Summary
Vi præsenterer en protokol for at fremkalde og registrere CMHs forårsaget af LP'ER injektion i Sprague-Dawley rotter, som kan udnyttes i fremtiden forskning undersøgelser om patogenesen af CMHs.
Abstract
Cerebral microhemorrhages (CMHs) er almindelig hos ældre patienter og er korreleret til forskellige neuropsykiatriske lidelser. Årsagen til CMHs er komplekse, og neuroinflammation er ofte observeret som en samtidig forekomst. Her, vi beskriver en sub-akutte CMHs rotte model induceret af LPS (LPS) injektion, samt en metode til påvisning af CMHs. systemisk LP'ER injektion er relativt enkel, økonomisk og omkostningseffektive. En væsentlig fordel ved LP'ER injektion, er dens stabilitet til at fremkalde betændelse. CMHs forårsaget af LP'ER injektion kunne påvises ved grov observation, hæmatoxylin og eosin (han) farvning, Perls preussiske farvning, dobbelt mærkning af Evans blå (EB) og magnetisk resonans-modtagelighed vægtet imaging (MRI-SWI) teknologi. Andre metoder for at udvikle CMHs dyremodeller, herunder deres fordele og ulemper, er endelig også behandles i denne rapport.
Introduction
Klassisk cerebral microhemorrhages (CMHs) henviser til lille perivascular aflejringer af blod nedbrydningsprodukter f.eks hemosiderin fra rød blod celler i hjernen1. Ifølge Rotterdam Skan undersøgelse, kunne CMHs findes i næsten 17,8% af personer i alderen 60-69 år og 38,3% i personer over 80 år2. Forekomsten af CMHs i ældre er forholdsvis høj, og en korrelation mellem ophobning af CMHs og kognitive og neuropsykiatriske dysfunktion har været etableret3,4. Flere dyremodeller for CMHs er for nylig blevet rapporteret, herunder gnavere modeller induceret af type IV collagenase stereotaxisk injektion5, APP transgene6, β-N-methylamino-L-alanin eksponering7og hypertension8, med CMHs induceret af systemisk inflammation som en af de mest godt accepteret valg. Fisher et al. 9 først brugt LP'ER afledt af Salmonella typhimurium for at udvikle en akut CMHs musen model. Efterfølgende, rapporteret den samme gruppe udviklingen af en subakut CMHs musen model ved hjælp af den samme metode2.
LP'ER betragtes som en standardiseret inflammatoriske stimulus via intraperitoneal injektion. Tidligere undersøgelser har bekræftet, at LPS injektion kan forårsage neuroinflammation, som afspejles af store mængder af mikroglia og astrocyte aktivering i dyre modeller2,10. Derudover har en positiv korrelation mellem aktivering af neuroinflammation aktivering og antallet af CMHs været etableret2,10. Baseret på disse tidligere undersøgelser, vi blev bedt om at udvikle en CMHs rotte model af intraperitoneal injektion af LP'ER.
Fremskridt i opdagelse teknologier har resulteret i en stigning i antallet af forskning undersøgelser på CMHs. Mest almindeligt anerkendt metoder til påvisning af CMHs omfatter påvisning af røde blodlegemer af hæmatoxylin og eosin (han) farvning, jern jern påvisning af preussiske blå farvning9, påvisning af Evans blå (EB) aflejring ved immunfluorescens billedbehandling, og 7,0 Tesla magnetisk resonans-modtagelighed vægtet imaging (MRI-SWI)10. Den nuværende undersøgelse sigter mod at udvikle en metode til screening for CMHs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af Animal Care og brug udvalg (ACUC) af PLA Army General Hospital.
1. materialer
- Forberedelse af LP'ER injektion
- Tilsættes 25 mL destilleret vand til 25 mg af LP'ER pulver stammer fra S. typhimurium til en endelig koncentration på 1 mg/mL. Butik injektion i sterile rør ved 4 ° C.
