Summary
Vi presenterer en protokoll for å indusere og oppdage CMHs forårsaket av LPS injeksjon i Sprague-Dawley rotter, som kan benyttes i fremtiden forskning undersøkelser på patogenesen av CMHs.
Abstract
Et microhemorrhages (CMHs) er vanlig hos eldre pasienter, og er korrelert til ulike nevropsykiatriske lidelser. Etiologien for CMHs er kompleks, og neuroinflammation er ofte observert som en samtidig forekomst. Her beskriver vi en sub akutt CMHs rotte modell av lipopolysakkarid (LPS) injeksjon, samt en metode for å oppdage CMHs. systemisk LPS injeksjon er relativt enkel, økonomisk og kostnadseffektiv. En stor fordel av LPS injeksjon er dens stabilitet å indusere betennelse. CMHs forårsaket av LPS injeksjon kan oppdages av brutto observasjon, hematoxylin og eosin (han) flekker, Perl er prøyssiske flekker, Evans blå (EB) dobbel-merking og magnetisk resonans imaging-mottakelighet vektet imaging (MRI-SWI) teknologi. Til slutt, andre metoder for å utvikle CMHs dyr modeller, inkludert deres fordeler og/eller ulemper, er også omtalt i denne rapporten.
Introduction
Klassisk cerebral microhemorrhages (CMHs) refererer til lille perivascular forekomster av blod nedbrytningsprodukter som hemosiderin fra røde blod celler i hjernen1. Ifølge Rotterdam skanne Studien fant CMHs nesten 17,8% av personer i alderen 60-69 år og 38,3% i de over 80 år2. Utbredelsen av CMHs hos eldre er relativt høy, og en sammenheng mellom akkumulering av CMHs og kognitive og nevropsykiatriske dysfunksjon har vært etablert3,4. Flere dyr modeller av CMHs har nylig blitt rapportert, inkludert gnager modeller av type IV collagenase stereotaxic injeksjon5, APP transgene6, β-N-methylamino-L-alanin eksponering7og hypertensjon8, med CMHs indusert av systemisk betennelse som en av de fleste valgene. Fisher et al. 9 først brukt LPS avledet fra Salmonella typhimurium for å utvikle en akutt CMHs musemodell. Deretter rapportert samme gruppe utviklingen av en sub akutt CMHs musemodell bruker den samme tilnærmingen2.
LPS er regnet som en standardisert inflammatorisk stimulans via intraperitoneal injeksjon. Tidligere studier har bekreftet at LPS injeksjon føre neuroinflammation som gjenspeiles av store mengder microglia og astrocytter aktivisering i dyr modeller2,10. Videre er en positiv korrelasjon mellom aktivering av neuroinflammation aktivisering og antallet CMHs etablert2,10. Basert på disse tidligere studier, vi ble bedt om å utvikle en CMHs rotte modell av intraperitoneal injeksjon av LPS.
Fremskritt i oppdagelsen teknologiene har ført til en økning i antall forskning undersøkelser på CMHs. Mest allment anerkjent metoder av oppdager CMHs inkluderer gjenkjenning av røde blodlegemer av hematoxylin og eosin (han) flekker, ferric jern gjenkjenning av prøyssiske blå flekker9, oppdagelsen av Evans blå (EB) deponering av immunofluorescence bildebehandling og 7.0 Tesla magnetisk resonans imaging-mottakelighet vektet imaging (MRI-SWI)10. Studien har som mål å utvikle en metode for screening for CMHs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av Animal Care og bruk Committee (ACUC) den PLA Army General Hospital.
1. materiale
- Utarbeidelse av LPS injeksjon
- Legg til 25 mL destillert vann 25 mg LPS pulver avledet fra S. typhimurium en siste konsentrasjon av 1 mg/mL. Lagre injeksjon i et sterilt rør på 4 ° C.
FORSIKTIG: LPS er giftig. - Forberede en 2% EB løsning i normal 0,9% saltvann å holde EB injeksjon på arbeider konsentrasjon.
