Summary
Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van leukemische cellen van leukemie patiënten beenmerg en analyse van hun metabolische staat. Beoordeling van de metabole Profiel van primaire leukemie cellen zou kunnen bijdragen tot het beter karakteriseren de vraag van primaire cellen en omhoog zou kunnen leiden tot meer gepersonaliseerde geneeskunde.
Abstract
De metabole eis van kankercellen kan negatieve invloed hebben op overleving en doeltreffendheid van de behandeling. Tegenwoordig, wordt farmaceutische targeting van metabolische routes getest in vele soorten tumoren. Karakterisering van kanker cel metabole setup is dus onvermijdelijk om te richten het juiste traject ter verbetering van de algehele uitkomst van patiënten. Helaas, in de meeste vormen van kanker, de kwaadaardige cellen zijn vrij moeilijk is te verkrijgen in hogere aantallen en de biopsie van weefsel is vereist. Leukemie is een uitzondering, waar een voldoende aantal leukemische cellen kan worden geïsoleerd uit het beenmerg. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van leukemische cellen van leukemie patiënten beenmerg en latere analyse van hun metabolische staat die gebruik maakt van extracellulaire flux analyzer. Leukemische cellen zijn geïsoleerd door het verloop van de dichtheid, die heeft geen invloed op hun levensvatbaarheid. De volgende stap van de teelt helpt hen om te regenereren, dus de metabole gemeten is staat de cellen in optimale omstandigheden. Dit protocol staat consistente, goed gestandaardiseerde resultaten, die kunnen worden gebruikt voor de gepersonaliseerde therapie te bereiken.
Introduction
De metabole profiel is een van de belangrijkste kenmerken van cellen en veranderde Bioenergetica zijn nu beschouwd als één van de kenmerken van de kanker1,2,3. Bovendien, wijzigingen in de metabole setup kunnen worden gebruikt in de behandeling van kanker door zich te richten signaaltransductie trajecten of enzymatische machines van kanker cellen,4,,5,6. Kennen van de metabole aanleg van kankercellen is dus een voordeel en kan helpen bij het verbeteren van de huidige therapie.
Er zijn een overvloed van reeds gevestigde methoden die van de metabole activiteit van cellen in cultuur beoordelen kunnen. Met betrekking tot de glycolyse, glucose-opname kan worden gemeten door de radioactieve labeling, met 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) of extracellulaire lactaat niveaus gemeten enzymatisch7,8. Vetzuur oxidatie tarief is een andere metabole parameter gemeten door ionenpaar gelabelde palmitaat9,10. Zuurstof verbruik tarief is een methode die veel gebruikte voor het bepalen van de mitochondriale activiteit in cellen11,12, samen met de mitochondriale membraan potentiële evaluatie13,14, ATP/ADP (adenosine 5 '-trifosfaat/5 '-adenosinedifosfaat) ratio meting15 of totaal intracellulaire ATP meting16. Signalering van trajecten bekend te reguleren metabole processen kan worden bepaald door eiwitten ondermeer en kan verbetering van het inzicht van metabole metingen17,18,19.
Echter, al deze methoden meten slechts één of, in het beste geval, een paar metabole parameters in een proeven gelijktijdig. Nog belangrijker is, kan gelijktijdige meting van de zuurstof verbruik tarief (OCR) en de extracellulaire verzuring tarief (ECAR) worden bereikt door de extracellulaire flux-analyse door, bijvoorbeeld, Seahorse XFp Analyzer. OCR is een indicator van de mitochondriale ademhaling en ECAR is vooral het gevolg van glycolyse (we niet voorbijgaan aan CO2 productie mogelijk verheffen ECAR van cellen met hoge oxidatieve fosforylatie activiteit)20. Tot nu toe zijn verschillende celtypes bestudeerd met behulp van deze analysers21,22,23.
Hier beschrijven we het protocol voor de analyse van de extracellulaire flux van primaire ontploffingen (leukemie-cellen afgeleid van de onrijpe hematopoietische fase) van leukemie-patiënten. Tot de beste van onze kennis nog een specifiek protocol voor primaire ontploffing niet beschikbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle monsters werden verkregen met de informed consent van de ouders of de voogd van de kinderen en de goedkeuring van de ethische commissie van de Karelsuniversiteit in Praag, Tsjechische Republiek, de studie geen. NV15-28848A.
1. bereiding van reagentia
- 500 mL PBS voor te bereiden door het oplossen van 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4.3 mM nb2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, in ddH2O. aanpassen, de pH aan 7.4 met HCl. Sterilize in autoclaaf.
- 100 mL RPMI voedingsbodem voor te bereiden: RPMI-1640 medium met L-Alanyl-Glutamine aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), penicilline (100 U/mL) en streptomycine (100 μg/mL).
- Bereiden van 50 mL 0,1 M NaHCO3 in gedestilleerd water. Breng de pH op 8.1, filter steriliseren (0.22 μm) en bewaren bij 4 ° C.
Opmerking: Voor twee 8-well extracellulaire flux analyzer platen, bereiden 250 μL van 0,1 M NaHCO3 pH 8.1. - Bereiden 1 mL 2 M D-glucose in gedestilleerd water. Filter steriliseren (0.22 μm) en opgeslagen bij-20 ° C.
- 100 μl van 1 mM Oligomycin A in ethanol te bereiden. Filter steriliseren (0.22 μm) en opgeslagen bij-20 ° C.
