Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול בידודו של תאים לוקמיה במח העצם חולי לוקמיה וניתוח של מדינתם מטבולית. הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני יכול לעזור כדי לאפיין טוב יותר את הביקוש של ראשי תאים, עלול להוביל רפואה אישית יותר.
Abstract
הדרישה המטבולית של תאים סרטניים יכולים להשפיע באופן שלילי על הישרדות, יעילות הטיפול. כיום, פילוח התרופות של מסלולים מטבוליים נבחנה סוגים רבים של גידולים. לפיכך, אפיון של סרטן תאים ההתקנה מטבולית בלתי נמנע כדי למקד את השביל הנכון כדי לשפר את התוצאה הכוללת של חולים. למרבה הצער, ברוב סוגי סרטן, שהתאים הממאירים הם די קשה להשיג במספרים גבוהים יותר, נדרשת ביופסיה רקמות. לוקמיה היא יוצאת דופן, שבו מספר מספיק של תאים לוקמיה ניתן לבודד ממח העצם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט בידודו של תאים לוקמיה במח העצם חולי לוקמיה וניתוח הבאים של מצב מטבולי שלהם באמצעות מנתח השטף חוץ-תאית. תאים לוקמיה מבודדות על-ידי מעבר הצבע צפיפות, אשר אינה משפיעה על יכולת הקיום שלהם. השלב הבא בטיפוח מסייעת להם להתחדש, ובכך המדינה מטבולית נמדד מצבו של תאים בתנאים אופטימליים. פרוטוקול זה מאפשר בהשגת תוצאות עקביות, מתוקננת היטב, אשר יכול לשמש עבור הטיפול אישית.
Introduction
פרופיל מטבולי הוא אחד המאפיינים העיקריים של תאים, ביואנרגיה שינו עכשיו נחשבים לאחד גולת הכותרת של סרטן1,2,3. יתר על כן, שינויים בהגדרת מטבולית יכול לשמש לטיפול בסרטן על ידי מיקוד האות התמרה חושית מסלולים או מכונות אנזימטי של סרטן תאים4,5,6. בידיעה חילוף לנטייה של תאים סרטניים ולכן יש יתרון והוא יכול לעזור לשפר את הטיפול הנוכחי.
ישנן הרבה שיטות שכבר פועלת אשר יכול להעריך את הפעילות המטבולית של תאים בתרבות. לגבי גליקוליזה, ספיגת הגלוקוז נמדד על ידי תיוג רדיואקטיבי, באמצעות 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) או רמת חומצת החלב חוץ-תאית נמדד enzymatically7,8. קצב חמצון חומצות שומן הינו פרמטר נוסף מטבולית נמדדת פלמיתד שכותרתו isotopically9,10. קצב צריכת החמצן היא שיטה נפוץ לקביעת פעילות מיטוכונדריאלי בתאים11,12, יחד עם ממברנה מיטוכונדריאלי פוטנציאליים הערכה13,14, ATP/ADP (אדנוזין יונקות-טריפוספט/אדנוזין יונקות-diphosphate) יחס מידה15 או סך תאיים ATP מידה16. איתות המסלולים הידועים כדי לווסת את תהליכי חילוף החומרים יכול להיקבע על ידי חלבון quantifications, יכול לשפר את ההבנה של מדידות מטבולית17,18,19.
אולם, כל השיטות האלה למדוד רק אחת או, בתרחיש הטוב ביותר, מספר פרמטרים מטבולית אחד לטעום בו זמנית. חשוב, בו זמנית מדידה של קצב צריכת החמצן (OCR) וקצב חוץ-תאית acidification (ECAR) יכולה להיות מושגת על ידי הניתוח השטף חוץ-תאית על ידי, לדוגמה, סוסון ים XFp מנתח. OCR הוא מחוון של הנשימה מיטוכונדריאלי, ECAR היא בעיקר התוצאה של גליקוליזה (אי אפשר להתעלם CO2 הפקה ואולי היא מרוממת ECAR של תאים עם פעילות גבוהה זרחון חמצוני)20. עד כה, סוגי תאים שונים נחקרו באמצעות אלה מנתחי21,22,23.
