Summary
Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zu induzieren und erkennen, dass CMHs verursacht durch LPS Injektion in Sprague-Dawley Ratten, die möglicherweise in Zukunft Forschung Untersuchungen über die Pathogenese der CMHs genutzt.
Abstract
Zerebrale Scherbewegungen (CMHs) sind häufig bei Patienten im Alter von und in Korrelation zu verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen. Die Ätiologie der CMHs ist komplex, und Neuroinflammation wird oft als eine gleichzeitige Auftreten beobachtet. Hier beschreiben wir eine Sub-akute CMHs Rattenmodell induziert durch Lipopolysaccharid (LPS) Injektion, sowie eine Methode zur Erkennung von CMHs. systemische LPS Injektion ist relativ einfach, wirtschaftlich und kostengünstig. Ein großer Vorteil von LPS Injektion ist seine Stabilität, Entzündung zu induzieren. CMHs verursacht durch LPS Injektion konnte durch grobe Beobachtung, Hämatoxylin und Eosin (HE) Färbung, Perl preußischen Färbung, Evans blau (EB) Doppel-labeling und Magnet-Resonanz-Tomographie-Anfälligkeit gewichtet imaging (MRI-SWI)-Technologie nachgewiesen werden. Abschließend werden andere Methoden der Entwicklung von Tiermodellen CMHs, einschließlich ihre Vorteile bzw. Nachteile, auch in diesem Bericht diskutiert.
Introduction
Klassische zerebrale Scherbewegungen (CMHs) beziehen sich auf winzige perivaskuläre Ablagerungen von Blut Abbauprodukte wie Hämosiderin aus roten Blutkörperchen in der Gehirn-1. Demnach Rotterdam Scan werden CMHs in fast 17,8 % der Personen im Alter von 60-69 Jahre und 38,3 % bei den über 80-jährigen2gefunden. Die Prävalenz der CMHs bei älteren Menschen ist relativ hoch, und eine Korrelation zwischen der Akkumulation von CMHs und neuropsychiatrische und Kognitive Dysfunktion wurde etablierten3,4. Verschiedenen Tiermodellen der CMHs haben vor kurzem berichtet wurde, einschließlich der Nager-Modelle von Typ IV Kollagenase stereotaktischen Injektion5, APP transgenen6, β-N-Methylamino-L-Alanin Exposition7und Hypertonie8induziert, mit CMHs, induziert durch eine systemische Entzündung als eines der am meisten anerkannten Entscheidungen. Fischer Et al. zuerst verwendet 9 LPS von Salmonella Typhimurium abgeleitet, um einem akuten CMHs Mausmodell zu entwickeln. Anschließend berichtete die gleiche Gruppe die Entwicklung von einem subakuten CMHs-Maus-Modell mit dem gleichen Ansatz2.
LPS gilt als eine standardisierte entzündungsreiz über intraperitoneale Injektion. Frühere Studien haben bestätigt, dass LPS Injektion Neuroinflammation verursachen könnte, wie Sie sich durch große Mengen von Mikroglia und Astrozyten Aktivierung in der Tier-2,10 Modelle. Darüber hinaus wurde eine positive Korrelation zwischen der Aktivierung des Neuroinflammation Aktivierung und die Anzahl der CMHs etablierten2,10. Basierend auf diesen früheren Studien, wurden wir aufgefordert, einem Rattenmodell CMHs entwickeln durch intraperitoneale Injektion von LPS.
Fortschritte in der Erkennung, Technologien zu einer Zunahme der Anzahl der Forschung Untersuchungen über CMHs geführt haben. Am meisten anerkannten Methoden zur Erkennung von CMHs gehören den Nachweis von roten Blutkörperchen von Hämatoxylin und Eosin (HE) Färbung, dreiwertigem Eisen Erkennung durch preußisch-blau färben9, Erkennung von Evans blau (EB) Ablagerung durch Immunfluoreszenz Bildgebung und 7,0 Tesla Magnet-Resonanz-Tomographie-Anfälligkeit gewichtete Bildgebung (MRT-SWI)10. Die vorliegende Studie soll eine Methode zur Früherkennung von CMHs zu entwickeln.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von Animal Care und Nutzung Ausschuss (ACUC) des PLA Armee General Hospital genehmigt.
