Summary
Vi presenterar ett protokoll för att inducera och upptäcka CMHs orsakas av LPS injektion hos Sprague-Dawley-råttor, som kan utnyttjas i framtiden forskning utredningar på patogenesen av CMHs.
Abstract
Cerebrala microhemorrhages (CMHs) är vanliga hos äldre patienter och är korrelerade till olika neuropsykiatriska störningar. Etiologin till CMHs är komplex, och neuroinflammation är ofta observeras som en samtidig förekomst. Här, vi beskriver en subakut CMHs råtta modell induceras av lipopolysackarid (LPS) injektion, samt en metod för att upptäcka CMHs. systemisk LPS injektion är relativt enkelt, ekonomiskt och kostnadseffektivt. En stor fördel med LPS injektion är dess stabilitet att framkalla inflammation. CMHs orsakas av LPS injektion kunde ha upptäckts av brutto observation, hematoxylin och eosin (han) färgning, Perl's Prussian färgning, Evans blå (EB) dubbel-märkning och magnetisk resonanstomografi-känslighet vägt bildteknik (MRI-SWI). Slutligen diskuteras också andra metoder för att utveckla CMHs djurmodeller, inklusive deras fördelar eller nackdelar, i denna rapport.
Introduction
Klassiskt cerebrala microhemorrhages (CMHs) avser små perivaskulär insättningar av blod nedbrytningsprodukter såsom hemosiderin från röda blodkroppar i hjärnan1. Enligt studien Skanna Rotterdam hittades CMHs i nästan 17,8 procent av personer i åldrarna 60 – 69 år och 38,3% i de över 80 år2. Prevalensen av CMHs hos äldre är relativt hög, och en korrelation mellan ansamling av CMHs och kognitiva och neuropsykiatriska dysfunktion har varit etablerade3,4. Flera djurmodeller av CMHs har nyligen rapporterats, inklusive gnagare modeller induceras av typ IV kollagenas stereotaxic injektion5, APP transgena6, β-N-methylamino-L-alanin exponering7och hypertoni8, med CMHs induceras av systemisk inflammation som en av de mest väl accepterade val. Fisher et al. 9 används först LPS härrör från Salmonella typhimurium för att utveckla en akut CMHs musmodell. Därefter redovisas samma grupp utvecklingen av en subakut CMHs musmodell med samma strategi2.
LPS är ansedd som en standardiserad inflammatoriskt stimulus via intraperitoneal injektion. Tidigare studier har bekräftat att LPS injektion kan orsaka neuroinflammation vilket återspeglas av stora mängder mikroglia och Astrocyten aktivering i djur modeller2,10. Dessutom varit en positiv korrelation mellan aktivering av neuroinflammation aktivering och antalet CMHs etablerade2,10. Baserat på dessa tidigare studier, uppmanades vi att utveckla en CMHs råtta modell av intraperitoneal injektion av LPS.
Framsteg inom detektering tekniker har resulterat i en ökning av antalet forskning utredningar på CMHs. Mest allmänt erkända metoder för att upptäcka CMHs inkluderar påvisande av röda blodkroppar av hematoxylin och eosin (han) färgning, järnklorid järn upptäckt av berlinerblått färgning9, upptäckt av Evans blå (EB) nedfall av immunofluorescens Imaging och 7,0 Tesla magnetkamera-känslighet vägt imaging (MRI-SWI)10. Föreliggande studie syftar till att utveckla en metod för screening för CMHs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av djur vård och användning kommittén (ACUC) av den PLA armén General Hospital.
1. material
- Beredning av LPS injektion
- Tillsätt 25 mL destillerat vatten till 25 mg av LPS pulver härrör från S. typhimurium till en slutlig koncentration av 1 mg/mL. Lagra injektionen i ett sterilt rör vid 4 ° C.
Varning: LPS är giftiga. - Bered en 2% EB i normala 0,9% koksaltlösning att hålla EB injektion vid arbetande koncentration.