כאן נתאר הפרוטוקול עבור ניתוח חוץ-תאית השטף של תקיעות הראשי (תאים לוקמיה נגזר מן השלב hematopoietic ילדותי) של חולי לוקמיה. לפי מיטב ידיעתנו, פרוטוקול ספציפי עבור תקיעות הראשי אינו זמין עדיין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הדגימות התקבלו עם informed consent של הילדים ההורים או האפוטרופסים ואישור הוועדה האתית של אוניברסיטת קארל ב פראג, צ'כיה, המחקר אין. NV15-28848A.
1. הכנת נוגדנים
- להכין 500 מ ל- PBS על ידי המסת 137 מ מ NaCl 2.7 מ"מ אשלגן כלורי, מ מ 4.3 נה2HPO4, מ מ 1.47 אינץ ח'2PO4, ב- ddH2O. התאם ה-pH ל 7.4 עם HCl. Sterilize על ידי autoclaving.
- להכין 100 מ של מדיום RPMI: RPMI-1640 בינוני עם L-Alanyl-גלוטמין בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 μg/mL).
- להכין 50 מ של 0.1 M NaHCO3 במים מזוקקים. להתאים את ה-pH ל 8.1, מסנן לחטא (0.22 μm) ולאחסן ב 4 º C.
הערה: עבור שתי צלחות מנתח השטף חוץ-תאית 8-ובכן, להכין 250 μL של 0.1 M-NaHCO-3 -pH 8.1. - להכין 1 מ"ל של 2 מ' ד'-גלוקוז במים מזוקקים. מסנן לחטא (0.22 μm) ולאחסן ב-20 ° C.
- להכין μL 100 של 1 מ מ Oligomycin A אתנול. מסנן לחטא (0.22 μm) ולאחסן ב-20 ° C.
- להכין 250 μL של 1 מ' 2-deoxy-D-גלוקוז (2-DG) ב- DMEM מינימלי (בינוני ששינה הנשר של Dulbecco). לחמם עד 37 ° C ולהתאים את ה-pH ל 7.4 (לבצע מדידות pH ב 37 מעלות צלזיוס). מסנן לחטא (0.22 μm) ולאחסן ב-20 ° C.
- להכין μL 100 של 1 מ מ FCCP (קרבוניל ציאניד-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) ב דימתיל סולפוקסיד. מסנן לחטא (0.22 μm) ולאחסן ב-20 ° C.
- להכין μL 100 של 1 מ מ Rotenone אתנול. מסנן לחטא (0.22 μm) ולאחסן ב-20 ° C.
- להכין μL 100 של 1 מ"ג/מ"ל Antimycin A אתנול. מסנן לחטא (0.22 μm) ולאחסן ב-20 ° C.
- לפני השימוש, להכין 10 מ"ל של גליקוליזה בדיקת המאמץ בינונית. לחמם DMEM מינימלי עד 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים ולהתאים את ה-pH ל 7.4 (לבצע מדידות pH ב 37 מעלות צלזיוס).
- לפני השימוש, להכין 10 מ"ל של התא Mito בדיקת המאמץ בינונית עם BSA. תוספת מינימלית DMEM עם 2 מ מגלוטמין, 10 מ מ D-גלוקוז, 1 מ HEPES (pH 7.4), פירובט 1 מ"מ ו- 0.1% BSA (שור אלבומין). לחמם עד 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים ולהתאים את ה-pH ל 7.4 (לבצע מדידות pH ב 37 מעלות צלזיוס).