Forsigtig: LPS er giftigt. - Forbered en 2% EB løsning i normal 0,9% saltvand løsning til at holde EB injektion på arbejde koncentration.
- Tilsættes 25 mL destilleret vand til 25 mg af LP'ER pulver stammer fra S. typhimurium til en endelig koncentration på 1 mg/mL. Butik injektion i sterile rør ved 4 ° C.
2. dyr
- Administrere LP'ER til mandlige Sprague-Dawley (SD) rotter, alderen 10 uger (gennemsnitlig vægt: 280 g ± 20 g) af intraperitoneal injektion.
Forsigtig: Hvis rotter er købt fra en anden organisation, så den adaptive fase bør ikke være mindre end 7 dage.
3. LP'ER injektioner
- Tilføre hver rotte i en dosis på 1 mg/kg LP'ER intraperitoneal, og returnere rotter til deres hjem bur.
Bemærk: Anæstesi er ikke nødvendigt. - Seks timer senere, indsprøjtes den samme dosis af LP'ER injektion i rotter.
- Seksten timer senere indsprøjtes den samme dosis af LP'ER i rotter.
Forsigtig: Indsprøjtning SD rotter med LPS i en dosis på 1 mg/kg kan resultere i en 5% dødelighed. Dødeligheden kan stige yderligere i yngre eller ældre rotter eller gravid hunrotter. - Returnere rotter til deres bure efter LPS injektion og give ad libitum adgang til mad og drikke.
Bemærk: Rotter vil udstille en særskilt systemisk inflammatorisk respons, og derfor er det vigtigt at bure forblive ren hele eksperimentet. Rotter skal være ofte (2 x dag) overvågning for vægt, generelle udseende og attitude efter den første LP'ER injektion. Hvis rotter begynder at udstille en foroverbøjet kropsholdning, uvilje til at flytte, betydelige vægttab (> 20%), porfyrin farvning, de være humant aflives før 7-dages EB undersøgelse slutpunkt.
4. prøvetagning
- EB injektion
- Syv dage efter den første injektion, bedøver rotte af intraperitoneal efter din godkendte IACUC protokol.
- Vente 1-2 min, indtil rotterne ikke viser cornea refleks svar. Udføre en 5-8 mm-dybe hjerte punktering på hver rotte; det puncturing punkt bør være 5 mm til venstre margen af brystbenet på 3 og 4 intercostals plads.
- Vent, indtil blodet opsving er observeret, og derefter indsprøjtes EB i en dosis på 0,2 mL/100 g kropsvægt i venstre hjerte ventrikel.
Forsigtig: Hjerte punktering og EB injektion bør omhyggeligt udføres. EB kan injiceres i brysthulen eller hjertesækken i stedet for den venstre hjerte ventrikel.- Sutter tilbage med en tom tube og erstatte denne diskenhed med en EB tube før injektion til at reducere fejlrate (fx., indsprøjtning til brystkassen af fejl).
- Holde rotten i en liggende stilling i 10 min.
Bemærk: Hvis prøven ikke bruges til at påvise EB lækage i immunofluorescens imaging, så dette trin kan udelades.
- Brutto observation
- Udføre hjerte perfusions bruger iskold 1 M fosfat buffer saltvand (PBS) for at rydde cerebrale kar og hjerne.
- Ved hjælp af en skalpel, lave en abdominal snit på tværs af hele længden af mellemgulvet.
- Snit gennem ribben bare tilbage af brystkassen midterlinjen.
- Lukke sig op den brysthulen. Brug klemmer til at afsløre hjertet og at lette dræning af blod og andre væsker.
- Mens du stadig holder hjertet med pincet (hjertet skal stadig slå), direkte indsætte en nål ind i fremspring i den venstre ventrikel at udvide dette til omkring 5 mm. sikre nål på denne stilling ved fastspænding nær at indførselsstedet.