- Tillsätt 25 mL destillerat vatten till 25 mg av LPS pulver härrör från S. typhimurium till en slutlig koncentration av 1 mg/mL. Lagra injektionen i ett sterilt rör vid 4 ° C.
2. djur
- Administrera LPS till hanråttor Sprague-Dawley (SD), åldern 10 veckor (Genomsnittlig vikt: 280 ± 20 g) av intraperitoneal injektion.
FÖRSIKTIGHET: Om råttor som köps från en annan organisation, sedan den adaptiva fasen bör inte vara mindre än 7 dagar.
3. LPS injektioner
- Injicera LPS intraperitonealt i varje råtta vid dosen 1 mg/kg, och återgå råttorna till deras hem bur.
Obs: Anestesi är inte nödvändigt. - Sex timmar senare, injicera samma dos av LPS injektion i råttor.
- Sexton timmar senare injicera samma dos av LPS i råttor.
FÖRSIKTIGHET: Injicera SD råttor med LPS vid en dos på 1 mg/kg kan resultera i en 5% dödlighet. Dödligheten kan ytterligare öka hos yngre eller äldre råttor eller dräktiga honråttor. - Återgå råttorna till sina burar efter LPS injektion och ge ad libitum tillgång till mat och dryck.
Obs: Råttor kommer att ställa ut en distinkt systemisk inflammatorisk reaktion, och därför är det viktigt att burarna förblir rena hela experimentet. Råttor ska ofta (2 x dag) övervaka för vikt, allmänna utseende och attityd efter den första LP-skivor-injektionen. Om råttorna börjar att ställa ut en krökt kroppshållning, ovilja att flytta, betydande viktminskning (> 20%), porphyrin färgning som de vara humant euthanized före den 7 dag EB studie slutpunkt.
4. provtagning
- EB injektion
- Sju dagar efter den första injektionen, söva råtta av intraperitonealt enligt din godkända IACUC protokoll.
- Vänta 1 – 2 min tills råttorna inte visar hornhinnan reflex svar. Utföra en 5 – 8 mm-djup hjärt punktering på varje råtta; puncturing skall vara 5 mm till vänstermarginalen i bröstbenet på 3rd och 4th interkostaler utrymme.
- Vänta tills blod återhämtning observeras och sedan injicera EB vid en dos på 0,2 mL/100 g kroppsvikt i vänster hjärta ventrikeln.
FÖRSIKTIGHET: Hjärt punktering och EB injektion bör noggrant utföras. EB kan injiceras i brösthålan eller hjärtsäcken istället för den vänstra hjärta ventrikeln.- Suga tillbaka med ett tomt rör och ersätta denna volym med en EB röret före injektion för att minska felmarginalen (t.ex., injektion till bröstkorgen av fel).
- Håll råttan i ryggläge i 10 min.
Obs: Om provet inte används för att upptäcka EB läckage i immunofluorescens imaging, sedan detta steg kan utelämnas.
- Brutto observation
- Utföra hjärt perfusioner med iskall 1 M fosfat buffert saltlösning (PBS) för att rensa cerebral vaskulatur och hjärnor.
- Med en skalpell, gör ett buk snitt över hela längden av membranet.
- Skär genom revben bara vänster i bröstkorgen mittlinjen.
- Öppna upp brösthålan. Använda klämmor att exponera hjärtat och underlätta dränage av blod och andra vätskor.
- Håll stadigt hjärtat med pincett (det bör fortfarande slog hjärtat), direkt infoga en nål in i den utskjutande delen av vänster kammare att utvidga detta till ca 5 mm. säkra nålen på den positionen genom fastspänning nära införselorten.
FÖRSIKTIGHET: Omfattar inte överdrivet nålen, eftersom det kan tränga igenom innerväggen och äventyrar cirkulationen av lösningar. - Släpp ventilen för att tillåta flöde iskall PBS lösningen (200 – 300 mL) i en långsam och stadig takt på cirka 20 mL/min med en perfusion pump. Om djuren kräver fixering i stället för brutto observation, sedan använda samma dos av iskall 0,9% koksaltlösning.
