Summary
我们提出了一种诱导和检测杜勒大鼠 LPS 注射液引起的中草药的实验方案, 可用于今后中草药的发病机制研究。
Abstract
脑 microhemorrhages (中草药) 在老年患者中是常见的, 与各种神经精神障碍相关。中草药的病因是复杂的, 神经炎症经常被观察作为共同发生。本文介绍了一种由脂多糖 (LPS) 注射液诱导的亚急性中草药大鼠模型, 以及一种检测中草药的方法. 系统性 LPS 注射液相对简单、经济、经济实惠。LPS 注射液的一个主要优点是它的稳定性导致炎症。通过观察、苏木精和伊红 (he) 染色、Perl 普鲁士染色、埃文斯蓝 (EB) 双重标记和磁共振成像-易感性加权成像 (MRI-中草药) 技术, 可以检测到 LPS 注射液引起的。最后, 本报告还讨论了其他开发中草药动物模型的方法, 包括它们的优点和/或缺点。
Introduction
经典脑 microhemorrhages (中草药) 是指血液降解产物的微小血管周围沉积物, 如含铁血黄素从脑1中的红细胞。根据鹿特丹扫描研究, 中草药可以发现在近17.8% 的人60–69岁和38.3% 在那些80年2。中草药在老年人中的患病率较高, 中草药的积累与认知和神经精神功能障碍之间的相关性已建立3,4。最近报道了中草药的几种动物模型, 包括 IV 型胶原酶立体定向注射液5、应用转基因6、β n-甲基氨基-l-丙氨酸暴露7、高血压8等诱发的啮齿动物模型,由全身炎症诱发的中草药是最接受的选择之一。费舍尔等。9首次使用的 LPS 来源于鼠伤寒沙门氏菌, 开发出一种急性中草药小鼠模型。随后, 同一组报告了使用相同方法2的亚急性中草药小鼠模型的发展。
LPS 被认为是一个标准化的炎症刺激通过腹腔注射。先前的研究证实, LPS 注射液可能导致神经炎症, 在动物模型2,10中大量的小胶质细胞和星形胶质细胞活化反应。此外, 神经炎症活化激活与中草药数量之间有正相关关系, 已建立2、10。在前人研究的基础上, 通过腹腔注射 LPS, 建立了中草药大鼠模型。
检测技术的进步导致了中草药研究调查的数量增加。最广泛公认的检测中草药的方法包括通过苏木精和伊红 (he) 染色检测红血球, 普鲁士蓝染色9检测铁铁, 通过免疫荧光法检测埃文斯蓝 (EB) 沉积物成像和7.0 特斯拉磁共振成像-易感性加权成像 (MRI-社会工作)10。本研究旨在开发一种中草药的筛选方法。
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Protocol
这里描述的所有方法都已获得中国人民解放军陆军总医院动物护理和使用委员会 (ACUC) 的批准。
1. 材料
- LPS 注射液的制备
- 将25毫升蒸馏水添加到25毫克的 LPS 粉末中, 从鼠伤寒到最终浓度为1毫克/毫升。将注射剂储存在4摄氏度的无菌管中。
注意: LPS 是有毒的。 - 在正常0.9% 盐水溶液中制备 2% eb 溶液, 以保持 eb 注射液在工作浓度。
- 将25毫升蒸馏水添加到25毫克的 LPS 粉末中, 从鼠伤寒到最终浓度为1毫克/毫升。将注射剂储存在4摄氏度的无菌管中。
2. 动物
- 将 LPS 杜勒 (SD) 大鼠, 10 周 (平均体重: 280 ± 20 g) 腹腔注射。
