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Neuroscience

아 급성 대뇌 Microhemorrhages 쥐에서 Lipopolysaccharide 주입에 의해 유도 된

doi: 10.3791/58423 Published: October 17, 2018
* These authors contributed equally

Summary

선물이 유도 하 고 탐지 LPS 주입 수 있습니다 Sprague-Dawley 쥐에 의해 발생 하는 CMHs CMHs의 병 인에 대 한 연구 조사 미래에 활용 하는 프로토콜.

Abstract

대뇌 microhemorrhages (CMHs) 노인된 환자에서 일반적 이며 다양 한 정신병 무질서에 상관. CMHs의 병 인은 복잡 한, 그리고 neuroinflammation 동시 발생으로 자주 관찰 됩니다. 여기, 우리가 설명 하위 급성 lipopolysaccharide (LPS) 주입, 조직 CMHs. LPS 주입을 탐지 하기 위한 방법에 의해 유도 된 CMHs 쥐 모델은 상대적으로 경제적, 간단 하 고 비용 효율적인. LPS 주입의 주요 장점 중 하나는 염증을 유발 하는 안정성입니다. CMHs LPS 주입으로 인 한 총 관찰, 되며 (그) 오신 얼룩, Perl의 프러시안 얼룩, 에반스 블루 (EB) 더블 라벨 및 자기 공명 영상-민감성 가중치 이미징 (MRI-SWI) 기술 검출 될 수 있었다. 마지막으로, 그들의 이점 및 단점를 포함 하 여 CMHs 동물 모델 개발의 다른 방법 또한이 보고서에 설명 되어 있습니다.

Introduction

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클래식 대뇌 microhemorrhages (CMHs) 뇌1적혈구에서 작은 혈관 주위 예금 hemosiderin 같은 혈액 저하 제품의를 참조 하십시오. 로테르 담 스캔 연구, CMHs 60-69 년 세의 거의 17.8%와 80 년2에 그들에 38.3%에 찾아낼 수 있었다. 노인에서 CMHs의 보급은 상대적으로 높은, 그리고 CMHs의 축적과 인지 및 정신병 장애 사이의 상관 관계 설립된3,4되었습니다. 여러 동물 모델 CMHs의 최근 보고 된, 유형 IV 콜라 stereotaxic 주입5, APP 유전자 변형6, β-N-methylamino-L-알라닌 노출7, 및8, 고혈압 유발 설치류 모델을 포함 한 와 함께 가장 잘 허용된 선택의 하나로 서 조직의 염증에 의해 유도 된 CMHs. 피셔 외. 9 처음 급성 CMHs 마우스 모델을 개발 살 모 넬 라 typhimurium 에서 파생 된 LPS를 사용. 그 후, 같은 그룹 같은 방법을2를 사용 하 여 하위 급성 CMHs 마우스 모델의 개발을 보도 했다.

LPS는 복 주입을 통해 표준화 된 염증 성 자극으로 간주 됩니다. 이전 연구는 많은 양의 microglia 반영 LPS 주입 neuroinflammation 일으킬 수 및 동물에 사이토 활성화 모델2,10확인 했습니다. 또한, neuroinflammation 활성화의 활성화 및 CMHs의 수 사이 긍정적인 상관 관계가 설립된2,10되었습니다. 이러한 이전 연구를 바탕으로, 우리 있었다 하 라는 메시지가 CMHs 쥐 모델 개발 LPS의 복 주사.

검색 기술 CMHs에 대 한 연구 조사에의 증가 귀착되 었 이동 합니다. 가장 널리 인정 hematoxylin와 얼룩, 프러시안 블루9, 착 색 제 2 철 철 감지 (그는) 오신 붉은 혈액 세포의 탐지를 포함 하는 검색 하는 CMHs 에반스의 블루 면역 형광에 의해 증 착 (EB) 이미징, 그리고 7.0 테슬라 자기 공명 영상-민감성 가중치 이미징 (MRI-SWI)10. 현재 연구의 CMHs에 대 한 심사 방법을 개발 하는 것을 목표로.

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Protocol

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여기에 설명 된 모든 메서드는 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) PLA 육군 종합 병원에 의해 승인 되었습니다.

1입니다. 자료

  1. LPS 주입의 준비
    1. LPS 분말 1 mg/mL의 최종 농도에 S. typhimurium 에서 파생 된의 25 mg을 증류수 25 mL를 추가 합니다. 저장소 4 ° c.에 무 균 튜브에 주입
      주의: LPS 독성이 있다.
    2. EB 주입 작업 농도에서 계속 정상적인 0.9% 소금물에 2 %EB 솔루션을 준비 합니다.