- Med vass sax, gör ett snitt i atrium, att säkerställa att lösningen kontinuerligt flödar. Om vätskan inte flödar fritt eller kommer från djurets näsborrar eller munnen, flytta nålen.
- Skärmen för CMHs av brutto observation.
Obs: Om provet inte används i beräkningen av antalet CMHs av brutto observation, sedan detta steg kan utelämnas.
- Utföra hjärt perfusioner med iskall 1 M fosfat buffert saltlösning (PBS) för att rensa cerebral vaskulatur och hjärnor.
- Fixering
- Utföra hjärt perfusioner med iskall. 0,9% koksaltlösning (200 – 300 mL) att rensa den cerebrala vaskulatur och hjärnor.
- Utföra hjärt perfusioner med iskall 4% PARAFORMALDEHYD för fixering.
- Halshugga råtta, isolera hjärnan och fördjupa hjärnan i 20% sackaroslösning för minst 6 h.
- Ändra lösningen till 30% sackaros och fix för en annan 6 h.
- Förbereda 10 mm tjock hjärnans vävnader sektioner med en kryostaten.
5. han färgning
Obs: Denna procedur utförs med en han färgning Kit.
- Tvätta objektglasen i destillerat vatten.
- Fläcken i hematoxylin lösning för 8 min. tvätta i rinnande vatten i 5 min.
- Differentiera i 1% syra alkohol för 30 s. tvätta i rinnande vatten i 1 min.
- Bets i 0,2% ammoniak vatten (blåelse) eller mättade litium karbonat lösning för 30 s till 1 min. tvätta i rinnande vatten i 5 min.
- Skölj i 95% alkohol (10 dips).
- Motfärg med eosin lösning för 30 s till 1 min.
- Torka genom 95% alkohol, två förändringar i absolut alkohol, för 5 min varje.
- Tydlig i xylen för 30 s.
- Montera med Liu: s metod9.
- Analysera med brightfield fluorescens Mikroskop.
Obs: röda blodkroppar släppt från blodkärl, vilka är komponenterna i CMHs, visas i röd-orange under han färgning.
6. Perl berlinerblått färgning
Obs: Denna procedur utförs med en Perls färgning Kit.
- Tvätta diabilder med destillerat vatten.
- Fläcken i reaktion lösning med lika delar blandning av kaliumferrocyanid och saltsyra i 10 min.
- Torkar ut, rensa, montera och analysera bilderna enligt beskrivningen i steg 5,7 – 5.10.
7. EB dubbel-färgning
Obs: Detta förfarande följer steg 4.1.3.
- Tvätta objektglas med PBS tre gånger för 5 min varje.
- Odling av objektglas med 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) lösning för 15 min i rumstemperatur.
- Tvätta i bilderna med PBS lösning tre gånger för 5 min varje, och montera bilder med PBS-glycerol lösning.
- Analysera bilder på fluorescens Mikroskop. EB nedfall indikeras med röd fluorescens; atomkärnor indikeras med blå fluorescens.
8. MRI-SWI
- Utföra MRI på en 7-T magnet utrustad med ett aktivt skärmad gradient system (16 cm inre diameter).
- Sju dagar efter behandling, söva råttorna vid ansiktsmask inandning av 1,5 – 2,0% isofluran använder ett system med isofluran i narkos.
- Tillämpa vet salva till ögonen på råttan att förhindra torrhet under anestesi.
- Hålla råttorna i liggande ställning och göra en MRI-SWI-genomsökning.
- Hämta SWI vägt skanningar med en snabb-snurrandet ekar sekvensen med följande parametrar: eko tid (TE) 8 ms, upprepning tid (TR) 40 ms, knäppa vinkel = 12°, synfält (FOV) 35 mm × 35 mm, förvärv matrix 384 × 384, att förvärva 1 mm tjocka skivor.