注意: 如果从其他组织购买大鼠, 则自适应阶段不应少于7天。
3. LPS 注射
- 注射 LPS 腹腔到每只老鼠的剂量1毫克/千克, 并返回到他们的家庭笼鼠。
注意: 麻醉是不必要的。 - 六小时后, 注射相同剂量的 LPS 注射到大鼠。
- 十六小时后, 注射相同剂量的 LPS 到大鼠。
注意: 在剂量为1毫克/千克的情况下注射 LPS 的 SD 大鼠可能导致5% 的死亡率。年轻或年老的大鼠或怀孕雌性大鼠的死亡率可能会进一步增加。 - 在 LPS 注射后将老鼠送回笼子, 并提供广告随意食物和饮料的机会。
注意: 大鼠会表现出明显的全身炎症反应, 因此在整个实验过程中保持笼的清洁至关重要。大鼠应经常 (2x 天) 监测体重, 一般的外观和第一次 LPS 注射后的态度。如果老鼠开始表现出驼背的姿势, 不愿意移动, 显著的重量损失 (> 20%), 卟啉染色, 他们在7天 EB 研究结束点之前人道地安乐死。
4. 样品收集
- EB 注射液
- 第一次注射后七天, 根据您批准的 IACUC 协议, 麻醉鼠腹腔。
- 等待, 直到大鼠不显示角膜反射反应。对每只老鼠进行5–8毫米深心脏穿刺;穿刺点应在第三和第四肋间空间的胸骨左边缘5毫米。
- 等到血液恢复观察, 然后注射 EB 的剂量 0.2 mL/100 g 体重到左心心室。
注意: 心脏穿刺和 EB 注射液应小心执行。EB 可能被注射到胸腔或心包, 而不是左心心室。- 吸回与一个空管, 并在注射前用 EB 管替换这个体积, 以帮助降低故障率 (例如, 通过错误注射到肋笼)。
- 将老鼠放在仰卧位处10分钟。
注意: 如果样本未用于检测 EB 在免疫荧光成像中的泄漏, 则可能省略此步骤。
- 总观察
- 使用冰冷1米磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 执行心脏输液, 清除脑血管和大脑。
- 使用手术刀, 使腹部切口横跨整个隔膜长度。
- 穿过肋骨左中线的肋骨。
- 打开胸腔。使用夹子暴露心脏和促进血液和其他流体的引流。
- 当用钳子固定心脏 (心脏仍应跳动) 时, 直接将针头插入左心室的突起处, 将其延伸至约5毫米. 在靠近入口的位置固定针头。
注意: 不要过度延长针头, 因为它可以穿透内部墙壁, 并危及解决方案的循环。 - 使用灌注泵, 释放阀门以使流动冰冷 PBS 溶液 (200–300 ml) 以缓慢稳定的速度在20毫升/分钟左右。如果动物需要固定而不是大体观察, 那么使用相同剂量的冰冷0.9% 盐水溶液。
- 使用锋利的剪刀, 在中庭进行切口, 确保溶液持续流动。如果流体不自由流动或来自动物的鼻孔或嘴, 重新定位针头。
- 通过粗略观察中草药屏幕。
注: 如果样本未用于计算中草药的数量, 则可以省略此步骤。
- 使用冰冷1米磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 执行心脏输液, 清除脑血管和大脑。
- 固定
- 使用冰冷0.9% 盐水溶液 (200–300 mL) 执行心脏输液, 清除脑血管和大脑。
- 使用冰冷4% 多聚甲醛进行心脏输液固定。
- 斩首鼠, 隔离大脑, 并将大脑浸入20% 蔗糖溶液中至少6小时。
- 将溶液改成30% 蔗糖, 再固定6小时.