- Legg til 25 mL destillert vann 25 mg LPS pulver avledet fra S. typhimurium en siste konsentrasjon av 1 mg/mL. Lagre injeksjon i et sterilt rør på 4 ° C.
2. dyr
- Administrere LPS Sprague-Dawley (SD) hannrotter, alderen 10 uker (gjennomsnittlig vekt: 280 ± 20 g) av intraperitoneal injeksjon.
Advarsel: Hvis rotter er kjøpt fra en annen organisasjon, så den adaptive fasen bør ikke være mindre enn 7 dager.
3. LPS injeksjoner
- Injisere LPS intraperitoneally i hver rotte med ett dose av 1 mg/kg, og returnere rotter til deres hjem bur.
Merk: Anestesi er ikke nødvendig. - Seks timer senere, injisere den samme dosen av LPS injeksjon i rotter.
- Seksten timer senere injisere den samme dosen av LPS i rotter.
FORSIKTIG: Injisere SD rotter med plater med ett dose av 1 mg/kg kan resultere i en 5% dødelighet. Dødelighet kan ytterligere økning i yngre eller eldre rotter eller gravide kvinner rotter. - Tilbake rotter burene etter LPS injeksjon og annonsen libitum tilgang til mat og drikke.
Merk: Rotter har en distinkt systemisk inflammatorisk respons, og derfor er det viktig at merdene være ren hele eksperimentet. Rotter burde være ofte (2 x dag) overvåking for vekt, general opptreden og holdning etter første LPS injeksjon. Hvis rotter viser en sammenkrøket holdning, vilje til å flytte, betydelig vekttap (> 20%), porphyrin flekker som de være humant euthanized før 7 dagen EB studie sluttpunkt.
4. prøvetaking
- EB injeksjon
- Syv dager etter første injeksjon, bedøve rotta ved intraperitoneally etter godkjent IACUC protokollen.
- Vent 1-2 min til rotter ikke viser hornhinnen refleks svar. Utføre en 5-8 mm-dypt cardiac punktering på hver rotte; puncturing punktet bør være 5 mm til venstre marg i sternum på 3 og 4 intercostals rommet.
- Vent til blod utvinning er observert, og deretter injisere EB på en dose 0,2 mL/100 g kroppsvekt i venstre hjertet ventrikkel.
FORSIKTIG: Cardiac punktering og EB injeksjon skal utføres nøye. EB kan injiseres i bryst hulrom eller pericardium i stedet for venstre hjertet ventrikkel.- Suge tilbake med en tom rør og erstatte dette volumet med en EB rør før injeksjon for å redusere svikten (f.eks., injeksjon til ribbeinet buret av feil).
- Holde rotta i supine posisjon i 10 min.
Merk: Hvis prøven ikke brukes til å oppdage EB lekkasje i immunofluorescence imaging, så dette trinnet kan utelates.
- Brutto observasjon
- Utføre cardiac perfusions bruke iskald 1 M fosfat buffer saltvann (PBS) til å fjerne hjerne blodkar og hjerner.
- Bruke en skalpell, lage en abdominal snitt over hele lengden av mellomgulvet.
- Skjære gjennom ribbeina bare venstre i ribbeinet buret midtlinjen.
- Åpne opp bryst hulrom. Bruk klemmer å utsette hjertet og å lette drenering av blod og andre væsker.
- Mens stadig holde hjertet med tang (hjertet bør fortsatt være slo), direkte sett inn en nål inn protrusion av venstre ventrikkel å seg forlenge dette til ca 5 mm. sikre pinnen på den posisjonen ved clamping nær inngangspunktet.
FORSIKTIG: Ikke overdrevent utvide nålen, som det kan punkteres det indre veggen og kompromiss sirkulasjonen av løsninger. - Slipp ventilen for å tillate flyt iskald PBS løsningen (200-300 mL) med en langsom og jevn hastighet på rundt 20 mL/min bruker en perfusjonsmåling pumpe. Hvis dyrene krever fiksering i stedet for brutto observasjon, bruk den samme dosen av iskalde 0,9% saltvann.
