Summary
Мы представляем протокол побудить и обнаружить, что CMHs, вызванные LPS инъекций в крысах Sprague-Dawley, которые могут быть использованы в будущих исследований на патогенез CMHs.
Abstract
Церебральным microhemorrhages (CMHs) являются общими у пожилых пациентов и связаны с различными нервно-психических расстройств. Этиология CMHs является сложным, и neuroinflammation часто наблюдаются как сопредседатель возникновение. Здесь мы описываем подостром CMHs крысы модель индуцированных инъекции липополисахарида (LPS), а также метод для обнаружения CMHs. Системные LPS инъекции является относительно простой, экономичный и экономически эффективным. Одним из основных преимуществ LPS инъекции является его стабильность, чтобы вызвать воспаление. CMHs, вызванные LPS инъекции могут быть обнаружены брутто наблюдения, гематоксилином и (он) эозином, Perl прусский окрашивание, Эванс синий (EB) двойной маркировки и магнитно резонансная томография восприимчивость взвешенный технологии визуализации (МРТ-SWI). Наконец другие методы разработки CMHs животных моделей, включая их преимущества и недостатки, также обсуждаются в настоящем докладе.
Introduction
Классическая мозгового microhemorrhages (CMHs) относятся к крошечные периваскулярной отложения продуктов разложения крови как гемосидерин от красных кровяных клеток в мозг1. По данным сканирования исследования Роттердам CMHs можно найти почти 17,8% лиц в возрасте 60-69 лет, 38,3% в тех, кто старше 80 лет2. Распространенность CMHs в пожилом возрасте является относительно высокой, и корреляции между накоплением CMHs и когнитивные и психоневрологических дисфункции был установленным3,4. Недавно сообщалось несколько животных моделей CMHs, включая грызунов модели индуцированных типа IV коллагеназы стереотаксического инъекций5, APP трансгенных6, β-N-метиламино L-аланина воздействия7и8гипертонии с CMHs индуцированных внутрирастительного воспаления, как один из вариантов, наиболее широко признанным. Фишер и др. 9 впервые использован LPS, производные от сальмонеллы typhimurium разработать модель мыши острый CMHs. Впоследствии же группа сообщила о разработке подостром CMHs мыши модели с использованием же подход2.
LPS рассматривается как стандартизированные воспалительных стимул через внутрибрюшинной инъекции. Предыдущие исследования подтвердили, что LPS инъекции может привести к neuroinflammation, как свидетельствует большое количество Микроглия и экзоцитоз активации в животных моделей2,10. Кроме того положительная корреляция между активацией neuroinflammation активации и количество CMHs был установленным2,10. Основываясь на этих предыдущих исследований, мы были предложено разработать модель CMHs крыса внутрибрюшинной инъекцией LPS.
Достижения в обнаружения технологии привели к увеличению числа исследований на CMHs. Наиболее широко признается, методы обнаружения CMHs включают обнаружение красных кровяных клеток гематоксилином и эозином (он), окрашивание, обнаружения железа железа, лазурь, окрашивание9, обнаружение Эванс синий осаждения (EB), иммунофлюоресценции изображений и 7.0 Тесла магнитно резонансная томография восприимчивость взвешенных изображений (МРТ-SWI)10. Настоящее исследование стремится разработать метод скрининга для CMHs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены животное уход и использование Комитета (ACUC) из госпиталя НОАК генерал армии.
1. материалы
- Подготовка LPS инъекции
- Добавьте 25 мл дистиллированной воды до 25 мг порошка LPS, производный от S. typhimurium до конечной концентрации 1 мг/мл. Магазин инъекции в стерильную пробирку при 4 ° C.
Предупреждение: LPS является токсичным. - Приготовляют раствор 2% EB в нормальный физиологический раствор 0,9% держать EB инъекций на рабочие концентрации.
- Добавьте 25 мл дистиллированной воды до 25 мг порошка LPS, производный от S. typhimurium до конечной концентрации 1 мг/мл. Магазин инъекции в стерильную пробирку при 4 ° C.
2. Животные
- Администрировать LPS крысах Sprague-Dawley (SD), в возрасте 10 недель (средний вес: 280 ± 20 г) внутрибрюшинной инъекцией.
Предупреждение: Если крысы закупаются из другой организации, то адаптивной фаза не следует менее чем за 7 дней.
3. LPS инъекции
- Каждый крыса в дозе 1 мг/кг внутрибрюшинно придать ПЛАСТИНОК и вернуть их домой клетки крыс.
Примечание: Анестезия не является необходимым. - Шесть часов спустя, придать ту же дозу LPS инъекции в крыс.