- 使用冰冻切片器制备10毫米厚的脑组织切片。
5. 染色
注意: 此过程使用 he 染色试剂盒进行。
- 用蒸馏水冲洗滑梯。
- 在苏木精溶液中染色8分钟, 在自来水中冲洗5分钟。
- 在1% 酸酒精中区分三十年代. 自来水冲洗1分钟。
- 在0.2% 氨水 (发蓝) 或饱和碳酸锂溶液中染色, 三十年代至1分钟. 在自来水中冲洗5分钟。
- 在95% 酒精 (10 dip) 中冲洗。
- 复与伊红解决方案, 三十年代至1分钟。
- 脱水通过95% 酒精, 两个变化的绝对酒精, 每5分钟。
- 三十年代在二甲苯清除。
- 使用刘的方法9安装。
- 使用明场荧光显微镜进行分析。
注: 从血管中释放的红细胞, 是中草药的组成部分, 在他染色下出现在红橙色。
6. Perl 普鲁士蓝染色
注意: 此过程使用波尔斯染色试剂盒进行。
- 用蒸馏水冲洗滑梯。
- 黄血盐和盐酸等部位混合物的反应溶液中的染色10分钟。
- 如步骤5.7–5.10 所述, 脱水、清除、装载和分析幻灯片。
7. EB 双色染色
注意: 此过程遵循步骤4.1.3。
- 用 PBS 洗涤幻灯片三次, 每次5分钟。
- 在室温下孵育 4 ', 6-diamidino-2-苯基吲哚 (DAPI) 溶液15分钟的幻灯片。
- 使用 pbs 解决方案三次洗涤幻灯片, 每次5分钟, 用 pbs-甘油解决方案安装幻灯片。
- 在荧光显微镜上分析图像。EB 沉积用红色荧光表示;细胞核由蓝色荧光表示。
8. 磁共振成像
- 在配备主动屏蔽梯度系统 (16 厘米内径) 的7吨磁铁上执行 MRI 检查。
- 治疗后七天, 用异氟醚麻醉系统面罩吸入1.5–2.0% 异氟醚麻醉大鼠。
- 将兽医软膏涂抹在大鼠眼睛上, 以防麻醉时干燥。
- 保持大鼠在容易的位置, 并进行磁共振成像-社会工作扫描。
- 使用以下参数获得 angle=12°加权扫描: 回波时间 (TE) 8 ms, 重复时间 (TR) 40 ms, 翻转, 视场 (FOV) 35 毫米 x 35 毫米, 采集矩阵 384 x 384, 获取1毫米厚的切片。
- 根据格林伯格等, 确定 MRI 中草药。11, 其中包括以下标准: (1) 直径为≤10 mm, (2) 圆形、隔离和低信号强度点。
- 在实验结束时, 安乐死使用过量二氧化碳 (在6升/分钟或30% 的容器体积) 方法的老鼠。
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Representative Results
中草药可以使用各种方法检测到。最接受的方法包括: (1) 表面中草药的总观测和评估 (如图 1、上部板所示);(2) he 染色检测红细胞 (图2A、上部板) 或普鲁士染色检测红细胞裂解产生的铁 (图 2A、下部板);(3) eb 双重染色检测从 BBB 泄漏中提取的 eb 沉积物 (图 3, 左面板);(4) MRI-中草药 hypointense 信号检测 (图 4, 左面板)。
图 1: 表面中草药的粗略观察.上部板 (A): 大鼠模型;下部面板 (B): 控制动物。红色箭头表示表面中草药. 修改并重新使用权限10。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 他染色和普鲁士染色图像.(A) 反射鼠模型。在上部板的毛细血管外发现红细胞, 在下部板中检测出红细胞裂解产生的铁点;(B) 反射控制动物。没有发现红血球和铁点。刻度条 = 100 µm (A 和 B 的左面板)。刻度条 = 50 µm (右面板 A 和 B)。修改并重新使用权限10。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图3。双标记 EB 沉积荧光成像.左面板: 大鼠模型。检测到从受损 BBB 中泄漏的 EB 分子量 (红色);右面板: 控制动物。未检测到 EB 分子。蓝色的 DAPI 被用作安装介质。缩放栏 = 100 µm. 已修改并使用权限10重新使用。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图4。磁共振图像.左面板 (A): 大鼠模型。黑色箭头表示中草药的 hypointense 信号;右面板 (B): 控制动物。未发现 hypointense 信号。修改并重新使用权限10。请点击这里查看这个数字的更大版本.