- Bruke skarp saks, lage et snitt i atriet, sikre at løsningen kontinuerlig flyter. Hvis væsken ikke strømmer fritt eller kommer fra dyrets neseborene eller munn, flytte nålen.
- Skjermen for CMHs av brutto observasjon.
Merk: Hvis prøven ikke brukes til å beregne antall CMHs av brutto observasjon, så dette trinnet kan utelates.
- Utføre cardiac perfusions bruke iskald 1 M fosfat buffer saltvann (PBS) til å fjerne hjerne blodkar og hjerner.
- Fiksering
- Utføre cardiac perfusions iskald 0,9% saltholdig løsning (200-300 mL) fjerne er hjerne blodkar og hjerner.
- Utføre cardiac perfusions med iskald 4% paraformaldehyde for fiksering.
- Halshugge rotta isolere hjernen og fordype hjernen i 20% sukrose løsning for minst 6 h.
- Endre løsningen til 30% sukrose og fastsette for en annen 6 h.
- Forberede 10 mm tykke hjernen vev seksjoner med en kryostaten.
5. han flekker
Merk: Denne prosedyren utføres med en han flekker Kit.
- Vask lysbildene i destillert vann.
- Stain i hematoxylin løsning for 8 min. vask i rennende vann fra springen i 5 min.
- Skille i 1% syre alkohol 30 s. vaskes i rennende vann fra springen i 1 min.
- Stain i 0,2% ammoniakk vann (Bluing) eller mettet lithium carbonate løsning for 30 å 1 min. vask i rennende vann fra springen i 5 min.
- Skyll i 95% alkohol (10 dips).
- Counterstain med eosin løsning for 30 å 1 min.
- Tørke gjennom 95% alkohol, to endringer av absolutt alkohol, for 5 min.
- Klart i xylen for 30 s.
- Montere bruker Liu metode9.
- Analysere bruker brightfield fluorescens mikroskop.
Merk: røde blod celler fra blodkar, som er komponentene i CMHs, vises i rød-oransje under han flekker.
6. Perl prøyssiske blå flekker
Merk: Denne prosedyren utføres med en Perls flekker Kit.
- Vask lysbilder med destillert vann.
- Stain i reaksjon løsning med like deler blanding av ferrocyanide og saltsyre i 10 min.
- Tørke, Fjern, montere og analysere lysbildene som beskrevet i trinnene 5.7-5.10.
7. EB dobbel flekker
Merk: Denne fremgangsmåten følger trinn 4.1.3.
- Vask lysbilder med PBS tre ganger i 5 minutter hver.
- Inkuber lysbilder med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) løsning for 15 min ved romtemperatur.
- Vask lysbildene med PBS løsning tre ganger i 5 minutter hver, og montere lysbilder med PBS-glyserol løsning.
- Analysere bilder på fluorescens mikroskop. EB deponering indikeres av røde fluorescens; kjerner angis med blå fluorescens.
8. MRI-SVEITSISK
- Utføre MRI på en 7-T magnet utstyrt med et aktivt skjermet gradient systemet (16 cm indre diameter).
- Syv dager etter behandling, bedøve rotter ved ansiktsmaske inhalasjon av 1.5-2.0% isoflurane med en isoflurane anestesi system.
- Bruke vet salve på øynene til rotta å hindre tørrhet under anestesi.
- Holde rotter i utsatt posisjon og utføre en MRI-Sveitsisk skanning.
- Få Sveitsisk vektet skanner med en rask-spinn ekko sekvens med følgende parametere: ekko tid (TE) 8 ms, repetisjon tid (TR) 40 ms, snu vinkel = 12°, synsfelt (FOV) 35 mm × 35 mm, oppkjøp matrix 384 × 384, å erverve 1 mm tykke skiver.