- Identifiera CMHs i MRI-SWI enligt Greenberg et al. 11, som innehöll följande kriterier: (1) en diameter ≤10 mm, och (2) cirkulär, isolerade och låg-signal intensiteten fläckar.
- Vid slutet av experimentet, avliva råttorna med metoden överdosering koldioxid (ett flöde på 6 L/min) eller 30% av behållarens volym.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CMHs kan upptäckas med olika metoder. De mest väl accepterade metoderna inkluderar följande: (1) brutto observation och bedömning av surface CMHs (visas i figur 1, övre panelen); (2) han färgning för påvisande av röda blodkroppar (visas i figur 2A, övre panelen) eller Prussian färgning upptäcka ferric järn härrör från Lys av röda blodkroppar (figur 2A, nedre panelen); (3) EB fördubblats färgning för detektion av EB nedfall härrör från BBB läckage (figur 3, vänster panel). (4) MRI-SWI påvisande av CMHs hypointensiva signaler (figur 4, vänstra panelen).
Figur 1: brutto observation av surface CMHs. Övre panelen (A): råtta modell; Nedre panelen (B): kontroll djur. Röda pilar betyder ytan CMHs. ändrad och återanvänds med tillstånd10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: han färgning och preussiska färgning bilder. (A) återspeglas råtta modell. Röda blodkroppar hittades utanför kapillärerna i övre panelen, och järnklorid järn punkter härrör från Lys av röda blodkroppar upptäcktes i nedre panel. (B) återspeglas styra djur. Varken röda blodkroppar eller järnklorid järn punkter hittades. Skala barer = 100 µm (vänstra panelen av A och B). Skala barer = 50 µm (högra panelen av A och B). Modifierade och återanvända med tillstånd10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Dubbla märkt EB nedfall fluorescens imaging. Vänstra panelen: råtta modell. Mängden EB-molekyler som läckt ut från skadade BBB upptäcktes (i rött); Högra panelen: kontroll djur. Ingen EB molekyler upptäcktes. DAPI i blått användes som mount medium. Skala barer = 100 µm. ändrad och återanvänds med tillstånd10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. MRI-SWI bilder. Vänstra panelen (A): råtta modell. Svarta pilar beteckna hypointensiva signaler av CMHs; Högra panelen (B): kontroll djur. Inga hypointensiva signaler hittades. Modifierade och återanvända med tillstånd10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskningsstudier om CMHs har ökat under de senaste åren. Mekanismen av CMHs förblir dock oklart, vilket fick forskarna att upprätta djurmodeller som simulerar denna speciella tillstånd. Till exempel Hoffmann o.a. utvecklat en hypoxi-inducerad CMHs mus-modell som visar att CMHs orsakas av hypoxi och störningar av cerebrovaskulära självregleringen12. Reuter m.fl. 5 etablerade en CMHs modell i APP23-transgena möss, som visade att cerebral amyloid angiopati (CAA) spelar en viktig roll i etiologi av CMHs. Fisher et al. rapporterade en CMHs musmodell som lockades av LPS injektion9, som avslöjade att CMHs orsakas av inflammation2,13,14. Likaså, vi har framgångsrikt utvecklat en subakut CMHs modell SD råttor med hjälp av LPS injektion och funnit att kväveoxid syntas (NOS), särskilt neurala NOS och endotel NOS, är involverade i etiologin av CMHs, vilket resultera i inflammation10 .