2입니다. 동물

  1. 10 주 세 남성 Sprague-Dawley (SD) 쥐에 LPS를 관리 (평균 무게: 280 ± 20 g) 복 주사.
    주의: 쥐가 다른 조직에서 구입 하는 경우 다음 적응 단계 해서는 안됩니다 7 일 미만.

3. LPS 주사

  1. 1 mg/kg의 복용량에 각 쥐에 intraperitoneally LPS를 주입 하 고 그들의 홈 케이지를 쥐를 반환 합니다.
    참고: 마 취는 필요 하지 않습니다.
  2. 6 시간 후에, LPS는 쥐로 주입의 동일한 복용량 주입.
  3. 16 시간 후 쥐에 LPS의 동일한 복용량을 주사.
    주의: 사망률 5%에서에서 발생할 수 있습니다 1 mg/kg의 복용량에 LPS와 SD 쥐를 주입. 사망 율 더 젊은 이상 쥐 또는 임신 여성 쥐에 증가할 수 있었다.
  4. LPS 주입 후 그들의 감 금 소에 쥐를 반환 하 고 음식과 음료에 대 한 광고 libitum 액세스 제공.
    참고: 쥐 별개 조직의 염증 반응, 전시 하 고 따라서 그것은 감 금 소는 실험을 통해 깨끗 한 유지 필수적입니다. 쥐 해야 될 자주 (2 x 일) 모니터링 무게, 일반적인 모양 및 태도 대 한 첫 번째 LPS 주입 후. 쥐 돌출된 자세, 이동 하는 방식은, 상당한 체중 감소를 전시 하기 위하여 시작 하는 경우 (> 20%), 7 일 전에 EB 연구 끝점 안락사 포 르 피 린 착 이어서 편안 하.

4. 샘플 컬렉션

  1. EB 주입
    1. 첫 번째 주사 후 7 일 anesthetize intraperitoneally 승인된 IACUC 프로토콜에 의해 쥐.
    2. 쥐 각 막 반사 응답을 표시 하지 않습니다 때까지 1-2 분을 기다립니다. 5-8 밀리미터를 수행-각 쥐;에 깊은 심장 펑크 찌른 포인트 3, 4 늑 공간에 흉 골의 왼쪽된 여백 5 m m 이어야 한다.
    3. 혈액 복구, 관찰 될 때까지 기다려야 하 고 주입 EB 0.2 mL/100 g 체중의 복용량에서 왼쪽된 심장 심 실.
      주의: 심장 펑크와 EB 주입 수 신중 하 게 수행 한다. EB 흉 강 또는 왼쪽된 심장 심 실 대신 심장에 주입 될 수 있습니다.
      1. 빈 관으로 다시 빨 아 하 고 실패율을 줄일 수 있도록 주입 전에 EB 튜브에이 볼륨을 바꿉니다 (., 오류에 의해 흉 곽에 주입).
    4. 10 분 동안 부정사 위치에 쥐를 유지.
      참고: 샘플 면역 형광 이미징에서 EB 누설 감지를 사용 하지 않으면, 다음이 단계를 생략할 수 있습니다.
  2. 총 관찰
    1. 심장 perfusions 대뇌 맥 관 구조와 두뇌를 차가운 1 M 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 사용 하 여 수행 합니다.
      1. 메스를 사용 하 여 횡 경 막의 전체 길이 걸쳐 복 부 절 개를 확인 합니다.
      2. 그냥 갈비를 통해 컷 왼쪽 흉 곽 중간.
      3. 흉 강에 열어. 클램프를 사용 하 여 마음을 노출 하 고 혈액과 다른 체액의 배수 장치를 촉진 하기 위하여.
      4. 직접 삽입이 연장에 약 5 mm. 좌 심 실의 돌출에 바늘 항목의 지점 근처 클램핑 하 여 그 위치에 바늘 보안 꾸준히 집게 (심장 해야 여전히 수 박동)와 마음 잡고.
        주의: 하지 지나치게 확장지 않습니다 바늘, 실내 벽을 관통 하 고 타협 솔루션의 순환 수로.
      5. 약 20 mL/min 살포 펌프를 사용 하 여에서 느리고 꾸준한 속도로 흐름 얼음 처럼 차가운 PBS 솔루션 (200-300 mL) 수 있도록 밸브를 해제. 동물 총 관측 대신 고정 필요, 얼음 처럼 차가운 0.9% 생리 식 염 수의 동일한 복용량을 사용 합니다.
      6. 날카로운가 위를 사용 하 여, 아 트리 움, 솔루션 지속적으로 흐름 보장에 절 개를 확인 합니다. 만약 유체 흐름을 자유롭게 하지 않습니다 또는 동물의 코 또는 입에서 오고 있다, 바늘 위치를 변경할.
    2. 총 관찰에 의해 CMHs에 대 한 화면입니다.
      참고: 샘플 총 관찰에 의해 CMHs의 숫자를 계산에 사용 하지 않으면, 다음이 단계를 생략할 수 있습니다.
  3. 고정
    1. 심장 perfusions 얼음 0.9% 생리 식 염 수 (200-300 mL) 대뇌 맥 관 구조를 취소 하 고 두뇌를 사용 하 여 수행 합니다.
    2. 심장 perfusions 고정을 위한 얼음 4 %paraformaldehyde 사용 하 여 수행 합니다.
    3. 목을 벨 쥐, 뇌를 분리 하 고 적어도 6 h에 대 한 20% 자당 해결책에 뇌를 담 궈.
    4. 30% 자당 및 다른 6 h. 에 대 한 수정으로 솔루션을 변경
  4. cryostat를 사용 하 여 10 m m 두께 뇌 조직 섹션을 준비 합니다.