- Шестнадцать часов спустя придать ту же дозу LPS в крыс.
ВНИМАНИЕ: Инъекций SD крыс с ПЛАСТИНОК в дозе 1 мг/кг может привести к 5% смертности. Уровень смертности может дополнительно увеличить в молодых или старых крыс или беременных самок. - Вернуть их клетках крыс после инъекции ПЛАСТИНОК и ad libitum доступ к еды и питья.
Примечание: Крысы представят различные системного воспалительного ответа, и таким образом, важно, что клетки остаются чистыми на протяжении всего эксперимента. Крысы должны быть часто (2 x в день) мониторинг для веса, общий внешний вид и отношение после первой инъекции ПЛАСТИНОК. Если крысы начинают проявлять Сгорбленная осанка, нежелание двигаться, значительная потеря веса (> 20%), порфирина пятнать что они гуманно euthanized до 7 дней EB исследование конечной точки.
4. образец коллекции
- Инъекции EB
- Через семь дней после первой инъекции, анестезировать крыса, внутрибрюшинно согласно утвержденным протокол IACUC.
- Подождите 1 – 2 мин, пока крысы не показывать роговицы рефлекторные реакции. Выполните 5 – 8 мм-глубокой сердечной проколов на каждом крыса; puncturing точкой должно быть 5 мм до левого края грудины на 3-м и 4-м межреберье.
- Подождите, пока восстановление крови наблюдается и затем внедрить EB в дозе 0,2 мл/100 г веса тела в желудочка левого сердца.
Предупреждение: Пункции сердца и EB впрыска должно тщательно выполняться. EB может быть введен в грудной полости или перикарда вместо желудочка левого сердца.- Сосать обратно с пустой трубы и заменить этот объем EB трубки перед инъекцией, чтобы помочь уменьшить коэффициент отказа (например., инъекции, чтобы грудная клетка по ошибке).
- Держите крыса в лежачем положении на 10 мин.
Примечание: Если образец не используется для обнаружения утечки EB в иммунофлуоресценции изображений, то этот шаг может быть опущен.
- Брутто наблюдения
- Выполняйте сердечной орошений, используя ледяной буфера 1 М фосфатный (PBS) очистить мозгового сосудистую и мозги.
- С помощью скальпеля, сделайте разреза брюшной полости через всю длину диафрагмы.
- Разрез через ребра просто слева от срединной линии грудной клетки.
- Откройте грудной полости. Используйте зажимы, подвергать сердце и облегчить дренажной крови и других жидкостей.
- Удерживая неуклонно сердце с щипцами (сердце по-прежнему должны избиение), напрямую вставить иглу в выступ левого желудочка продлить это на около 5 мм. Зафиксируйте иглы в этой позиции, зажимные вблизи точки входа.
Предупреждение: Не чрезмерно расширить иглы, как он может пробить стену и нарушить циркуляцию решений. - Освободите клапан, чтобы разрешить поток ледяной решения PBS (200 – 300 мл) со скоростью медленный и стабильный около 20 мл/мин с помощью перфузионного насоса. Если животные требуют фиксации вместо валового наблюдения, затем используйте той же дозе ледяные 0,9% физиологического раствора.
- С помощью острых ножниц, надрезать в атриуме, обеспечивая, что решение постоянно течет. Если жидкость не течет свободно или приходит от животного нос или рот, перемещения иглы.
- Экран для CMHs валовой наблюдения.
Примечание: Если образец не используется в расчете числа CMHs валовой наблюдения, то этот шаг может быть опущен.
- Выполняйте сердечной орошений, используя ледяной буфера 1 М фосфатный (PBS) очистить мозгового сосудистую и мозги.
- Фиксация
- Выполняйте сердечной орошений, используя ледяной 0,9% соляной раствор (200 – 300 мл) очистить мозгового сосудистую и мозги.
- Выполняйте сердечной орошений, используя ледяной параформальдегида 4% для фиксации.
- Обезглавить крыса, изолировать мозга и погружать мозга в 20% растворе сахарозы для по крайней мере 6 часов.
- Изменить решение в 30% сахарозы и исправление еще 6 h.
- Подготовка 10 мм толстой мозга тканей разделов с помощью криостата.
5. он пятнать
Примечание: Эта процедура выполняется с помощью окрашивания комплект он.
- Вымойте слайды в дистиллированной воде.
- Пятно в растворе гематоксилином 8 мин мыть в проточной водой в течение 5 мин.
- Дифференцировать кислоты спиртовой 1% для 30 s. мыть в проточной водой за 1 мин.