(1) Materialien
- Vorbereitung der LPS-Injektion
- 25 mg LPS Pulver abgeleitet von S. Typhimurium , eine Endkonzentration von 1 mg/mL fügen Sie 25 mL destilliertem Wasser hinzu. Speichern Sie die Injektion in ein steriles Röhrchen bei 4 ° c
Achtung: LPS ist giftig. - Bereiten Sie eine 2 %-EB-Lösung in normalen 0,9 % Kochsalzlösung, EB-Injektion bei Arbeiten Konzentration zu halten.
- 25 mg LPS Pulver abgeleitet von S. Typhimurium , eine Endkonzentration von 1 mg/mL fügen Sie 25 mL destilliertem Wasser hinzu. Speichern Sie die Injektion in ein steriles Röhrchen bei 4 ° c
(2) Tiere
- LPS an männlichen Sprague-Dawley (SD) Ratten, im Alter von 10 Wochen verabreichen (durchschnittliches Gewicht: 280 ± 20 g) durch intraperitoneale Injektion.
Achtung: Wenn Ratten von einem anderen Unternehmen gekauft werden, sollte dann die adaptive Phase nicht weniger als 7 Tage sein.
(3) LPS-Injektionen
- Injizieren Sie LPS intraperitoneal in jede Ratte in einer Dosis von 1 mg/kg, und zurückkehren Sie die Ratten zu ihrem Hause Käfig.
Hinweis: Narkose ist nicht erforderlich. - Injizieren Sie sechs Stunden später, die gleiche Dosis von LPS-Injektion in den Ratten.
- 16 Stunden später injizieren die gleiche Dosis von LPS in den Ratten.
Achtung: Injektion von SD-Ratten mit LPS bei einer Dosis von 1 mg/kg eine 5 % Sterblichkeit führen. Die Sterblichkeit kann in jüngeren oder älteren Ratten oder schwangeren weiblichen Ratten weiter erhöhen. - Kehren Sie die Ratten in ihren Käfigen nach LPS-Injektion und Ad Libitum Zugang zu essen und trinken.
Hinweis: Ratten zeigen eine ausgeprägte systemische Entzündungsreaktion, und daher ist es wichtig, dass die Käfige während des Experiments sauber bleiben. Ratten sollten häufig (2 X Tag) Gewicht, Allgemeines Erscheinungsbild und Verhalten nach der ersten Injektion LPS überwachen. Wenn die Ratten beginnen, zeigen ein Buckliger Haltung, mangelnde Bereitschaft zu bewegen, erheblichen Gewichtsverlust (> 20 %), vor der 7-tägigen EB Studie Endpunkt eingeschläfert Porphyrin Färbung, die sie menschlich zu sein.
(4) die Probenahme
- EB-Injektion
- Betäuben Sie sieben Tage nach der ersten Injektion, die Ratte durch intraperitoneale nach Ihren genehmigten IACUC Protokoll.
- Warten Sie 1 – 2 min., bis die Ratten nicht Hornhaut Reflexe Reaktionen zeigen. Führen Sie eine 5 – 8 mm-Tiefe Herzpunktion auf jede Ratte; die Punktion sollte 5 mm am linken Rand des Brustbeins am 3. und 4. Intercostales Raum sein.
- Warten Sie, bis Blut Genesung beobachtet wird, und Spritzen Sie EB in einer Dosierung von 0,2 mL/100 g Körpergewicht in die linke Herzkammer.