Forsigtig: Ikke overdrevent udvider nålen, da det kan gennembore den indvendige væg og kompromittere omsætning af løsninger. - Frigivelse ventil til at tillade flow iskold PBS løsning (200 – 300 mL) med en langsom og stabil hastighed på omkring 20 mL/min. ved hjælp af en perfusion pumpe. Hvis dyrene kræver fiksering i stedet for grov observation, derefter bruge den samme dosis af iskold 0,9% saltvand løsning.
- Bruger skarpe saks, gøre et snit i atrium, sikre at løsningen løbende flyder. Hvis væsken ikke flyde frit eller kommer fra dyrets næsebor eller munden, Flyt nålen.
- Skærmen for CMHs af brutto observation.
Bemærk: Hvis prøven ikke bruges i beregningen af antallet af CMHs af brutto observation, så dette trin kan udelades.
- Udføre hjerte perfusions bruger iskold 1 M fosfat buffer saltvand (PBS) for at rydde cerebrale kar og hjerne.
- Fiksering
- Udføre hjerte perfusions ved hjælp af iskold 0,9% saltvand løsning (200 – 300 mL) til at klare den cerebrale kar og hjerne.
- Udføre hjerte perfusions bruger iskold 4% PARAFORMALDEHYD til fiksering.
- Halshugge rotten, isolere hjernen og fordybe hjernen i 20% rørsukkeropløsning i mindst 6 timer.
- Ændre løsningen i 30% saccharose og fix for en anden 6 h.
- Forberede 10 mm tyk hjernen væv sektioner ved hjælp af en kryostaten.
5. han farvning
Bemærk: Denne procedure udføres ved hjælp af en han farvning Kit.
- Vask dias i destilleret vand.
- Pletten i hæmatoxylin løsning i 8 min. Skyl i rindende vand i 5 min.
- Differentiere i 1% syre alkohol i 30 s. vaskes i rindende vand i 1 min.
- Pletten i 0,2% ammoniak vand (blånelse) eller mættede lithium carbonat løsning til 30 s til 1 min. Skyl i rindende vand i 5 min.
- Skyl i 95% alkohol (10 dips).
- Kontrastfarve med eosin løsning til 30 s til 1 min.
- Dehydrere gennem 95% alkohol, to ændringer af absolut alkohol, i 5 min.
- Klart i xylen til 30 s.
- Montere ved hjælp af Lius metode9.
- Analysere ved hjælp af en brightfield fluorescens mikroskop.
Bemærk: røde blodlegemer frigivet fra blodkar, som er komponenter af CMHs, vises i rød-orange under han farvning.
6. Perl preussiske blå farvning
Bemærk: Denne procedure udføres ved hjælp af en Perls farvning Kit.
- Vask dias med destilleret vand.
- Pletten i reaktion løsning med lige dele blanding af kaliumhexacyanoferrat og saltsyre i 10 min.
- Dehydrere, klart, montere, og analysere diasene, som beskrevet i trin 5.7 – 5.10.
7. EB dobbelt-farvning
Bemærk: Denne procedure følger trin 4.1.3.
- Vask dias med PBS tre gange i 5 min.
- Inkuber dias med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) løsning for 15 min ved stuetemperatur.
- Vaske dias med PBS løsning tre gange i 5 min, og montere dias med PBS-glycerol løsning.
- Analysere billeder på et fluorescens mikroskop. EB deposition er angivet med rød fluorescens; kerner er angivet med blå fluorescens.
8. MR-SWI
- Udføre Mr på en 7-T magnet udstyret med et aktivt afskærmet gradient system (16 cm indvendig diameter).
- Syv dage efter behandling, bedøver rotter ved ansigtsmaske indånding af 1,5-2,0% isofluran ved hjælp af en isofluran anæstesi system.
- Anvende vet salve på øjnene af rotte at forhindre tørhed under anæstesi.
- Holde rotter i liggende stilling og udføre en MRI-SWI scanning.
- Få SWI vægtet scanninger ved hjælp af en fast-spin ekko sekvens ved hjælp af følgende parametre: echo tid (TE) 8 ms, gentagelse tid (TR) 40 ms, flip vinkel = 12°, field of view (FOV) 35 mm × 35 mm, erhvervelse matrix 384 × 384, for at erhverve 1 mm tykke skiver.