- לפני השימוש, להכין 10 מ"ל של התא Mito בדיקת המאמץ בינונית ללא BSA. תוספת מינימלית DMEM עם 2 מ מגלוטמין, 10 מ מ D-גלוקוז, 1 מ HEPES (pH 7.4) ו פירובט 1 מ מ. תא Mito בדיקת המאמץ בינונית ללא BSA עד 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים חמים ולהתאים את ה-pH ל 7.4 (לבצע מדידות pH ב 37 מעלות צלזיוס).
הערה: BSA מתווסף המדיום בדיקת המאמץ תא Mito כי התאים מגיבים טוב יותר כדי FCCP כאשר המדיום השלים עם BSA (תנאים שונים נבדקו). תא Mito בדיקת המאמץ בינונית ללא BSA משמש עבור טעינת הנמלים כפי היצרן אינה ממליצה על שימוש BSA במדיום.
2. בידוד של תאים תאי מח עצם
הערה: באופן אידיאלי, מדידה של מצב מטבולי של תאי סרטן ראשוני צריך להתחיל מיד לאחר בידוד אוסף של תאים במח העצם. יחד עם זאת, הנתונים הרלוונטיים יכול להשיג גם תאים מבודדים לאחר תחבורה אחרים המטולוגיה מרכזי ברפובליקה הצ'כית. ביצוע כל שלבי משנה ברדס תרביות רקמה סטרילי.
- לחמם PBS ואת המדיום הדרגתיות צפיפות לטמפרטורת החדר.
- לדלל המדגם מח העצם של החולה לוקמיה עם PBS, על יחס של 1:1. ודא כי המדגם מכיל לפחות 80% של תקיעות לוקמיה.
- לקבוע את אחוז תקיעות על ידי cytometry זרימה באמצעות סמנים תקליטור מסוים עבור immunophenotype אפיון סוגי תאים. לאחר הפרדת צבע צפיפות, לזהות אירועים חיוביים חומצת גרעין עם צבע גרעינית כדי לבסס את ספירת התאים הכולל.
- לאחר מכן, לקבוע תאים לוקמיה באמצעות סמנים תקליטור מסוים עבור כל סוג של לוקמיה: B-כל (CD19, CD45), T-כל (CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD99) and AML (CD45, CD33, וסמנים ספציפי מיאלואידית)24. חילוק המספר של תאים לוקמיה חיובי עבור סמני תקליטור מסוים על ידי כל גרעיני התאים כדי לקבוע את אחוז תאים לוקמיה הפיצוץ.
הערה: מח העצם חייב להיות שנאספו לתוך הצינורות עם תרופות נגד קרישת דם. - בזהירות שכבה 6 מ של מח העצם מדולל מדגם מעל 6 מ של המדיום הדרגתיות צפיפות צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה-400 g x עבור 35 דקות ב 4 ° C ברוטור דלי מתנדנד ללא הבלמים.
הערה: נפח גדול של המדגם יכול להיות מחולק aliquots יותר או צינור חרוטי 50 מ ל יכול לשמש עם כמות גדולה יותר של צפיפות בינונית הדרגתיות. - באמצעות פיפטה של פסטר, להעביר בזהירות השכבה לאטמוספרה, אשר מורכב של תאים תאי (איור 1) צינור חדש של חרוט 50 מ עם 5 מ של PBS. צנטריפוגה ב 400 g × 10 דקות ב 4 ° C ברוטור מתנדנד-דלי.
הערה: להעביר את כל השכבות תא תאי לתוך צינור חרוטי בודד 50 מ עם 5 מ של PBS. - וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- 2 מ של PBS סטרילי. לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
הערה: המספר של תאי סרטן גרם אחד של מח העצם aspirated משתנה באופן משמעותי בקרב חולים25.
3. טיפוח לילה תאי תאי
הערה: ביצוע כל שלבי משנה ברדס תרביות רקמה סטרילי.