- Пятно в 0,2% аммиачной воды (воронение) или насыщенных лития карбоната решение для 30 s до 1 мин вымыть проточной водой в течение 5 мин.
- Промыть в 95% спирте (10 провалы).
- Изображение с раствором эозина для 30 s до 1 мин.
- Обезвоживанию через 95% спирта, два изменения абсолютного алкоголя, 5 мин.
- В ксилоле 30 s.
- Прикрепите с помощью метода Лю в9.
- Анализ с помощью микроскопа флуоресценции brightfield.
Примечание: красные кровяные клетки освобожден из кровеносных сосудов, которые являются компонентами CMHs, появляются в красно оранжевый под он пятнать.
6. Perl лазурь пятнать
Примечание: Эта процедура выполняется с помощью Перлз Комплект окрашивание.
- Вымойте слайды с дистиллированной водой.
- Пятно в реакции раствора с смесь равных частей Ферроцианид и соляной кислоты на 10 мин.
- Обезвоживать, очистить, смонтировать и анализировать слайды, как описано в шагах 5,7-5.10.
7. EB двойной окрашивание
Примечание: Эта процедура следующим шагом 4.1.3.
- Вымойте слайды с PBS три раза за 5 мин.
- Инкубируйте слайды с 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) решение для 15 мин при комнатной температуре.
- Вымойте слайды с PBS решения три раза за 5 мин и смонтировать слайды с PBS-глицерола раствор.
- Анализ изображений на флуоресцентным микроскопом. Осаждения EB обозначается красной флуоресценцией; ядра помечаются голубой флуоресценцией.
8. МРТ SWI
- Выполните МРТ на магнит 7-T оснащены системой активно экранированный градиента (внутренний диаметр 16 см).
- Через семь дней после лечения, анестезировать крысы вдыханием маску изофлюрановая 1,5 – 2,0%, с использованием системы изофлюрановая анестезии.
- Примените мазь ветеринар на глазах крысы для предотвращения сухости под наркозом.
- Держите крыс в лежачем положении и выполнить проверку МРТ-SWI.
- Получения SWI взвешенный сканирование с помощью последовательности быстро спиновое эхо, используя следующие параметры: эхо времени (TE) 8 мс, повторение время (TR) 40 мс, флип угол = 12°, поле зрения (FOV) 35 mm × 35 мм, приобретение матрица 384 × 384, приобрести 1 мм толщиной ломтиками.
- Определить CMHs в МРТ-SWI согласно Гринберг и др. 11, которая включала следующие критерии: (1) диаметром крупностью до 10 мм и (2) круговой, изолированных и низким сигнал интенсивность пятен.
- В конце эксперимента усыпить крыс с помощью метода передозировке двуокиси углерода (расход 6 Л/мин) или 30% от объема контейнера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CMHs могут быть обнаружены с использованием различных подходов. Наиболее широко признанным методы включают следующее: (1) валового наблюдение и оценку поверхности CMHs (показано на рис. 1, верхняя группа); (2) он пятная для обнаружения красных кровяных клеток (показано на рисунке 2А, верхняя панель) или прусского пятнать детектирования железа железа производный от lysis красных кровяных клеток (рис. 2A, нижней панели); (3) EB удвоилось, пятнать для обнаружения осаждения EB, производный от BBB утечки (рис. 3, левая панель); (4) МРТ-SWI Обнаружение сигналов hypointense CMHs (рис. 4, левой панели).