5. 그 얼룩

참고:이 절차는 그 얼룩 키트를 사용 하 여 수행 됩니다.

  1. 씻고 증류수에 슬라이드.
  2. 수돗물에 5 분 동안 실행 되며 솔루션 8 분 세척 얼룩.
  3. 1 분 동안 수돗물을 실행에 30 미 세척에 대 한 1% 산 알코올에 구분 합니다.
  4. 0.2% 암모니아 물 (청소법)에 얼룩 또는 포화 리튬 탄산염 30 솔루션 1 분 씻어 수돗물에 5 분 동안 실행 s.
  5. 린스에 95% 알코올 (10 딥).
  6. Counterstain 30 오신 솔루션 s 1 분.
  7. 95% 알코올, 5 분에 대 한 절대 알코올의 2 개의 변화를 통해 탈수.
  8. 30 대 한 자일 렌에 분명 s.
  9. Liu의 방법9를 사용 하 여 탑재 합니다.
  10. 대물 형광 현미경을 사용 하 여 분석 합니다.
    참고: 붉은 혈액 세포는 CMHs의 구성 요소, 혈관에서 발표 레드-오렌지 얼룩 그 아래에 나타납니다.

6. 펄 프러시안 파란 얼룩

참고:이 절차는 Perls 얼룩 키트를 사용 하 여 수행 됩니다.

  1. 증류수와 슬라이드를 씻어.
  2. 등분 혼합 ferrocyanide 및 10 분에 대 한 염 산의 반응 솔루션에 얼룩.
  3. 탈수, 취소, 마운트, 그리고 5.7-5.10 단계에 설명 된 대로 슬라이드를 분석.

7. EB 더블 얼룩

참고:이 절차는 단계 4.1.3 다음과 같습니다.

  1. 5 분에 대 한 세 번 PBS와 슬라이드를 씻어.
  2. 4', 실 온에서 15 분 동안 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 솔루션으로 슬라이드를 품 어.
  3. 각, 5 분에 대 한 세 번 PBS 솔루션 슬라이드를 세척 하 고 PBS 글리세롤 솔루션 슬라이드 마운트.
  4. 형광 현미경에서 이미지를 분석 합니다. EB 증 착 빨간 형광;로 표시 핵은 블루 형광으로 표시 됩니다.

8입니다. MRI-SWI

  1. 적극적으로 차폐 된 그라데이션 시스템 (내경 16 cm) 7 T 자석에 MRI를 수행 합니다.
  2. 치료 후, 7 일 1.5-2.0% isoflurane isoflurane 마 취 시스템을 사용 하 여의 안 면 흡입 하 여 쥐를 anesthetize.
  3. 수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 쥐의 눈에 적용 됩니다.
  4. 경향이 위치에 쥐를 유지 하 고 MRI SWI 스캔을 수행.
  5. SWI가 중 검사 다음 매개 변수를 사용 하 여 빠른 회전 급강하 에코 시퀀스를 사용 하 여 얻을: 에코 시간 (TE) 8 ms, 반복 시간 (TR) 40 ms, 대칭 이동 각도 = 12 °, 시야 (FOV) 35 m m × 35, 인수 매트릭스 384 × 384, 1 m m 두께 슬라이스를 얻으려고.
  6. 그린 버그 에 따라 MRI SWI에 CMHs를 식별 11, 다음 조건을 포함 하는: (1) ≤ 10 mm, 그리고 (2) 원형, 고립 된, 그리고 낮은 신호 강도 반점의 직경.
  7. 실험의 끝에, 과다 복용 (6 L/min의 흐름) 또는 컨테이너 볼륨의 30%에서 이산화탄소 방법을 사용 하 여 쥐를 안락사.