Det kritiska steget i vårt protokoll är LPS injektionen, som har använts i stor utsträckning utveckla murina modeller av neuropsykiatriska störningar såsom depression15, schizofreni16, Parkinsons sjukdom17, Alzheimers sjukdom 18och Prion sjukdom19. Till vår kunskap är vår användning av en enda dos (1 mg/kg) mycket högre än som tillämpades i andra studier15,16,17,18,19. Detta kan vara en trolig orsak till dödlighet i den aktuella studien. LPS dos modifiering för CMHs induktion kan vara ett intressant forskningsområde, som olika doser eller injektion schema har visat sig påverka antal, storlek, distribution, och progression av CMHs2. En tidigare studie har visat att administrering av LPS till möss med en dos på 3 mg/kg inducerar akut CMHs2.
Även om utvecklingen av olika djurmodeller har underlättat forskning undersökningar på CMHs, måste vi erkänna att dessa modeller inte gör simulera processen för kliniska CMHs. Till exempel CMHs i vår råtta modell, samt Fishers möss modell, observerades i lillhjärnan, även om de flesta observerades i lobära regioner (CAA-relaterat) och djup - eller infra-tentorial platser (huvudsakligen hypertoni-relaterade)20, 21. vi har ingen förklaring till denna skillnad i distribution, även om både Fisher och vårt team attributet denna observation att sårbarheten av cerebellär blodkärl till inflammation.
I de flesta kliniska fall resultera CMHs från mer än en etiologisk faktor, även om inflammation spelar en viktig roll i dess etiologi. Studier med fokus på flera faktorer som inducerar CMHs, i stället för ren inflammation-inducerad CMHs, kan alltså vara mer till hjälp för att simulera detta tillstånd. LPS injektion modellen kan användas med andra underliggande faktorer för att undersöka mekanismen av CMHs. Till exempel, genomförde Fisher et al. en preliminär, ännu intressant steg med åldrande möss injiceras med LPS och visat att åldrande är en viktig faktor som kunde göra hjärnan mer mottagliga för inflammation-inducerad CMHs14. Enligt vår mening är betydelsen av den nuvarande modellen dess kompatibilitet med andra faktorer i djurmodeller för åldrande14, trauma22, samt kroniska sjukdomar såsom hyperkolesterolemi23eller transgena modeller såsom hypertoni24 på grund av enkelheten, tid-effektivitet och stabilitet i detta protokoll.
Patienter med CMHs uppvisar kognitiv nedgång, neuropsykiatriska manifestationer och svindel, som är förknippade med distributionen av CMHs. En begränsning i detta protokoll är att efter LPS injektion, vi kunde inte utesluta perifer inflammation effekter på beteendet hos råttor, även om en minskning av sociala beteende och grävande (inneboende naturliga aktivitet av gnagare återspeglar den nedskrivning av dagliga aktiviteter) observerades. Ytterligare är studier på sätt att förbättra vår metod för att generera en CMHs djurmodell, t.ex. Metod för att injicera LPS eller schema för observation, berättigade.
Denna enkla, kostnadseffektiva och stabila CMHs murina modell induceras av LPS injektion kan dock utnyttjas av forskare i klarlägga etiologin av CMHs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar lärare Jian Feng Lei och kollegor från huvudstaden medicinska universitet för vägledning under MRI. Vi tackar också Jing Zeng från Institutionen för neurologi, folkets andra sjukhus i Yichang att ge teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L-2630 | for inflammation induction |
| EB | Sigma-aldrich | E2129 | for EB leakage detection |
| DAPI dying solution | Servicbio | G1012 | count medium for IF |
| Perl’s Prussian staining | Solarbio | G1424 | Kit for Prussian staining |
| HE staining | Solarbio | G1120 | Kit for HE staining |
| chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 47335U | For anesthesia |
| phosphate buffer saline (PBS) | Solarbio | P1022 | a kind of buffer solution commonly used in experiment |
| 0.9% saline solution | Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China | solution for perfusion | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | a kind of solution commonly used for fixation |
| 20% sucrose solution | Solarbio | G2461 | a kind of solution commonly used for fixation |
| 30% sucrose solution | Solarbio | G2460 | a kind of solution commonly used for fixation |
| vet ointment | Solcoseryl eye gel, Bacel, Switzerland | for rat's eyes protection |
References
- Sumbria, R. K., et al. A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds. J Neuroinflammation. 13 (1), 218 (2016).