Рисунок 1: валовой наблюдения поверхности CMHs. Верхняя панель (A): крысы модель; Нижняя панель (B): Управление животных. Красные стрелки означают поверхности CMHs. изменен и повторно с разрешением10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: он окрашивание и прусский окрашивание изображения. (A) отражен крысы модель. Красные кровяные клетки были найдены за пределами капилляров в верхней панели, и железа железа очков, полученных от lysis красных кровяных клеток были обнаружены в нижней панели; (B) отражен контроля животных. Красные кровяные клетки, ни железа железа точек были найдены. Масштаб баров = 100 мкм (левой части A и B). Масштаб баров = 50 мкм (правая панель A и B). Разрешение на изменение и повторно с10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Двойной помечены изображений флуоресценции осаждения EB. Левая панель: крысы модель. Количество молекул EB, утечка из раненых BBB были обнаружены (в красном); Правая панель: животных контроля. Были обнаружены молекулы не EB. DAPI синим использовался в качестве средней горы. Масштаб баров = 100 µm. изменения и повторно с разрешением10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Изображения МРТ-SWI. Левая панель (A): крысы модель. Черные стрелки обозначают сигналы hypointense CMHs; Правая панель (B): Управление животных. Сигналы не hypointense были найдены. Разрешение на изменение и повторно с10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Исследования на CMHs увеличились в последние несколько лет. Однако механизм CMHs остается неясным, что побудило ученых создать Животные модели, которые имитируют это особое состояние. Например, Хоффман и др. разработал гипоксия индуцированной CMHs мыши модель, которая показывает, что CMHs вызванных гипоксией и нарушение цереброваскулярные саморегуляции12. Рейтера и др. 5 создана модель CMHs в APP23-трансгенных мышей, которые показали, что Церебральный амилоидные ангиопатии (УГА) играет важную роль в этиологии CMHs. Fisher et al. сообщили CMHs модель мыши, что было вызвано LPS инъекций9, который показали, что CMHs, вызванные воспалением2,,1314. Аналогичным образом мы успешно разработали подостром CMHs модель SD крыс с помощью инъекций ПЛАСТИНОК и нашли что синтаза оксида азота (NOS), особенно нейронных нос и эндотелиальных NOS, участвуют в этиологии CMHs, которые приводят к воспалению10 .
Важнейшим шагом нашего протокола является LPS инъекции, которая широко используется в разработке мышиных моделях нервно-психических расстройств, таких как депрессии15,16шизофрения, болезнь Паркинсона17, болезнь Альцгеймера 18и прионы болезни19. Наши знания наше использование однократно (1 мг/кг) гораздо выше, чем который был применен в других исследованиях15,16,,1718,19. Это может быть правдоподобной причины смертности в текущем исследовании. LPS доза модификации для индукции CMHs может быть интересной темой исследования, как разные дозы или инъекции расписание было показано, влияют на число, размер, распределение и прогрессирование CMHs2. Предыдущий исследование показало, что администрация LPS мышей в дозе 3 мг/кг вызывает острый CMHs2.
Хотя разработка различных животных моделей способствовала исследований на CMHs, мы должны признать, что эти животные модели не имитировать процесс клинических CMHs. Например, в нашей модели крыс, а также модели мышей Фишера, CMHs были замечены в мозжечке, хотя большинство были замечены в долевой регионах (главным образом связанные с CAA) и глубоко - или ИК tentorial мест (главным образом связанные с гипертонией)20, 21. Мы имеем никакое объяснение для этого несоответствия в распределении, хотя Фишер и наша команда приписывают это наблюдение на уязвимость кровеносных сосудов мозжечка воспаления.
В большинство клинических случаях CMHs в результате более чем одного этиологического фактора, хотя воспаление играет важную роль в ее этиологии. Исследования, посвященные многочисленных факторов, которые вызывают CMHs, вместо чистого воспаления индуцированной CMHs, таким образом может быть более полезным, в имитации этого состояния. LPS инъекции модель может использоваться с другими основополагающие факторы для изучения механизма CMHs. К примеру Fisher et al. провели предварительный, но интересный шаг с старение мышей вводят с ПЛАСТИНОК и показали, что старение является ключевым фактором, который может сделать мозг более подвержены воспаление индуцированной CMHs14. По нашему мнению важность нынешней модели является ее совместимость с другими факторами в животных моделей для старения14, травма22, а также хронических заболеваний, таких как гиперхолестеринемии23, или transgenic моделей, таких как гипертензия24 из-за простоты, время эффективность и стабильность этого протокола.
У больных с CMHs показывают снижение когнитивных, психоневрологическая проявления и головокружение, которые связаны с распределением CMHs. Одно ограничение настоящего Протокола является то, что после инъекции LPS, мы не могли исключить последствия периферических воспаления на поведение крыс, хотя снижение социального поведения и роющих (внутренние естественной активности грызунов отражения обесценение повседневной деятельности) были замечены. Дальнейшие исследования о путях улучшения наших метод генерации CMHs модели на животных, например, метод введения ПЛАСТИНОК или расписание наблюдения.