- Identificere CMHs i Mr-SWI ifølge Greenberg et al. 11, som omfattede følgende kriterier: (1) en diameter af ≤10 mm, og (2) cirkulære, isolerede og lav-signal intensitet steder.
- I slutningen af forsøget, aflive rotter ved hjælp af metoden overdosis kuldioxid (en strøm af 6 L/min.) eller 30% af beholderen volumen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CMHs kan påvises ved hjælp af forskellige metoder. De mest godt accepterede metoder omfatter følgende: (1) brutto observation og vurdering af overflade CMHs (vist i figur 1, øverste panel); (2) han farvning for påvisning af røde blodlegemer (vist i figur 2A, øverste panel) eller preussiske farvning afsløre jern jern stammer fra lysering af røde blodlegemer (figur 2A, nederste panel); (3) EB fordoblet farvning for påvisning af EB deposition stammer fra BBB lækage (figur 3, venstre panel); (4) Mr-SWI påvisning af CMHs hypointense signaler (figur 4, venstre panel).
Figur 1: brutto observation af overflade CMHs. Øverste panel (A): rotte model; Nederste panel (B): kontrol dyr. Røde pile betyde overflade CMHs. ændret og genbruges med tilladelse10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: han farvning og preussiske farvning billeder. (A) afspejlet rotte model. Røde blodlegemer blev fundet udenfor kapillærerne i øverste panel, og jern jern point stammer fra lysering af røde blodlegemer blev opdaget i nederste panel; (B) afspejlet kontrollere dyr. Hverken røde blodlegemer eller jern jern punkter blev ikke fundet. Skalere barer = 100 µm (venstre panel af A og B). Skalere barer = 50 µm (højre panel af A og B). Tilladelse til ændret og genbrugt med10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Dobbelt mærket EB deposition fluorescens imaging. Venstre panel: rotte model. Mængden af EB molekyler rende fra forurettede BBB blev opdaget (i rødt); Højre panel: kontrol dyr. Ingen EB molekyler blev fundet. DAPI i blå blev brugt som mount medium. Skalere barer = 100 µm. ændret og genbruges med tilladelse10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Mr-SWI billeder. Venstre panel (A): rotte model. Sorte pile tilkendegiver hypointense signaler for CMHs; Højre panel (B): kontrol dyr. Der blev ikke fundet nogen hypointense signaler. Tilladelse til ændret og genbrugt med10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskningsundersøgelser på CMHs er steget i de seneste par år. Mekanismen af CMHs er imidlertid uklart, hvilket fik forskere til at etablere dyremodeller, at simulerer denne særlige betingelse. For eksempel, Hoffmann et al. udviklet en hypoxi-induceret CMHs musemodel der viser at CMHs er forårsaget af iltmangel og afbrydelse af cerebrovaskulær autoregulation12. Reuter et al. 5 etableret en CMHs model i APP23-Transgene mus, som viste at cerebral amyloid angiopathie (CAA) spiller en stor rolle i ætiologi af CMHs. Fisher et al. rapporteret en CMHs musen model, der blev induceret af LP'ER injektion9, hvilket afsløret, at CMHs er forårsaget af betændelse2,13,14. På samme måde, vi har med succes udviklet en sub-akutte CMHs model i SD rotter ved hjælp af LP'ER injektion og fandt, at nitrogenoxid syntase (NOS), især neurale NOS og endotel NOS, er involveret i ætiologien af CMHs, der resulterer i betændelse10 .