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Representative Results

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CMHs는 다양 한 방법을 사용 하 여 검색할 수 있습니다. 가장 잘 받아들여 메서드는 다음과 같습니다: (1) 총 관찰 및 평가의 표면 CMHs ( 그림 1, 위쪽 패널에에서 표시 된); (2) 그는 적혈구 ( 그림 2A에 표시 된, 상단 패널) 또는 프러시안 얼룩 검출 제 2 철 철의 검출에 대 한 얼룩 적혈구 (그림 2A, 하단 패널);의 세포에서 파생 된 (3) EB BBB 누설 (그림 3, 왼쪽 패널);에서 파생 된 EB 증 착의 검출에 대 한 얼룩을 두 배로 (4) MRI-SWI CMHs hypointense 신호 (그림 4, 왼쪽된 패널)의 탐지.

Figure 1
그림 1: 표면 CMHs의 총. 상단 패널 (A): 쥐 모델; 하단 패널 (B): 제어 동물. 빨간색 화살표 의미 표면 CMHs. 수정 하 고 권한을10으로 다시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 그 얼룩 및 프러시안 이미지 얼룩. (A) 리플렉션 모델 쥐. 적혈구 상단 패널에서 모세 혈관 밖에 서 발견 됐다 하 고 붉은 혈액 세포의 세포에서 파생 하는 제 2 철 철 포인트 낮은 패널;에서 발견 되었습니다. (B) 리플렉션 동물을 제어 합니다. 붉은 혈액 세포도 제 2 철 철 포인트 발견 됐다. 바 규모 = 100 µ m (A의 왼쪽된 패널 및 B). 스케일 바 50 µ m = (A의 오른쪽 패널 및 B). 수정 하 고와 재사용 허가10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. EB 증 착 형광 이미징 이중 표시. 왼쪽된 패널: 쥐 모델. EB 분자 부상된 BBB에서 유출의 금액 (레드)에서 발견 되었습니다; 오른쪽 패널: 제어 동물. 아니 EB 분자 검출 했다. 파란색에서 DAPI 마운트 매체로 사용 되었습니다. 바 규모 = 100 µ m. 수정 하 고 다시 허가10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4입니다. MRI-SWI 이미지. 왼쪽된 패널 (A): 쥐 모델. CMHs;의 hypointense 신호를 의미 하는 검은 화살표 오른쪽 패널 (B): 제어 동물. 아니 hypointense 신호 발견 됐다. 수정 하 고와 재사용 허가10. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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CMHs에 대 한 조사 연구는 지난 몇 년 동안에서 증가 하고있다. 그러나, CMHs의 메커니즘 불분명, 과학자 들이 특정 조건을 시뮬레이션 하는 동물 모델을 확립 하 라는 남아 있습니다. 예를 들어 호프만 외. 개발 hypoxia 유발 CMHs 마우스 모델 CMHs 저 산소 증 및 뇌혈관 autoregulation12의 중단에 의해 발생 보여줍니다. 로이터 외. 5 보여준 그 대뇌 아 밀 로이드 angiopathy CMHs 피셔 외. 의 병 인에 중요 한 역할 보고 LPS 주입9에 의해 유도 되었다 CMHs 마우스 모델 (CAA) 놀이, APP23 유전자 변형 쥐에 CMHs 모델을 설립 하 CMHs는 염증2,,1314발생 밝혔다. 마찬가지로, 우리는 성공적으로 LPS 주입을 사용 하 여 SD 쥐에서 아 급성 CMHs 모델 개발과 그 산화 질소 synthase (NOS), 특히 신경 NOS와 내 피 번호, CMHs, 염증10에에서 결과의 병 인에 관여 하는 것을 발견 했다 .

우리의 프로토콜의 중요 한 단계는 LPS 주입, 정신병 질환 우울증15,16정신 분열 증, 파 킨 슨 병17, Alzheimer의 질병의 murine 모델 개발에 광범위 하 게 사용 되었습니다. 18, 그리고 프리온 질병19. 우리의 지식, 우리의 사용은 단 하나의 복용량 (1 mg/kg)의 훨씬 높다 보다는 다른 연구15,,1617,,1819에 적용 했다. 현재 연구에서 사망률에 대 한 그럴듯한 이유 수 있습니다. LPS 복용량 수정 CMHs 유도 흥미로운 연구 주제를 있을 수 있습니다, 다른 복용 또는 주사로 일정 표시 되었습니다 숫자, 크기, 분포, 및 CMHs2의 진행에 영향을. 이전 연구는 3 mg/kg의 복용량에 마우스에 LPS의 관리 유도 급성 CMHs2보이고 있다.