Achtung: Cardiac Punktion und EB Injektion sollte sorgfältig durchgeführt werden. EB könnte in der Brusthöhle oder Herzbeutel anstelle der linken Herzkammer injiziert werden.- Zurück mit einem Leerrohr saugen und Ersetzen dieser Band mit einem EB-Schlauch vor der Injektion, um die Fehlerrate zu verringern (z. B.., Injektion, Brustkorb durch Fehler).
- Halten Sie die Ratte in Rückenlage für 10 Minuten.
Hinweis: Wenn Probe nicht verwendet wird, um EB Leckage in der Immunfluoreszenz-Bildgebung zu erkennen, kann dieser Schritt übersprungen.
- Grobe Beobachtung
- Durchführen Sie kardiale Perfusionen mit eiskalten 1 M Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) zerebrale Gefäßsystem und die Gehirne löschen.
- Mit einem Skalpell, machen Sie ein Bauchschnitt über die gesamte Länge des Zwerchfells.
- Schnitt durch Rippen nur Links von der Mittellinie des Brustkorbs.
- Öffnen Sie die Brusthöhle. Verwenden Sie Klammern, das Herz aussetzen und Ableitung von Blut und anderen Flüssigkeiten zu erleichtern.
- Halten Sie stetig das Herz mit der Pinzette (das Herz soll noch schlägt), direkt Einfügen einer Nadel in den Vorsprung der linken Herzkammer bis ca. 5 mm. ausdehnen sichern die Nadel an dieser Stelle klemmend nahe dem Punkt der Einreise.
Achtung: Übermäßig die Nadel erstrecken sich nicht durchbohren die Innenwand und gefährden den Verkehr von Lösungen. - Lassen Sie das Ventil, um die Strömung eiskaltem PBS Lösung (200 – 300 mL) mit einer langsamen und stetigen Rate bei rund 20 mL/min mit einem Perfusion Pumpe ermöglichen. Wenn die Tiere Fixierung statt Brutto Beobachtung erfordern, verwenden Sie die gleiche Dosis von eiskalten 0,9 % Kochsalzlösung.
- Mit einer scharfen Schere, einen Einschnitt machen Sie im Atrium, um sicherzustellen, dass die Lösung kontinuierlich fließt. Wenn die Flüssigkeit nicht frei fließt oder aus Nase oder den Mund des Tieres kommt, positionieren Sie die Nadel.
- Bildschirm für CMHs durch grobe Beobachtung.
Hinweis: Wenn die Probe nicht verwendet wird bei der Berechnung der Anzahl der CMHs durch grobe Beobachtung, kann dieser Schritt übersprungen.
- Durchführen Sie kardiale Perfusionen mit eiskalten 1 M Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) zerebrale Gefäßsystem und die Gehirne löschen.
- Fixierung
- Führen Sie kardiale Perfusionen mit eiskalten 0,9 % Kochsalzlösung (200 – 300 mL), der zerebralen Vasculature zu löschen und Gehirn.
- Durchführen Sie kardiale Perfusionen mit eiskalten 4 % Paraformaldehyd für Fixierung.
- Enthaupten Sie die Ratte, isolieren Sie das Gehirn zu und Tauchen Sie das Gehirn 20 % Saccharose Lösung für mindestens 6 h.
- Ändern Sie die Lösung in 30 % Saccharose und Fix für ein weiteres 6 h.
- Bereiten Sie 10 mm dicken Gehirn Gewebe Abschnitte mit einem Kryostat vor.
5. er Färbung
Hinweis: Dieses Verfahren wird mit einer er-Färbung Kit durchgeführt.
- Waschen Sie die Folien in destilliertem Wasser.
- In fließendem Leitungswasser für 5 min in Hämatoxylin Lösung für 8 min. Waschen färben.
- In 1 % Säure Alkohol unter fließendem Leitungswasser für 1 min 30 S. reinigen zu unterscheiden.
- In 0,2 % Ammoniakwasser (Bläuen) färben oder gesättigten Lithium Carbonat Lösung für 30 s bis 1 min. Waschen unter fließendem Leitungswasser für 5 Minuten.
- Spülen Sie mit 95 % Alkohol (10 Dips).