Det kritiske trin i vores protokol er LP'ER injektion, som har været flittigt brugt i udvikle murine modeller af neuropsykiatriske lidelser som depression15, skizofreni16, Parkinsons sygdom17, Alzheimers sygdom 18, og Prion sygdom19. Til vores viden er vores brug af en enkelt dosis (1 mg/kg) meget højere end der blev anvendt i andre undersøgelser15,16,17,18,19. Dette kan være en sandsynlig årsag til dødelighed i den aktuelle undersøgelse. LP'ER dosis ændring for CMHs induktion kan være en interessant forskningsemne, som forskellige doser eller injektion tidsplan har vist at påvirke antal, størrelse, distribution og progression af CMHs2. En tidligere undersøgelse har vist, at administration af LP'ER til mus i en dosis på 3 mg/kg fremkalder akut CMHs2.
Selv om udviklingen af forskellige dyremodeller har lettet forskning undersøgelser på CMHs, må vi indrømme, at disse dyremodeller ikke efterligne processen af klinisk CMHs. For eksempel, i vores rotte model, samt Fishers mus model, CMHs blev observeret i lillehjernen, selv om de fleste blev observeret i lobar regioner (hovedsagelig CAA-relaterede) og dyb - eller infra-tentorial steder (hovedsagelig hypertension-relaterede)20, 21. vi har ikke nogen forklaring på denne uoverensstemmelse i distribution, selv om både Fisher og vores team tilskrive denne observation til sårbarheden af cerebellare blodkar til betændelse.
I de fleste kliniske tilfælde skyldes CMHs mere end en ætiologisk faktor, selv om inflammation spiller en vigtig rolle i dens ætiologi. Undersøgelser med fokus på flere faktorer, der inducerer CMHs, i stedet for ren betændelse-induceret CMHs, kan således være mere nyttige i simulere denne betingelse. LP'ER injektion model kunne bruges med andre underliggende faktorer for at efterforske mekanismen af CMHs. For eksempel, har Fisher et al. gennemført en indledende, men interessant skridt med aldrende musene injiceret med LP'ER, og viste, at aldring er en nøglefaktor, der kunne gøre hjernen mere modtagelig for betændelse-induceret CMHs14. Betydningen af den nuværende model er efter vores mening dens forenelighed med andre faktorer i dyremodeller for aging14samt traume22og kroniske sygdomme såsom hyperkolesterolæmi23eller transgene modeller som hypertension24 på grund af enkelhed, tid-effektiviteten og stabiliteten af denne protokol.
Patienter med CMHs Vis kognitive afvisninger, neuropsykiatriske manifestationer og svimmelhed, der er forbundet med fordelingen af CMHs. En begrænsning af denne protokol er der efter LPS injektion, vi kunne ikke udelukke, at virkningerne af perifere betændelse på opførsel af rotter, selv om et fald i social adfærd og gravende (iboende fysiske aktivitet af gnaver afspejler den værdiforringelse af daglige aktiviteter) blev observeret. Yderligere er undersøgelser på måder at forbedre vores metode til at generere en CMHs-dyremodel, fx metode til injektion af LP'ER eller tidsplan for observation, berettiget.
Ikke desto mindre, denne enkle, omkostningseffektive og stabil CMHs murine model induceret af LP'ER injektion kan udnyttes af forskere i belyse ætiologien af CMHs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker lærer Jian Feng Lei og kolleger fra Capital medicinske universitet vejledning under Mr. Vi takker også Jing Zeng fra Department of Neurology, den anden Hospital Yichang til at yde teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L-2630 | for inflammation induction |
| EB | Sigma-aldrich | E2129 | for EB leakage detection |
| DAPI dying solution | Servicbio | G1012 | count medium for IF |
| Perl’s Prussian staining | Solarbio | G1424 | Kit for Prussian staining |
| HE staining | Solarbio | G1120 | Kit for HE staining |
| chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 47335U | For anesthesia |
| phosphate buffer saline (PBS) | Solarbio | P1022 | a kind of buffer solution commonly used in experiment |
| 0.9% saline solution | Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China | solution for perfusion | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | a kind of solution commonly used for fixation |
| 20% sucrose solution | Solarbio | G2461 | a kind of solution commonly used for fixation |
| 30% sucrose solution | Solarbio | G2460 | a kind of solution commonly used for fixation |
| vet ointment | Solcoseryl eye gel, Bacel, Switzerland | for rat's eyes protection |
References
- Sumbria, R. K., et al. A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds. J Neuroinflammation. 13 (1), 218 (2016).