다른 동물 모델의 개발 CMHs에 대 한 연구 조사를 촉진 하 고, 비록 우리가 그 동물 모델 임상 CMHs 과정을 시뮬레이션 하지 인정 했다. 예를 들어 피셔의 쥐 모델 뿐 아니라 우리의 쥐 모델에서 CMHs에서에서 관찰 되었다 소 뇌, 비록 대부분 lobar 지역에서 관찰 되었다 (주로 CAA 관련)와 깊은-또는 인프라-tentorial 위치 (주로 고혈압 관련)20, 21. 우리에 있는이 불일치에 대 한 설명을 배포, 피셔와 우리 팀 특성 염증 소 뇌 혈관의 취약점을이 관찰 되지만.

대부분 임상의 경우, 비록 염증의 병 인에 중요 한 역할 하나 이상의 etiological 요소에서 CMHs 결과. 순수한 염증 유발 CMHs 대신 CMHs를 유도 하는 여러 요인에 초점을 맞추고 연구 따라서 더이 조건을 시뮬레이션 하는 데 도움이 수 있습니다. LPS 주입 모델 CMHs의 메커니즘을 조사 다른 기본 요소와 함께 사용 될 수 있습니다. 예를 들어 피셔 외. 마우스 LPS, 주사 및 노화 염증 유발 CMHs14에 더 취약 두뇌를 만들 수 있는 핵심 요소는 증명 노화와 예비, 아직 흥미로운 단계를 실시 했습니다. 우리의 의견으로, 현재 모델의 중요성은 노화14,22, 외상23, 콜레스테롤 혈 증 등 만성 질환 동물 모델 또는 같은 유전자 변형 모델의 다른 요소와의 호환성 단순 고혈압24 시간-효과, 및이 프로토콜의 안정성.

CMHs 환자 인지 감소, 정신병의 발현과 현기증, CMHs의 배포와 관련 된 표시. 현재의 프로토콜의 한 가지 한계는 LPS 주입 후, 우리 수 배제 하지는 쥐의 행동에 주변 염증의 효과 있지만 내 사회적 행동 감소 (설치류 반영의 본질적인 자연 활동에 일상 활동의 장애) 관찰 되었다. 더 CMHs 동물 모델, LPS 또는 일정의 관찰, 주입의 예를 들어, 메서드를 생성 하는 우리의 방법을 개선 하는 방법에 대 한 연구는 보증.

그럼에도 불구 하 고,이 간단 하 고 비용 효율적인, 안정적인 CMHs murine 모델 LPS 주입에 의해 유도 된 연구자 elucidating CMHs의 병 인에 의해 이용 될 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 교사 Jian Feng 레이 MRI 동안 가이드에 대 한 수도 의과대학에서 동료 감사합니다. 우리는 또한 선사 쩡 신경과 부, 기술 지원 제공에 대 한 창 두 번째 사람들의 병원에서에서 감사 합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LPS Sigma-Aldrich L-2630 for inflammation induction
EB Sigma-aldrich E2129 for EB leakage detection
DAPI dying solution Servicbio G1012 count medium for IF
Perl’s Prussian staining Solarbio G1424 Kit for Prussian staining
HE staining Solarbio G1120 Kit for HE staining
chloral hydrate Sigma-Aldrich 47335U For anesthesia
phosphate buffer saline (PBS) Solarbio P1022 a kind of buffer solution commonly used in experiment
0.9% saline solution Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China solution for perfusion
paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 a kind of solution commonly used for fixation
20% sucrose solution Solarbio G2461 a kind of solution commonly used for fixation
30% sucrose solution Solarbio G2460 a kind of solution commonly used for fixation
vet ointment Solcoseryl eye gel, Bacel, Switzerland for rat's eyes protection

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References

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아 급성 대뇌 Microhemorrhages 쥐에서 Lipopolysaccharide 주입에 의해 유도 된
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Li, D., Zhào, H., Wei, W., Liu, N., Dr. Huang, Y. Sub-acute Cerebral Microhemorrhages Induced by Lipopolysaccharide Injection in Rats. J. Vis. Exp. (140), e58423, doi:10.3791/58423 (2018).More

Li, D., Zhào, H., Wei, W., Liu, N., Dr. Huang, Y. Sub-acute Cerebral Microhemorrhages Induced by Lipopolysaccharide Injection in Rats. J. Vis. Exp. (140), e58423, doi:10.3791/58423 (2018).

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