- להכין את שתי המבחנות T75 עם 20 מ של RPMI. כדי כל מבחנה הוסף תאים תאי 30 x 106 מבודדת. דגירה התאים עם הבקבוק עומד על 16-24 h ב- 5% CO2 ו- 37 מעלות צלזיוס.
4. הכנת צלחות מצופה דבק תא
- מעיל שתי צלחות מנתח השטף 8-ובכן חוץ-תאית.
הערה: בצע את הציפוי בשכונה תרביות רקמה סטרילי. - להוסיף μL 2.2 של התא דבק (צפיפות: 2.54 מ"ג/מ"ל) כדי μL 250 של 0.1 M NaHCO3, pH 8.1 פיפטה מיד 12.5 μL של הפתרון בכל טוב.
הערה: הנייד פתרונות מניות דבק נבדלים צפיפות שלהם, להתאים את עוצמת הקול נוספו NaHCO3 בהתאם. - תן את הצלחות לשבת בשכונה במשך כ 20 דקות, ואז וארוקן את דבק תא ולשטוף כל טוב פעמיים באמצעות μL 200 של מים סטריליים. . תן לזה לנוח בשכונה עם מכסה פתוח עד בארות יבשים.
- השתמש הלוחות מיד או לשמור עד שבוע 1-4 ° C עם החישוק עטוף בסרט פרפין כדי למנוע עיבוי. ודא כי הלוחות מתחממות לטמפרטורת החדר (עבור-20 דקות) בשכונה לפני זריעה התאים.
5. הידרציה של חיישן מחסנית
הערה: מימה שתי מחסניות מנתח השטף 8-ובכן חוץ-תאית.
- הפרד את הצלחת השירות ואת התרמיל חיישן. מקם את מחסנית חיישן במהופך על הספסל מעבדה.
- למלא כל אחד טוב של צלחת השירות עם 200 μL calibrant. ממלאים כל החפיר סביב החלק החיצוני הבארות 400 μL של calibrant.
- להחזיר את מחסנית חיישן לצלחת כלי המכיל עכשיו את calibrant.
- מקם את מכלול מחסנית humidified, הלא-CO2, 37 ° C חממה בן לילה.
- להפעיל את מנתח השטף חוץ-תאית ולתת לו חם עד 37 º C למשך הלילה.
6. זריעת תאי צלחות מצופה דבק תא
הערה: עבור בדיקת המאמץ גליקוליזה, השתמש גליקוליזה בדיקת המאמץ בינונית. לבדיקה מתח התא Mito, השתמש תא Mito בדיקת המאמץ בינונית עם BSA.
- תאי זרע במבחן הלחץ גליקוליזה, לבדוק את מתח התא Mito צלחות נפרדות. עבור כל בדיקה, השתמש תאים מן הבקבוק אחד עם התרבות בין לילה.
- צנטריפוגה תאים ב- g x 200 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend תאים 1 מ"ל של המדיום המתאים, לספור אותם.
- להוסיף 4 x 106 של תאים חיים הנפח הסופי של 400 μL (בינוני המתאים לשימוש).
- צלחת μL 50 של התליה תא לתוך בארות B-G... ודא 500,000 תאים הם נזרע בבאר אחת.
הערה: חשוב להפיץ את התאים בדיוק 500,000 לכל טוב כפי אין נורמליזציה אחרים מתבצע. כך, התוצאות של מטופלים שונים ניתן להשוות. המספר האופטימלי של משכפל הוא 6, כפי שמתואר כאן. לא מומלץ שימוש פחות משכפל מאז היסודי תאים יכולת להתנהג לפעמים בטעות. - להוסיף 180 μL של המדיום המתאים לתוך בארות A ו- H (בארות אלה ישמש רקע תיקון).
- Centrifuge את הצלחת ב 400 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר עם בלם מוגדר כ- 1.