- Vernooij, M. W., et al. Prevalence and risk factors of cerebral microbleeds the Rotterdam Scan Study. Neurology. 70 (14), 1208-1214 (2009).
- Pettersen, J. A., et al. Microbleed topography, leukoaraiosis, and cognition in probable Alzheimer disease from the Sunnybrook dementia study. Archives of Neurology. 65 (6), 790-795 (2008).
- Xu, X., et al. Cerebral microbleeds and neuropsychiatric symptoms in an elderly Asian cohort. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 88 (1), 7-11 (2017).
- Mcauley, G., Schrag, M., Barnes, S., Obenaus, A., Dickson, A., Kirsch, W. In vivo iron quantification in collagenase-induced microbleeds in rat brain. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (3), 711-717 (2012).
- Reuter, B., et al. Development of cerebral microbleeds in the APP23-transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy-a 9.4 tesla MRI study. Frontiers in Aging Neuroscience. 8 (8), 170 (2016).
- Scott, L. L., Downing, T. G. A single neonatal exposure to BMAA in a rat model produces neuropathology consistent with neurodegenerative diseases. Toxins. 10 (1), E22 (2018).
- Toth, P., et al. Aging exacerbates hypertension-induced cerebral microhemorrhages in mice: role of resveratrol treatment in vasoprotection. Aging Cell. 14 (3), 400-408 (2015).
- Liu, S., et al. Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (11), 767-773 (2014).
- Zeng, J., Zhào, H., Liu, Z., Zhang, W., Huang, Y. Lipopolysaccharide induces subacute cerebral microhemorrhages with involvement of Nitric Oxide Synthase in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 27 (7), 1905-1913 (2018).
- Greenberg, S. M., et al. Cerebral microbleeds: A guide to detection and interpretation. Lancet Neurology. 8 (2), 165-174 (2009).
- Hoffmann, A., et al. High-Field MRI reveals a drastic increase of hypoxia-induced microhemorrhages upon tissue reoxygenation in the mouse brain with strong predominance in the olfactory bulb. Plos One. 11 (2), e0148441 (2016).
- Sumbria, R. K., et al. Effects of phosphodiesterase 3A modulation on murine cerebral microhemorrhages. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 114 (2017).
- Sumbria, R. K., et al. Aging exacerbates development of cerebral microbleeds in a mouse model. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 69 (2018).
- Mello, B. S. F., et al. Sex influences in behavior and brain inflammatory and oxidative alterations in mice submitted to lipopolysaccharide-induced inflammatory model of depression. Journal of Neuroimmunol. 320, 133-142 (2018).
- Souza, D. F. D., et al. Changes in astroglial markers in a maternal immune activation model of schizophrenia in Wistar rats are dependent on sex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (489), (2015).
- Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The Lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
- El-Sayed, N. S., Bayan, Y. Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 822 (822), 107-118 (2015).
- Combrinck, M. I., Perry, V. H., Cunningham, C. Peripheral infection evokes exaggerated sickness behaviour in pre-clinical murine prion disease. Neuroscience. 112 (1), 7-11 (2002).
- Pantoni, L. Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges. Lancet Neurology. 9 (7), 689-701 (2010).
- Rosand, J., et al. Spatial clustering of hemorrhages in probable cerebral amyloid angiopathy. Annals of Neurology. 58 (3), 459-462 (2005).
- Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1025-1035 (2017).
- Kraft, P., et al. Hypercholesterolemia induced cerebral small vessel disease. Plos One. 12 (8), e0182822 (2017).
- Schreiber, S., Bueche, C. Z., Garz, C., Baun, H. Blood brain barrier breakdown as the starting point of cerebral small vessel disease? - New insights from a rat model. Experimental & Translational Stroke Medicine. 5 (1), 4 (2013).