- Identifisere CMHs i MRI-Sveitsisk ifølge Greenberg et al. 11, som inkluderte følgende kriterier: (1) en diameter på ≤10 mm, og (2) sirkulære, isolert og lav signal intensitet flekker.
- På slutten av eksperimentet, euthanize rotter med metoden overdose karbondioksid (en flyten av 6 L/min) eller 30% av container.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CMHs kan oppdages ved hjelp av ulike tilnærminger. De fleste metodene inkluderer følgende: (1) brutto observasjon og vurdering av overflaten CMHs (vist i figur 1, øvre panel); (2) han flekker for påvisning av røde blodlegemer (vist i figur 2A, øvre panel) eller prøyssiske flekker oppdage ferric jern avledet fra lysis av røde blodlegemer (figur 2A, nedre panel); (3) EB doblet flekker for påvisning av EB deponering avledet fra BBB lekkasje (Figur 3venstre panel); (4) MRI-Sveitsisk gjenkjenning av CMHs hypointense signaler (Figur 4, venstre panel).
Figur 1: brutto observasjon av overflaten CMHs. Øvre panel (A): rotte modell; Nedre panelet (B): kontrollen dyr. Røde piler betegne overflaten CMHs. endret og på nytt med tillatelse10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: han flekker og prøyssiske flekker bilder. (A) reflekterte rotte modell. Røde blodlegemer ble funnet utenfor kapillærene i øvre panel og ferric jern poeng fra lysis av røde blodlegemer ble oppdaget i nedre panel; (B) reflekterte styre dyr. Røde blodlegemer verken ferric jern poeng ble funnet. Skalere barer = 100 µm (venstre panel av A og B). Skalere barer = 50 µm (høyre side a og B). Modifisert og gjenbrukt med10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Dobbel merket EB deponering fluorescens bildebehandling. Venstre panel: rotte modell. Mengden av EB molekyler lekkasje fra skadede BBB ble oppdaget (i rødt). Høyre panel: kontrollen dyr. Ingen EB molekyler ble oppdaget. DAPI i blått ble brukt som mount medium. Skalere barer = 100 µm. endret og brukes med tillatelse10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. MRI-Sveitsisk bilder. Venstre panel (A): rotte modell. Svarte pilene angir hypointense signaler av CMHs; Høyre panel (B): kontrollen dyr. Fant ingen hypointense signaler. Modifisert og gjenbrukt med10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studier på CMHs har økt i de siste årene. Mekanismen for CMHs er imidlertid uklart, spørre forskere å etablere dyremodeller som simulerer denne bestemt tilstanden. For eksempel Hoffmann et al. utviklet en hypoksi-indusert CMHs musemodell som viser at CMHs er forårsaket av hypoksi og avbrudd i cerebrovascular autoregulation12. Reuter et al. 5 etablert en CMHs modell i APP23-transgene mus, som viste at cerebral amyloid angiopathy (CAA) spiller en viktig rolle i etiologien for CMHs. Fisher et al. rapporterte en CMHs musemodell som ble indusert ved LPS injeksjon9, som avslørte at CMHs er forårsaket av betennelse2,13,14. Tilsvarende vi har utviklet en sub akutt CMHs modell SD rotter bruke LPS injeksjon og har funnet at nitrogenoksid syntase (NOS), spesielt nevrale NOS og endothelial NOS, er involvert i etiologien for CMHs, som resulterer i betennelse10 .
Det kritiske trinnet av våre protokollen er LPS injeksjon, som har vært mye brukt i utvikle murine nevropsykiatriske lidelser som depresjon15, schizofreni16, Parkinsons17, Alzheimers sykdom 18og Prion sykdom19. Vi vet er vår bruk av enkeltdoser (1 mg/kg) mye høyere enn det som ble brukt i andre studier15,16,17,18,19. Dette kan være en sannsynlig grunn til dødeligheten i denne studien. LPS dose modifikasjon for CMHs induksjon kan være et interessant forskning tema, som ulike doser eller injeksjon tidsplan har blitt vist å påvirke antall, størrelse, distribusjon og progresjon av CMHs2. En tidligere studie har vist at administrasjonen av LPS å mus på en dose av 3 mg/kg medfører akutte CMHs2.