Тем не менее этот простой, экономически эффективные и стабильные CMHs мышиных модель индуцированных LPS инъекции может использоваться исследователями в изучение этиологии CMHs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим учитель Цзянь Фэн леев и коллеги из столицы медицинский университет для указания во время МРТ. Мы также благодарим Цзэн Цзин от кафедры неврологии, Yichang второй человек госпиталь для оказания технической поддержки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L-2630 | for inflammation induction |
| EB | Sigma-aldrich | E2129 | for EB leakage detection |
| DAPI dying solution | Servicbio | G1012 | count medium for IF |
| Perl’s Prussian staining | Solarbio | G1424 | Kit for Prussian staining |
| HE staining | Solarbio | G1120 | Kit for HE staining |
| chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 47335U | For anesthesia |
| phosphate buffer saline (PBS) | Solarbio | P1022 | a kind of buffer solution commonly used in experiment |
| 0.9% saline solution | Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China | solution for perfusion | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | a kind of solution commonly used for fixation |
| 20% sucrose solution | Solarbio | G2461 | a kind of solution commonly used for fixation |
| 30% sucrose solution | Solarbio | G2460 | a kind of solution commonly used for fixation |
| vet ointment | Solcoseryl eye gel, Bacel, Switzerland | for rat's eyes protection |
References
- Sumbria, R. K., et al. A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds. J Neuroinflammation. 13 (1), 218 (2016).
- Vernooij, M. W., et al. Prevalence and risk factors of cerebral microbleeds the Rotterdam Scan Study. Neurology. 70 (14), 1208-1214 (2009).
- Pettersen, J. A., et al. Microbleed topography, leukoaraiosis, and cognition in probable Alzheimer disease from the Sunnybrook dementia study. Archives of Neurology. 65 (6), 790-795 (2008).
- Xu, X., et al. Cerebral microbleeds and neuropsychiatric symptoms in an elderly Asian cohort. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 88 (1), 7-11 (2017).
- Mcauley, G., Schrag, M., Barnes, S., Obenaus, A., Dickson, A., Kirsch, W. In vivo iron quantification in collagenase-induced microbleeds in rat brain. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (3), 711-717 (2012).
- Reuter, B., et al. Development of cerebral microbleeds in the APP23-transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy-a 9.4 tesla MRI study. Frontiers in Aging Neuroscience. 8 (8), 170 (2016).
- Scott, L. L., Downing, T. G. A single neonatal exposure to BMAA in a rat model produces neuropathology consistent with neurodegenerative diseases. Toxins. 10 (1), E22 (2018).
- Toth, P., et al. Aging exacerbates hypertension-induced cerebral microhemorrhages in mice: role of resveratrol treatment in vasoprotection. Aging Cell. 14 (3), 400-408 (2015).
- Liu, S., et al. Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (11), 767-773 (2014).
- Zeng, J., Zhào, H., Liu, Z., Zhang, W., Huang, Y. Lipopolysaccharide induces subacute cerebral microhemorrhages with involvement of Nitric Oxide Synthase in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 27 (7), 1905-1913 (2018).
- Greenberg, S. M., et al. Cerebral microbleeds: A guide to detection and interpretation. Lancet Neurology. 8 (2), 165-174 (2009).
- Hoffmann, A., et al. High-Field MRI reveals a drastic increase of hypoxia-induced microhemorrhages upon tissue reoxygenation in the mouse brain with strong predominance in the olfactory bulb. Plos One. 11 (2), e0148441 (2016).
- Sumbria, R. K., et al. Effects of phosphodiesterase 3A modulation on murine cerebral microhemorrhages. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 114 (2017).
- Sumbria, R. K., et al. Aging exacerbates development of cerebral microbleeds in a mouse model. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 69 (2018).
- Mello, B. S. F., et al. Sex influences in behavior and brain inflammatory and oxidative alterations in mice submitted to lipopolysaccharide-induced inflammatory model of depression. Journal of Neuroimmunol. 320, 133-142 (2018).
- Souza, D. F. D., et al. Changes in astroglial markers in a maternal immune activation model of schizophrenia in Wistar rats are dependent on sex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (489), (2015).
- Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The Lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
- El-Sayed, N. S., Bayan, Y. Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 822 (822), 107-118 (2015).
- Combrinck, M. I., Perry, V. H., Cunningham, C. Peripheral infection evokes exaggerated sickness behaviour in pre-clinical murine prion disease. Neuroscience. 112 (1), 7-11 (2002).
- Pantoni, L. Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges. Lancet Neurology. 9 (7), 689-701 (2010).
- Rosand, J., et al. Spatial clustering of hemorrhages in probable cerebral amyloid angiopathy. Annals of Neurology. 58 (3), 459-462 (2005).
- Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1025-1035 (2017).
- Kraft, P., et al. Hypercholesterolemia induced cerebral small vessel disease. Plos One. 12 (8), e0182822 (2017).
- Schreiber, S., Bueche, C. Z., Garz, C., Baun, H. Blood brain barrier breakdown as the starting point of cerebral small vessel disease? - New insights from a rat model. Experimental & Translational Stroke Medicine. 5 (1), 4 (2013).