- Gegenfärbung mit Eosin-Lösung für 30 s bis 1 Minute.
- Über 95 % Alkohol, zwei Änderungen des absoluten Alkohol, 5 min zu entwässern.
- Klar in Xylol für 30 s.
- Montieren Sie mit Lius Methode9.
- Mit einem Hellfeld-Fluoreszenz-Mikroskop zu analysieren.
Hinweis: rote Blutkörperchen aus den Blutgefäßen, die die Komponenten der CMHs, veröffentlicht in rot-Orange unter er Färbung angezeigt.
(6) Perl preußisch-Blau Färbung
Hinweis: Dieses Verfahren erfolgt mit einem Perls Färbung-Kit.
- Waschen Sie Objektträger mit destilliertem Wasser.
- In der Reaktionslösung mit gleichen Teilen Mischung aus ferrocyanid und Salzsäure für 10 min. färben.
- Entwässern, klar, montieren und die Folien zu analysieren, wie 5,7 – 5.10 beschrieben.
(7) EB Doppel-Färbung
Hinweis: Diese Prozedur folgt Schritt 4.1.3.
- Waschen Sie Objektträger mit PBS dreimal für jeweils 5 min..
- Inkubieren Sie Folien mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Lösung für 15 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Folien mit PBS-Lösung drei Mal für 5 min, und montieren Sie Folien mit PBS-Glycerin-Lösung.
- Analysieren von Bildern auf einem Fluoreszenzmikroskop. EB-Abscheidung wird durch rote Fluoreszenz; Kerne sind gekennzeichnet durch blaue Fluoreszenz.
(8) MRI-SWI
- Führen Sie MRI auf einen 7-Tesla-Magneten ausgestattet mit einem aktiv abgeschirmten gradient-System (16 cm Innendurchmesser).
- Betäuben Sie sieben Tage nach der Behandlung, die Ratten durch Gesichtsmaske Einatmen von 1,5 – 2,0 % Isofluran mit einem Isofluran-Narkose-System.
- Wenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen der Ratte gegen Trockenheit während Narkose an.
- Halten Sie die Ratten in Bauchlage und durchführen Sie einen MRI-SWI-Scan.
- SWI gewichteten Scans mit einer Fast-Spin-Echo-Sequenz mit den folgenden Parametern zu erhalten: echo Zeit (TE) 8 ms Wiederholung Zeit (TR) 40 ms, flip Winkel = 12°, Sichtfeld (FOV) 35 mm × 35 mm, Erwerb Matrix 384 × 384, 1 mm dicke Scheiben zu erwerben.
- Identifizieren Sie CMHs in MRI-SWI nach Greenberg Et al. 11, in dem folgenden Kriterien berücksichtigt: (1) einen Durchmesser von ≤10 mm und (2) zirkuläre, isoliert und Low-Signal Intensität Flecken.
- Am Ende des Experiments einschläfern Sie die Ratten, die mit der Überdosis Kohlendioxid (einem Fluss von 6 L/min) oder 30 % des Behältervolumens Methode.
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Representative Results
CMHs können mit verschiedenen Ansätzen erkannt werden. Die meisten anerkannten Methoden gehören die folgenden: (1) grobe Beobachtung und Beurteilung der Oberfläche CMHs (siehe Abbildung 1, oben); (2) er Färbung zum Nachweis von roten Blutkörperchen (siehe Abbildung 2A, obere Leiste) oder preußischen Färbung erkennen von dreiwertigem Eisen abgeleitet Lyse der Erythrozyten (Abb. 2A, untere Leiste); (3) EB verdoppelt Färbung zum Nachweis von EB Ablagerung abgeleitet von BBB Leckage (Abbildung 3, Links Panel); (4) MRI-SWI-Erkennung von CMHs Hypointense Signale (Abbildung 4, Links).