Selv om utviklingen av ulike dyr modeller har muliggjort forskning undersøkelser på CMHs, må vi innrømme at de dyremodeller ikke simulere prosessen med klinisk CMHs. For eksempel i våre rotte modell, samt Fishers mus modell, CMHs ble observert i lillehjernen, selv om de fleste ble observert i lobar regioner (hovedsakelig CAA-relatert) og dyp - eller infra-tentorial steder (hovedsakelig hypertensjon-relatert)20, 21. vi har ingen forklaring på dette avviket i distribusjon, selv om både Fisher og vårt team attributt denne observasjonen til sikkerhetsproblemet av lillehjernen blodkar til betennelse.
I de fleste kliniske tilfeller skyldes CMHs flere paranoid faktor, selv om betennelse spiller en viktig rolle i sin etiologi. Studier med fokus på flere faktorer som induserer CMHs, i stedet for ren betennelse-indusert CMHs, kan dermed være mer nyttig i å simulere denne tilstanden. LPS injeksjon modellen kan brukes med andre underliggende faktorer for å undersøke mekanismen av CMHs. For eksempel har Fisher et al. gjennomført en foreløpig, men interessant steg med aldring mus injisert med LPS, og viste at aldring er en viktig faktor som kan gjøre hjernen mer utsatt for betennelse-indusert CMHs14. Etter vår mening er betydningen av den nåværende modellen kompatibilitet med andre faktorer i dyremodeller for aldring14, traumer22, i tillegg til kroniske sykdommer som hyperkolesterolemi23eller transgene modeller som hypertensjon24 på grunn av enkelhet, time-effektivitet og stabilitet i denne protokollen.
Pasienter med CMHs Vis kognitive avtar nevropsykiatriske manifestasjoner og svimmelhet, som er forbundet med distribusjon av CMHs. En begrensning finnes protokollen er at etter LPS injeksjon, vi kan ikke utelukke effekten av eksterne betennelse på virkemåten til rotter, selv om en nedgang i sosial atferd og gravende (iboende naturlig aktivitet av gnager reflekterer den nedskrivning av daglige aktiviteter) ble observert. Videre er studier på måter å forbedre vår metode for genererer en CMHs dyr modell, f.eks metode for å injisere LPS eller planlegge observasjon, garantert.
Likevel, denne enkel, kostnadseffektiv og stabile CMHs murint modellen av LPS injeksjon harddiskkapasiteten brukes av forskere i Klargjørende etiologien for CMHs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker lærer Jian Feng Lei og kolleger fra hovedstaden medisinske universitet etter veiledning under MRI. Vi takker også Jing Zeng fra ved Institutt for nevrologi, andre folks sykehuset av Yichang for teknisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L-2630 | for inflammation induction |
| EB | Sigma-aldrich | E2129 | for EB leakage detection |
| DAPI dying solution | Servicbio | G1012 | count medium for IF |
| Perl’s Prussian staining | Solarbio | G1424 | Kit for Prussian staining |
| HE staining | Solarbio | G1120 | Kit for HE staining |
| chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 47335U | For anesthesia |
| phosphate buffer saline (PBS) | Solarbio | P1022 | a kind of buffer solution commonly used in experiment |
| 0.9% saline solution | Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China | solution for perfusion | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | a kind of solution commonly used for fixation |
| 20% sucrose solution | Solarbio | G2461 | a kind of solution commonly used for fixation |
| 30% sucrose solution | Solarbio | G2460 | a kind of solution commonly used for fixation |
| vet ointment | Solcoseryl eye gel, Bacel, Switzerland | for rat's eyes protection |
References
- Sumbria, R. K., et al. A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds. J Neuroinflammation. 13 (1), 218 (2016).