- להוסיף μL 130 של המדיום המתאים בארות B G בשתי צלחות מנתח השטף חוץ-תאית 8-ובכן לאט ובזהירות. מבחינה ויזואלית לאשר כי התאים stably דבקה בתחתית הבארות צפייה במיקרוסקופ.
- הנח את הצלחת לתוך humidified, הלא-CO2, חממה 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
7. טעינת הדיו חיישן
- לבדיקה מתח גליקוליזה, להכין 250 μL אחד של גלוקוז 100 מ מ, 20 μM Oligomycin A ו- 1 מ' 2-די. ג'י, כל במדיום בדיקת המאמץ גליקוליזה.
- לבדיקה מתח התא Mito, להכין 250 μL כל אחד 20 μM Oligomycin A, 15 μM FCCP, 30 μM FCCP, תערובת של 10 μM Rotenone, 10 μg/ml Antimycin A, בכל תא Mito בדיקת המאמץ בינונית ללא BSA.
הערה: הזרקת שני ריכוזים של FCCP ב assay אחד מומלץ שכן אין. החומר של מטופלים מספיק עבור טיטור FCCP. למרות זאת, הריכוזים צריך להיקבע על ידי החוקר. - לטעון את תרכובות לתוך היציאות המתאימות מזרק של מיכל הדיו כדלקמן (טבלה 1):
8. הגדרת התוכנית
- לבדיקה מתח גליקוליזה, להגדיר את התוכנית כפי שמתואר בטבלה 2.
- לבדיקה מתח התא Mito, להגדיר את התוכנית כפי שמתואר בטבלה3.
- הפעלת התוכנית. החלף את הצלחת calibrant הצלחת assay (כאשר תתבקש).
9. הערכה ופרשנות של תוצאות
- בתוצאות בדיקת המאמץ גליקוליזה, חיסור הערך ECAR הנמוך ביותר לאחר ההזרקה 2-DG מכל הערכים ECAR אחרים.
הערה: ערך הנמוך זה מייצג את acidification glycolytic. בדרך כלל, הערך הנמוך ביותר הוא מן המדידהה 4. - חישוב acidification הבזליים, גליקוליזה, גליקוליזה מקסימלי ופרמטרים שמורת Glycolytic מפונקציה glycolytic (איור 2 א). לאחר הפחתת הערך הנמוך ביותר ECAR, לחשב הבזליים acidification כמו ממוצע של ECAR בין נקודות מדידה שלוש הראשונות (להשמיט את הערך ECAR הראשון אם זה שונה באופן משמעותי מן השניים האחרים), לחשב גליקוליזה כמו ממוצע של ECAR ממידה 3 הנקודות לאחר הזרקת גלוקוז ולחשב גליקוליזה מקסימלי כמו ממוצע ECAR מן המידה שלוש הנקודות לאחר Oligomycin זריקה. חישוב Glycolytic שימור כמו גליקוליזה מקסימלי מינוס גליקוליזה.
הערה: לחלופין, לחישוב גליקוליזה מקסימלי, השתמש בערך הגבוה ביותר ECAR הנקודות שלושה מדדו. - בתוצאות בדיקת המאמץ תא Mito, חיסור הערך הנמוך ביותר OCR לאחר ההזרקה Rotenone/Antimycin A של כל הערכים האחרים OCR.
- לחשב נשימה הבזליים, ייצור ATP, נשימה מקסימלי, פרמטרים לקיבולת מפונקציה מיטוכונדריאלי (איור 2B). לאחר הפחתת הערך הנמוך ביותר OCR, לחשב נשימה הבזליים כמו ממוצע של OCR בין נקודות מדידה שלוש הראשונות.
הערה: נשימה המקסימלי הוא הערך הגבוה ביותר OCR לאחר ההזרקה FCCP. - לחישוב ייצור ATP, הפחת הממוצע של שלוש נקודות מדידה OCR לאחר ההזרקה Oligomycin א מ נשימה הבזליים. לחשב לקיבולת בתור הנשימה מקסימלי מינוס הנשימה הבזליים.