Abbildung 1: Brutto-Beobachtung der Oberfläche CMHs. Oberen Bereich (A): Rattenmodell; Untere Leiste (B): Kontrolle Tier. Rote Pfeile bedeuten Oberfläche CMHs. geändert und mit Erlaubnis10wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: er Färbung und preußischen Färbung Bilder. (A) Reflected Ratte Modell. Roten Blutkörperchen fanden sich außerhalb der Kapillaren im oberen Panel und dreiwertigem Eisen Punkte Lyse der roten Blutkörperchen abgeleitet wurden im unteren Bereich erkannt; (B) Reflected Steuern Tier. Roten Blutkörperchen weder dreiwertigem Eisen Punkte wurden gefunden. Skalieren von Balken = 100 µm (Links von A und B). Skalieren Sie Bars = 50 µm (rechten Seite von A und B). Modifizierte und wiederverwendete mit Erlaubnis10. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. EB-Ablagerung-Fluoreszenz-Bildgebung doppelt beschriftet. Links: Rattenmodell. Anzahl der EB-Moleküle von verletzten BBB zugespielt wurden erkannt (in rot); Rechten Seite: Kontrolle Tier. Keine EB-Moleküle wurden erkannt. DAPI blau wurde als Mount Medium verwendet. Skalieren von Balken = 100 µm. geändert und mit Erlaubnis10wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. MRI-SWI Bilder. Linken Bereich (A): Rattenmodell. Schwarze Pfeile bedeuten Hypointense Signale der CMHs; Rechten Seite (B): Kontrolle Tier. Es fanden sich keine Hypointense Signale. Modifizierte und wiederverwendete mit Erlaubnis10. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Studien über CMHs haben in den letzten Jahren zugenommen. Der Mechanismus der CMHs bleibt jedoch unklar, woraufhin Wissenschaftler, Tiermodellen zu etablieren, die diese besondere Situation zu simulieren. Z. B. Hoffmann Et al. entwickelt eine Hypoxie-induzierten CMHs Maus-Modell, das zeigt, dass CMHs durch Hypoxie und Störung der zerebrovaskulären Selbstregelung12verursacht werden. Reuter Et al. 5 CMHs Modell gegründet APP23 Transgene Mäuse, die die zerebrale Amyloid-Angiopathie (CAA) spielt eine wichtige Rolle in der Ätiologie der CMHs. Fisher Et Al. berichtet ein Mausmodell CMHs, die durch LPS Injektion9induziert wurde zeigte, die ergab, dass CMHs durch Entzündung2,13,14verursacht werden. Ebenso haben wir erfolgreich entwickelt ein Sub-akute CMHs Modell SD-Ratten mit LPS Injektion und habe festgestellt, dass Stickoxid-Synthase (NOS), vor allem neuronale NOS und endotheliale NOS, engagieren sich in der Ätiologie der CMHs, die Entzündung10 ergeben .
Der entscheidende Schritt unseres Protokolls ist die LPS-Einspritzung, die weitgehend in murinen Modellentwicklung von neuropsychiatrischen Störungen wie Depressionen15, Schizophrenie16, Parkinson-Krankheit17, Alzheimer-Krankheit verwendet worden ist 18und Prion Krankheit19. Nach unserer Kenntnis ist unser Einsatz einer einzelnen Dosis (1 mg/kg) viel höher als die in anderen Studien15,16,17,18,19angewendet wurde. Dies kann einen plausiblen Grund für die Sterblichkeit in der aktuellen Studie sein. LPS Dosis Modifikation für CMHs Induktion ein interessantes Thema sein mag, als verschiedene Dosen oder Injektion Zeitplan haben gezeigt, dass die Anzahl, Größe, Verteilung und Fortschreiten der CMHs2beeinflussen. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass die Verabreichung von LPS an Mäuse in einer Dosis von 3 mg/kg akute CMHs2 induziert.