- Vernooij, M. W., et al. Prevalence and risk factors of cerebral microbleeds the Rotterdam Scan Study. Neurology. 70 (14), 1208-1214 (2009).
- Pettersen, J. A., et al. Microbleed topography, leukoaraiosis, and cognition in probable Alzheimer disease from the Sunnybrook dementia study. Archives of Neurology. 65 (6), 790-795 (2008).
- Xu, X., et al. Cerebral microbleeds and neuropsychiatric symptoms in an elderly Asian cohort. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 88 (1), 7-11 (2017).
- Mcauley, G., Schrag, M., Barnes, S., Obenaus, A., Dickson, A., Kirsch, W. In vivo iron quantification in collagenase-induced microbleeds in rat brain. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (3), 711-717 (2012).
- Reuter, B., et al. Development of cerebral microbleeds in the APP23-transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy-a 9.4 tesla MRI study. Frontiers in Aging Neuroscience. 8 (8), 170 (2016).
- Scott, L. L., Downing, T. G. A single neonatal exposure to BMAA in a rat model produces neuropathology consistent with neurodegenerative diseases. Toxins. 10 (1), E22 (2018).
- Toth, P., et al. Aging exacerbates hypertension-induced cerebral microhemorrhages in mice: role of resveratrol treatment in vasoprotection. Aging Cell. 14 (3), 400-408 (2015).
- Liu, S., et al. Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (11), 767-773 (2014).
- Zeng, J., Zhào, H., Liu, Z., Zhang, W., Huang, Y. Lipopolysaccharide induces subacute cerebral microhemorrhages with involvement of Nitric Oxide Synthase in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 27 (7), 1905-1913 (2018).
- Greenberg, S. M., et al. Cerebral microbleeds: A guide to detection and interpretation. Lancet Neurology. 8 (2), 165-174 (2009).
- Hoffmann, A., et al. High-Field MRI reveals a drastic increase of hypoxia-induced microhemorrhages upon tissue reoxygenation in the mouse brain with strong predominance in the olfactory bulb. Plos One. 11 (2), e0148441 (2016).
- Sumbria, R. K., et al. Effects of phosphodiesterase 3A modulation on murine cerebral microhemorrhages. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 114 (2017).
- Sumbria, R. K., et al. Aging exacerbates development of cerebral microbleeds in a mouse model. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 69 (2018).
- Mello, B. S. F., et al. Sex influences in behavior and brain inflammatory and oxidative alterations in mice submitted to lipopolysaccharide-induced inflammatory model of depression. Journal of Neuroimmunol. 320, 133-142 (2018).
- Souza, D. F. D., et al. Changes in astroglial markers in a maternal immune activation model of schizophrenia in Wistar rats are dependent on sex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (489), (2015).
- Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The Lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
- El-Sayed, N. S., Bayan, Y. Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 822 (822), 107-118 (2015).
- Combrinck, M. I., Perry, V. H., Cunningham, C. Peripheral infection evokes exaggerated sickness behaviour in pre-clinical murine prion disease. Neuroscience. 112 (1), 7-11 (2002).
- Pantoni, L. Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges. Lancet Neurology. 9 (7), 689-701 (2010).
- Rosand, J., et al. Spatial clustering of hemorrhages in probable cerebral amyloid angiopathy. Annals of Neurology. 58 (3), 459-462 (2005).
- Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1025-1035 (2017).
- Kraft, P., et al. Hypercholesterolemia induced cerebral small vessel disease. Plos One. 12 (8), e0182822 (2017).
- Schreiber, S., Bueche, C. Z., Garz, C., Baun, H. Blood brain barrier breakdown as the starting point of cerebral small vessel disease? - New insights from a rat model. Experimental & Translational Stroke Medicine. 5 (1), 4 (2013).