הערה: תמיד לחשב את הנשימה מקסימלי מהערך הגבוה ביותר OCR, ללא קשר הריכוז FCCP בשימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 3 מראה את העקומות לאחר בדיקת המאמץ גליקוליזה ומדידות בדיקת המאמץ תא Mito ותקיעה לוקמיה BCP-כל (B-cell קודמן לוקמיה לימפובלסטית חריפה), חולים AML (לוקמיה מיאלואידית חריפה). חישוב פרמטרים מטבולית של מדידות אלה גם מצוינת. תאים 500,000 לכל טוב היו נזרע, כל המדידות נעשו בו hexaplicates.
במבחן הלחץ גליקוליזה, משמש המדיום רק הבסיס, כך התאים הם משוללי של חומרים מזינים. הפרמטר הראשון שהתקבל הוא acidification הבסיס, אשר אמור לשקף את כמות הגלוקוז המאוחסנים בתאים. לאחר הזריקה הראשונה, ECAR הוא גדל מאז תאים לנצל את הגלוקוז, שעלולים להחמיץ את זה בלי חולצה. Oligomycin A הזריקה השנייה מעכב ATP-סינתאז, ובכך ומכוונת את התאים לייצר ATP בעיקר דרך גליקוליזה. זה אמור לגרום בהמשך העלאת רמת ECAR. הזרקה של 2-DG מעכב לחלוטין גליקוליזה וטיפות ECAR.
במבחן מתח התא Mito, משמשים מדיום בתוספת גלוטמין, גלוקוז, כך התאים הם לא משוללי כל החומרים המזינים הפרמטר נשימה הבסיס משקף מצב מטבולי הבסיס שלהם. לאחר הזריקה הראשונה עם Oligomycin, התאים לעכב נשימה מיטוכונדריאלי, לעבור גליקוליזה אשר מיוצג כ ירידה של OCR. FCCP (הזריקה השנייה והשלישית), לעומת זאת, uncouples ATP הפקה של נשימה, כך התאים עכשיו צורכים חמצן קצב מקסימלי, OCR עלייה לערך הגבוה ביותר שלו. הזריקה האחרונה של תערובת Rotenone, Antimycin A מעכב לחלוטין מיטוכונדריאלי נשימה וירידה OCR הוא קרוב לאפס.
איור 1: צפיפות צנטריפוגה הדרגתי של המדגם מח עצם. תאי תאי מועשר עבור תאים לוקמיה מופרדים באמצעות צפיפות בינונית הדרגתיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: חלוקה של בדיקת המאמץ גליקוליזה, כשהילדים מתח Mito תא (א) למופת תוצאת בדיקת המאמץ גליקוליזה. (B) למופת תוצאת בדיקת המאמץ תא Mito. פרמטרים מסומנים בתוך העקומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ניתוח חוץ-תאית השטף של תקיעות לוקמיה של BCP-כל (A, B), החולה AML (B, C). (A ו- C) תוצאות בדיקת המאמץ גליקוליזה. אנא שימו לב כי נקודת המדידה הראשונה יכול להיות שונה באופן משמעותי משאר, לא להיות כלולים מניתוח במקרה הזה. (B ו- D) תוצאות בדיקת המאמץ תא Mito. פרמטרים מסומנים בתוך העקומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| יציאה | בדיקת המאמץ גליקוליזה | בדיקת המאמץ mito תא | ||
| לטעון ליציאה | הריכוז הסופי של הבארות | לטעון ליציאה | הריכוז הסופי של הבארות | |
| A | 20 μL של גלוקוז 100 מ מ | גלוקוז 10 מ מ | 20 μL של μM 20 Oligomycin A | Oligomycin 2 μM A |
| B | ΜL 22 של μM 20 Oligomycin A | Oligomycin 2 μM A | 22 μL של 15 μM FCCP | 1.5 ΜM FCCP |
| C | 25 μL של 1 מ' 2-די. ג'י | 100 מ מ 2-DG | 25 μL של 30 μM FCCP | 4.5 ΜM FCCP |
| D | X | 25 μL של 10 μM Rotenone, μg/ml 10 Antimycin A | 1 μM Rotenone, μg/ml 1 Antimycin A | |
טבלה 1: במתחם כרכים.