Obwohl die Entwicklung der verschiedenen Tiermodellen Forschung Untersuchungen über CMHs erleichtert hat, müssen wir zugeben, dass diese Tiermodelle nicht den Prozess der klinischen CMHs simuliert. Zum Beispiel in unserem Rattenmodell sowie Fisher Mäusen Modell CMHs beobachtet im Kleinhirn, obwohl die meisten Lappen-Regionen beobachtet wurden (vor allem CAA-bezogen) und tief - oder infra-tentorial Standorten (vor allem Bluthochdruck-bezogen)20, 21. Wir haben keine Erklärung für diese Diskrepanz in der Distribution, obwohl Fisher und unser Team diese Beobachtung auf die Verletzlichkeit der zerebelläre Blutgefäße zu einer Entzündung führen.
In den meisten klinischen Fällen ergeben sich CMHs aus mehr als ein ätiologischer Faktor, obwohl Entzündung eine wichtige Rolle in der Ätiologie spielt. Studien mit Schwerpunkt auf mehrere Faktoren, die CMHs, anstelle von reinen Entzündung-induzierte CMHs, induzieren können somit hilfreicher simuliert diese Bedingung sein. Das LPS-Injektion-Modell könnte mit anderen zugrunde liegenden Faktoren um zu untersuchen, den Mechanismus der CMHs verwendet werden. Z. B. führten Fisher Et Al. einen vorläufige, noch interessanten Schritt mit alternden Mäusen injiziert mit LPS und gezeigt, dass Altern ist ein entscheidender Faktor, der das Gehirn anfälliger für Entzündungen-induzierte CMHs14machen könnte. Unserer Meinung nach ist die Bedeutung des vorliegenden Modells seine Kompatibilität mit anderen Faktoren in Tiermodellen für Altern14, Trauma22sowie chronische Krankheiten wie Hypercholesterinämie23oder transgene Modelle wie Hypertonie-24 wegen der Einfachheit, Zeit-Effizienz und Stabilität dieses Protokolls.
Patienten mit CMHs zeigen kognitive Rückgang neuropsychiatrischen Manifestationen und Schwindel, die die Verteilung der CMHs zugeordnet sind. Eine Einschränkung dieses Protokolls ist, dass nach LPS-Injektion, wir konnte nicht ausschließen die Auswirkungen der peripheren Entzündung auf das Verhalten der Ratten, obwohl eine Abnahme im Sozialverhalten und wühlen (natürliche eigenwirkung Nagetier reflektieren die Beeinträchtigung der täglichen Aktivitäten) wurden beobachtet. Weitere sind Studien über Möglichkeiten zur Verbesserung unserer Verfahren zur Erzeugung einer CMHs Tiermodell, z. B. Methode der Injektion von LPS oder Zeitplan der Beobachtung, von gerechtfertigt.
Dennoch kann dieser einfache, kostengünstige und stabile CMHs Mausmodell induziert durch LPS Injektion von Forschern in der Ätiologie der CMHs Aufklärung genutzt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Lehrer Jian Feng Lei und Kollegen aus Capital Medical University zur Orientierung während der MRT. Wir danken auch Jing Zeng von der Abteilung für Neurologie, das zweite Volk Krankenhaus von Yichang für technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L-2630 | for inflammation induction |
| EB | Sigma-aldrich | E2129 | for EB leakage detection |
| DAPI dying solution | Servicbio | G1012 | count medium for IF |
| Perl’s Prussian staining | Solarbio | G1424 | Kit for Prussian staining |
| HE staining | Solarbio | G1120 | Kit for HE staining |
| chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 47335U | For anesthesia |
| phosphate buffer saline (PBS) | Solarbio | P1022 | a kind of buffer solution commonly used in experiment |
| 0.9% saline solution | Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China | solution for perfusion | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | a kind of solution commonly used for fixation |
| 20% sucrose solution | Solarbio | G2461 | a kind of solution commonly used for fixation |
| 30% sucrose solution | Solarbio | G2460 | a kind of solution commonly used for fixation |
| vet ointment | Solcoseryl eye gel, Bacel, Switzerland | for rat's eyes protection |
References
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