas-gennemtrængelige |
| afrundede microgrooves og kanaler | lige microgrooves |
| færre præparationstrin | toppen er aftageligt for farvning inden for microgrooves |
| ikke kompatibel med laser ablation | absorption af små molekyler & organiske opløsningsmidler |
| ikke kompatibel med mineralsk olie-baserede fordybelse olier (silikone-baserede olier er fint) |
Tabel 1: Sammenligning af plast og PDMS multicompartment platforme for dyrkning neuroner.
Discussion
Plast multicompartment chips giver en nem-at-bruge mulighed for compartmentalizing neuroner, give langsigtet neuronal kulturer (> 3 uger). Denne protokol detaljer om, hvordan kultur kortikale og hippocampus murine neuroner i disse chips. Oprettelsen af opløselige microenvironments og hvordan retrograd etiket neuroner, udføre axotomy og udføre immuncytokemi blev også drøftet. Vigtigere, disse chips er kompatibel med høj opløsning, fluorescens og levende billedbehandling.
Plast multicompartment chips giver mange af de samme funktioner som de PDMS-baserede opdelte enheder, men har fordele, ulemper og nogle kendetegn. Tabel 1 indeholder en funktion sammenligning af både plast chip og PDMS-baserede enheder. Først og fremmest chips er pre samlet og gjort permanent hydrofile, som letter befugtning, hvilket gør dem nemmere at bruge. Plasten er ikke gas-gennemtrængelige, i modsætning til PDMS, så hvis bobler udgør uventet i kanalerne, de ikke let slippe og skal fjernes. En pre belægning løsning indeholdende hovedsagelig ethanol og nogle andre proprietære agenter eliminerer boble dannelse.
Live imaging af fremskrivninger følgende transduktion af fluorescerende proteiner blev udført inden for chips (figur 4) og der var ingen påviselig autofluorescence af plast. En advarsel er, at fordybelse olier anvendes med chip til høj numerisk blænde mål skal være silikone olie baseret, og ikke mineralsk olie baseret. Mineralsk olie kan forårsage en negativ reaktion med cyklisk olefin copolymer. For brightfield billeddannelse, er det vigtigt at bemærke, at microgrooves i chippen er afrundet i enderne, og der er en gradvis smallere i z-retning af de vigtigste kanaler mod den microgroove barriere forårsager nogle lys brydning i begge ender af den microgrooves under brightfield imaging (figur 3). Fordi chippen er pre-samlet, antistof indtrængen i den micron mellemstore microgrooves kan være ujævn (som med permanent agglomererede PDMS-baserede enheder); kvantitativ analyse efter immunfarvning skal således udføres i kanaler/rum. Immunfarvning af neuronal fremskrivninger i microgrooves kan forbedres ved at oprette en diskenhed forskellen mellem rum til støtte for strømmen af antistoffer og fluorophores i microgrooves.
Disclosures
A.M.T. er en opfinder af mikrofluid kammer/chip (os 7419822 B2) og er medlem af Xona Microfluidics, LLC. V.P. er ansat af Xona Microfluidics, LLC. J.H. er medlem af Xona Microfluidics, LLC. T.N. erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser. Åben adgang til offentliggørelsen af denne artikel er sponsoreret af Xona Microfluidics.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender tekniske eller redaktionelle bistand fra Taylor Wilt (Xona), Smita Paranjape (UNC-Chapel Hill), Joyce Ciechanowski (Xona) og Brad Taylor (Xona). Forfatterne anerkender støtte fra Xona Microfluidics, LLC og National Institute of Mental Health (R42 MH097377). Imaging blev delvist støttet af Confocal og Multiphoton Imaging Core facilitet af NINDS Center Grant P30 NS045892 og NICHD Center Grant (U54 HD079124). Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
| Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
| Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
| XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
| XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
| E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
| neuronal culture media: | |||
| - Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
| -B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
| -GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| -Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
| fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
| modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
| Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
| Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
| Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
| hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
| PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
| normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
| triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
| anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
| anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
| anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
| Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
| Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
| Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
| Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
| Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |
References
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Virlogeux, A., et al. Reconstituting Corticostriatal Network on-a-Chip Reveals the Contribution of the Presynaptic Compartment to Huntington's Disease. Cell Reports. 22 (1), 110-122 (2018).
- Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell Reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).
- Yang, Y., et al. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61 (6), 880-894 (2009).
- Sutton, M. A., Taylor, A. M., Ito, H. T., Pham, A., Schuman, E. M. Postsynaptic decoding of neural activity: eEF2 as a biochemical sensor coupling miniature synaptic transmission to local protein synthesis. Neuron. 55 (4), 648-661 (2007).
- Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nature Cell Biology. 11 (8), 1024-1030 (2009).
- Sharma, N., et al. Long-distance control of synapse assembly by target-derived NGF. Neuron. 67 (3), 422-434 (2010).
- Harrington, A. W., et al. Recruitment of actin modifiers to TrkA endosomes governs retrograde NGF signaling and survival. Cell. 146 (3), 421-434 (2011).
- Zhang, Y., et al. Assembly and maintenance of nodes of ranvier rely on distinct sources of proteins and targeting mechanisms. Neuron. 73 (1), 92-107 (2012).
- Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal translation of beta-catenin regulates synaptic vesicle dynamics. The Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
- Tran, H. T., et al. Alpha-synuclein immunotherapy blocks uptake and templated propagation of misfolded alpha-synuclein and neurodegeneration. Cell Reports. 7 (6), 2054-2065 (2014).
- Calafate, S., et al. Synaptic Contacts Enhance Cell-to-Cell Tau Pathology Propagation. Cell Reports. 11 (8), 1176-1183 (2015).
- Cosker, K. E., Fenstermacher, S. J., Pazyra-Murphy, M. F., Elliott, H. L., Segal, R. A. The RNA-binding protein SFPQ orchestrates an RNA regulon to promote axon viability. Nature Neuroscience. 19 (5), 690-696 (2016).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Pinto, M. J., et al. The proteasome controls presynaptic differentiation through modulation of an on-site pool of polyubiquitinated conjugates. The Journal of Cell Biology. 212 (7), 789-801 (2016).
- Bigler, R. L., Kamande, J. W., Dumitru, R., Niedringhaus, M., Taylor, A. M. Messenger RNAs localized to distal projections of human stem cell derived neurons. Scientific Reports. 7 (1), 611 (2017).
- Nagendran, T., et al. Distal axotomy enhances retrograde presynaptic excitability onto injured pyramidal neurons via trans-synaptic signaling. Nature Communications. 8 (1), 625 (2017).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. What are its weaknesses, and which other polymers can researchers add to their toolboxes? Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , Second edition, MIT Press. (1998).