| שלב | הגדרות |
| כיול | אוטומטי |
| Equilibration | אוטומטי |
| מידה בסיסית | שלוש פעמים: לערבב – 3 דקות, רגע – 0 דקות, מדידה – 3 דקות |
| הזרקה של ה-port A | הזרקה |
| מדידה | שלוש פעמים: לערבב – 3 דקות, רגע – 0 דקות, מדידה – 3 דקות |
| הזרקה של הנמל B | הזרקה |
| מדידה | שלוש פעמים: לערבב – 3 דקות, רגע – 0 דקות, מדידה – 3 דקות |
| הזרקה של הנמל C | הזרקה |
| מדידה | ארבע פעמים: לערבב – 3 דקות, רגע – 0 דקות, מדידה – 3 דקות |
טבלה 2: תוכנית עבור בדיקת המאמץ גליקוליזה.
| שלב | הגדרות |
| כיול | אוטומטי |
| Equilibration | אוטומטי |
| מידה בסיסית | שלוש פעמים: לערבב – 3 דקות, רגע – 0 דקות, מדידה – 3 דקות |
| הזרקה של ה-port A | הזרקה |
| מדידה | שלוש פעמים: לערבב – 3 דקות, רגע – 0 דקות, מדידה – 3 דקות |
| הזרקה של הנמל B | הזרקה |
| מדידה | שלוש פעמים: לערבב – 3 דקות, רגע – 0 דקות, מדידה – 3 דקות |
| הזרקה של הנמל C | הזרקה |
| מדידה | שלוש פעמים: לערבב – 3 דקות, רגע – 0 דקות, מדידה – 3 דקות |
| הזרקה של הנמל D | הזרקה |
| מדידה | שלוש פעמים: לערבב – 3 דקות, רגע – 0 דקות, מדידה – 3 דקות |
טבלה 3: תוכנית לבדיקת מתח התא Mito.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר מדידת פעילות חילוף החומרים מוערך על ידי ערכים OCR, ECAR העיקרית בפיצוצים לוקמיה נגזר חולים עם לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) או לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). היתרון של מדידה באמצעות מנתח השטף חוץ-תאית הוא שהם מאפשרים זיהוי פרופיל מטבולי בזמן אמת בתאים חיים. בעיקרו של דבר, כל צעד בפרוטוקול שסופקו יכולה להיות מכוונת בהתאם לסוג התא אחד מתכננת ללמוד. כאן נדון את הפרמטרים החשובים ביותר אשר יכול להשפיע על התוצאות, יכול לספק פחות ערכים אופטימלית.
הצעד הראשון לקראת אופטימיזציה הייתה השוואה של נתונים המתקבלים לעומת חומרים טריים קפואים חומר. היכולת למדוד את הפעילות המטבולית מתוך החומר קפוא תאפשר ללימודי רטרוספקטיבה של הדגימות של המטופלים המאוחסנים בבנק חנקן נוזלי. במקרה של כל הדגימות, היינו מסוגלים לזהות פעילות חילוף החומרים עקבי רק מתוך החומר טריים ואילו תאים AML נמדדו גם לאחר בטל הקפאת עם תוצאות אופטימליות.