- Vernooij, M. W., et al. Prevalence and risk factors of cerebral microbleeds the Rotterdam Scan Study. Neurology. 70 (14), 1208-1214 (2009).
- Pettersen, J. A., et al. Microbleed topography, leukoaraiosis, and cognition in probable Alzheimer disease from the Sunnybrook dementia study. Archives of Neurology. 65 (6), 790-795 (2008).
- Xu, X., et al. Cerebral microbleeds and neuropsychiatric symptoms in an elderly Asian cohort. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 88 (1), 7-11 (2017).
- Mcauley, G., Schrag, M., Barnes, S., Obenaus, A., Dickson, A., Kirsch, W. In vivo iron quantification in collagenase-induced microbleeds in rat brain. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (3), 711-717 (2012).
- Reuter, B., et al. Development of cerebral microbleeds in the APP23-transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy-a 9.4 tesla MRI study. Frontiers in Aging Neuroscience. 8 (8), 170 (2016).
- Scott, L. L., Downing, T. G. A single neonatal exposure to BMAA in a rat model produces neuropathology consistent with neurodegenerative diseases. Toxins. 10 (1), E22 (2018).
- Toth, P., et al. Aging exacerbates hypertension-induced cerebral microhemorrhages in mice: role of resveratrol treatment in vasoprotection. Aging Cell. 14 (3), 400-408 (2015).
- Liu, S., et al. Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (11), 767-773 (2014).
- Zeng, J., Zhào, H., Liu, Z., Zhang, W., Huang, Y. Lipopolysaccharide induces subacute cerebral microhemorrhages with involvement of Nitric Oxide Synthase in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 27 (7), 1905-1913 (2018).
- Greenberg, S. M., et al. Cerebral microbleeds: A guide to detection and interpretation. Lancet Neurology. 8 (2), 165-174 (2009).
- Hoffmann, A., et al. High-Field MRI reveals a drastic increase of hypoxia-induced microhemorrhages upon tissue reoxygenation in the mouse brain with strong predominance in the olfactory bulb. Plos One. 11 (2), e0148441 (2016).
- Sumbria, R. K., et al. Effects of phosphodiesterase 3A modulation on murine cerebral microhemorrhages. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 114 (2017).
- Sumbria, R. K., et al. Aging exacerbates development of cerebral microbleeds in a mouse model. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 69 (2018).
- Mello, B. S. F., et al. Sex influences in behavior and brain inflammatory and oxidative alterations in mice submitted to lipopolysaccharide-induced inflammatory model of depression. Journal of Neuroimmunol. 320, 133-142 (2018).
- Souza, D. F. D., et al. Changes in astroglial markers in a maternal immune activation model of schizophrenia in Wistar rats are dependent on sex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (489), (2015).
- Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The Lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
- El-Sayed, N. S., Bayan, Y. Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 822 (822), 107-118 (2015).
- Combrinck, M. I., Perry, V. H., Cunningham, C. Peripheral infection evokes exaggerated sickness behaviour in pre-clinical murine prion disease. Neuroscience. 112 (1), 7-11 (2002).
- Pantoni, L. Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges. Lancet Neurology. 9 (7), 689-701 (2010).
- Rosand, J., et al. Spatial clustering of hemorrhages in probable cerebral amyloid angiopathy. Annals of Neurology. 58 (3), 459-462 (2005).
- Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1025-1035 (2017).
- Kraft, P., et al. Hypercholesterolemia induced cerebral small vessel disease. Plos One. 12 (8), e0182822 (2017).
- Schreiber, S., Bueche, C. Z., Garz, C., Baun, H. Blood brain barrier breakdown as the starting point of cerebral small vessel disease? - New insights from a rat model. Experimental & Translational Stroke Medicine. 5 (1), 4 (2013).