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Discussion
中草药的研究在过去几年中有所增加。然而, 中草药的机制仍然不清楚, 促使科学家建立模拟这种特殊情况的动物模型。例如, 霍夫曼等。开发了缺氧诱导的中草药小鼠模型, 表明中草药是由缺氧和脑血管自动调节12的破坏引起的。路透社等。5在 APP23-transgenic 小鼠中建立了中草药模型, 表明脑淀粉样血管病 (CAA) 在中草药病因中起着重要作用. 费舍尔等报道了由 LPS 注射9诱导的中草药小鼠模型,发现中草药是由炎症2,13,14引起的。同样, 我们成功地在 SD 大鼠中使用 LPS 注射液开发了亚急性中草药模型, 发现一氧化氮合酶 (nos), 特别是神经 nos 和内皮 nos, 参与中草药的病因, 导致炎症10.
我们的协议的关键步骤是 LPS 注射, 已广泛应用于开发小鼠神经精神障碍的模型, 如抑郁症15, 精神分裂症16, 帕金森病17, 阿尔茨海默氏症18和朊病毒病19。据我们所知, 我们使用单一剂量 (1 毫克/千克) 比其他研究15,16,17,18,19的应用要高得多。这可能是目前研究中死亡的一个合理原因。中草药诱导的 LPS 剂量修饰可能是一个有趣的研究课题, 因为不同剂量或注射时间表已经显示影响中草药2的数量、大小、分布和级数。先前的一项研究表明, LPS 对小鼠的施用剂量为3毫克/千克, 诱发急性中草药2。
虽然不同动物模型的发展促进了对中草药的研究调查, 但我们不得不承认这些动物模型并没有模拟临床中草药的过程。例如, 在我们的大鼠模型, 以及费舍尔的小鼠模型中, 中草药在小脑中观察到, 虽然大多数在叶区 (主要与 CAA 相关) 和深或天幕位置 (主要与高血压相关)20,21. 我们对分配方面的差异没有任何解释, 尽管费舍尔和我们的团队都将这一观察归因于小脑血管易受炎症的脆弱性。
在大多数临床病例中, 中草药是由多个病因因素引起的, 虽然炎症在其病因中起着重要作用。研究侧重于诱导中草药的多种因素, 而不是单纯的炎症诱导的中草药, 因此可以在模拟这种情况下更有帮助。LPS 注射模型可与其他潜在因素一起使用, 研究中草药的机理。例如, 费舍尔等已经进行了一个初步的, 但有趣的步骤与衰老小鼠注射 LPS, 并证明衰老是一个关键因素, 可能使大脑更容易受到炎症诱发的中草药14。我们认为, 目前的模式的意义是它与其他因素的相容性动物模型老化14, 创伤22, 以及慢性疾病, 如高胆固醇血症23, 或转基因模型, 如高血压24由于本协议的简单性、时效性和稳定性。
中草药患者显示认知减退、神经精神表现和眩晕, 这与中草药的分布有关。本议定书的一个局限性是, 在 LPS 注射液后, 我们不能排除周围炎症对大鼠行为的影响, 虽然社会行为和挖洞的减少 (动物的内在自然活动反映每日活动的损害) 被观察到。进一步研究如何改进我们生成中草药动物模型的方法,例如注射 LPS 或观察表的方法。
然而, 这种简单、经济、稳定的中草药小鼠模型可能被研究人员用来阐明中草药的病因。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢健丰老师和首都医科大学的同事在核磁共振成像方面的指导。我们还感谢宜昌第二人民医院神经病学系提供技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L-2630 | for inflammation induction |
| EB | Sigma-aldrich | E2129 | for EB leakage detection |
| DAPI dying solution | Servicbio | G1012 | count medium for IF |
| Perl’s Prussian staining | Solarbio | G1424 | Kit for Prussian staining |
| HE staining | Solarbio | G1120 | Kit for HE staining |
| chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 47335U | For anesthesia |
| phosphate buffer saline (PBS) | Solarbio | P1022 | a kind of buffer solution commonly used in experiment |
| 0.9% saline solution | Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China | solution for perfusion | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | a kind of solution commonly used for fixation |
| 20% sucrose solution | Solarbio | G2461 | a kind of solution commonly used for fixation |
| 30% sucrose solution | Solarbio | G2460 | a kind of solution commonly used for fixation |
| vet ointment | Solcoseryl eye gel, Bacel, Switzerland | for rat's eyes protection |
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