השלב השני לכיוון אופטימיזציה הוא הטיפוח של תקיעות לוקמיה העיקרי. בדקנו את הפעילות המטבולית של התאים ישר לאחר ההפרדה הדרגתיות צפיפות (ללא culturing) או אחרי culturing בן לילה. גם אם התאים לאחר ההפרדה הדרגתיות צפיפות נראית מעשית וחיוני תחת מיקרוסקופ, פעילות חילוף החומרים שלהם היה לקוי. בסך הכל ECAR וערכי OCR היו נמוכות, כמו כן, לאחר ההזרקה, ערכים OCR או ECAR לא הגיב בצורה אופטימלית כפי שעשו בתאים מעובדים.
טיפוח בתנאים שונים יכול גם להשפיע על התוצאות. באמצעות אינסולין transferrin סודיום סלניט תוספת (ITS) נחשב אימון טוב, כאשר טיפוח ראשי תקיעות8, אבל תוספת זו משבשת הפעילות המטבולית של התאים. במהלך בדיקת המאמץ תא Mito, תקיעות לוקמיה מעובדות עם ITS לא הגיב ל Oligomycin (OCR אמורה להפחית כדי לחשב נשימה מקושרים-ATP). ניסינו גם לטפח שיתוף התאים עם גזע mesenchymal (MSC), אך במקרה זה, ערכי OCR ו- ECAR יש כבר נמוכה לעומת התאים מעובדים ללא MSCs. לסיכום, טיפוח תקיעות העיקרי של חולי לוקמיה ב RPMI בינוני עם 10% FBS היא האפשרות הטובה ביותר.
חולים מתאים אפיון פרופיל מטבולי שלהם עליך לעמוד בקריטריונים מסוימים אשר על יד אחת הגבל את מספר הדגימות שנבדקו, אבל מצד שני, תניב תוצאות רלוונטיות. אנחנו נמדדים בפונקציה מטבולית של חולים עם cellularity גבוהה (עבור מדידה אחת אנחנו נזרע תאים 500,000 / per בארות hexaplicate), דוגמאות בלבד ועם 80 אחוז גבוה יותר של תקיעות לוקמיה ניתן למדוד כדי למנוע זיהוי של לא ספציפי פעילות מטבולית של סוגי תאים אחרים נוכח ההשעיה.
אחד הצעדים מכריע בניתוח נתונים הוא נירמול, כך שניתן להשוות פרמטרים מטבולית בין מדגמים שונים לוקמיה. על פי ניסויים קודמים שלנו הופיעה עם שורות תאים לוקמיה, מצאנו כי נורמליזציה על מספר התאים נותן את התוצאות הטובות ביותר. המספר הספציפי של תאים לכל טוב צריך להיקבע על ידי החוקר ותלוי על הגודל ועל פעילות חילוף החומרים של התאים שנבדקו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות המרכזים המטולוגיה לילדים הצ'כית. עבודה זו היה נתמך על ידי מענק של משרד הבריאות (NV15-28848A), על ידי משרד הבריאות של הרפובליקה הצ'כית, אוניברסיטת בית החולים במוטול, פראג, הרפובליקה הצ'כית 00064203 ועל ידי משרד החינוך, נוער, ספורט NPU אני נ. LO1604.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
| Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
| L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
| HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
| Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
| Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |
References
- DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).
- Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate. Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).
- Wise, D. R., Thompson, C. B. Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer. Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).
- Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel. Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).
- Liberti, M. V., et al. A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product. Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).
- Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
- Hermanova, I., et al. Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells. Leukemia. 30, 209-218 (2016).
- Malandrino, M. I., et al. Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).
- Patella, F., et al. Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).
- Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).
- Simonnet, H., Vigneron, A., Pouysségur, J. Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption. Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).
- Martínez-Reyes, I., et al. TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions. Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).
- Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio. The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).
- Morciano, G., et al. Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals. Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).
- Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).
- Lee, K. -H., et al. Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator. The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).
- Godlewski, J., et al. MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells. Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).
- Kaplon, J., et al. A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence. Nature. 498, 109-112 (2013).
- Pardee, T. S., et al. A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).
- Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).
- Hrušák, O., Porwit-MacDonald, A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).
- Amin, H. M., et al. Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias. Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).