- Bereiden 250 μL van 1 M 2-deoxy-D-glucose (2-DG) in minimale DMEM (Dulbecco van bewerkt Eagle's medium). Warm tot 37 ° C en breng de pH op 7.4 (verrichten pH-meting bij 37 ° C). Filter steriliseren (0.22 μm) en opgeslagen bij-20 ° C.
- Bereiden 100 μl van 1 mM FCCP (carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) in DMSO. Filter steriliseren (0.22 μm) en opgeslagen bij-20 ° C.
- 100 μl van 1 mM rotenon in ethanol te bereiden. Filter steriliseren (0.22 μm) en opgeslagen bij-20 ° C.
- 100 μl van 1 mg/mL Antimycin A in ethanol te bereiden. Filter steriliseren (0.22 μm) en opgeslagen bij-20 ° C.
- Vlak voor het gebruik, door 10 mL glycolyse stress testmedium te bereiden. Minimale DMEM warm tot 37 ° C in een waterbad en breng de pH op 7.4 (verrichten pH-meting bij 37 ° C).
- Voorafgaand aan het gebruik, door 10 mL van cel Mito stress testmedium met BSA te bereiden. Minimale DMEM te vullen met 2 mM L-glutamine, 10 mM D-glucose, 1 mM HEPES (pH 7.4), 1 mM pyruvaat en 0,1% BSA (bovien serumalbumine). Warm tot 37 ° C in een waterbad en breng de pH op 7.4 (verrichten pH-meting bij 37 ° C).
- Voorafgaand aan het gebruik, door 10 mL van cel Mito stress testmedium zonder BSA te bereiden. Minimale DMEM aan te vullen met 2 mM L-glutamine, 10 mM D-glucose, 1 mM HEPES (pH 7.4) en 1 mM pyruvaat. Warm cel Mito stress testmedium zonder BSA tot 37 ° C in een waterbad en breng de pH op 7.4 (verrichten pH-meting bij 37 ° C).
Opmerking: BSA wordt toegevoegd aan het testmedium cel Mito stress omdat de cellen beter te op FCCP reageren wanneer het medium wordt aangevuld met BSA (verschillende omstandigheden werden getest). Cel Mito stress testmedium zonder BSA wordt gebruikt voor het laden van de havens, zoals de fabrikant raadt niet met behulp van BSA in het medium.
2. isolatie van mononucleaire cellen uit het beenmerg
Opmerking: in het ideale geval meting van metabolische toestand van primaire leukemie cellen beginnen onmiddellijk na het beenmerg collectie en cel isolatie. Toch kunnen relevante gegevens ook worden verkregen uit cellen geïsoleerd na vervoer vanaf andere hematologie centra in de Tsjechische Republiek. Voer alle substappen in een steriele weefselkweek kap.
- Opwarmen van PBS en het medium dichtheid verloop tot kamertemperatuur.
- Verdun het beenmerg monster van leukemie patiënt met PBS, in een verhouding van 1:1. Zorg ervoor dat het monster ten minste 80% van de ontploffingen van de leukemische bevat.
- Bepaal het percentage van de ontploffing door cytometry van de stroom met behulp van specifieke CD pennen voor immunophenotype-karakterisatie van celtypes. Na dichtheid verlopende scheiding, detecteren nucleïnezuur positieve gebeurtenissen met een nucleaire kleurstof teneinde de totale telling van de cel.
- Vervolgens bepalen leukemie cellen met behulp van specifieke CD pennen voor elk type van leukemie: B-ALL (CD19, CD45), T-ALL (CD3 CD4, CD8, CD5, CD7, CD99) en AML (CD45, CD33 en specifieke myeloïde markers)24. Verdeel het aantal leukemie cellen positief voor specifieke CD pennen door alle nucleaire cellen om te bepalen van het percentage van leukemie blast cellen.
Opmerking: Het beenmerg moet worden verzameld in de buizen met anticoagulantia. - Zorgvuldig laag 6 mL verdunde beenmerg monster meer dan 6 mL van het medium dichtheid kleurovergang in een conische tube van 15 mL. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 35 min bij 4 ° C in een swingende-emmer rotor zonder de rem.
Opmerking: Groter volume van het monster kan worden verdeeld in meer aliquots of conische tube van 50 mL kan worden gebruikt met de grotere hoeveelheid kleurovergang medium dichtheid. - Met behulp van een pipet van Pasteur, zorgvuldig overbrengen in de interfase laag die uit mononucleaire cellen (Figuur 1 bestaat) een nieuwe conische tube van 50 mL met 5 mL PBS. Centrifugeer bij 400 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C in een swingende-emmer rotor.
Opmerking: Breng alle mononucleaire cel lagen in een conische buis van één 50 mL met 5 mL PBS. - Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 2 mL steriele PBS. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen.
Opmerking: Het aantal leukemie cellen in één mL beenmerg opgezogen verschilt sterk tussen patiënten25.
3. 's nachts teelt van mononucleaire cellen
Opmerking: Alle substappen in een steriele weefselkweek kap uitvoeren.
- Twee T75 flacons met 20 mL RPMI voor te bereiden. Voeg aan elke maatkolf, 30 x 106 geïsoleerde mononucleaire cellen. Incubeer de cellen met de kolf opkomen voor 16-24 h bij 5% CO2 en 37 ° C.
4. voorbereiding van de cel lijm beklede platen
- Jas twee 8-well extracellulaire flux analyzer platen.
Opmerking: Voer de coating in een steriele weefselkweek kap. - Toevoegen van 2.2 μL van cel lijm (dichtheid: 2.54 mg/ml) tot 250 μL van 0,1 M NaHCO3, pH 8.1 en Pipetteer onmiddellijk 12,5 μL van de oplossing in elk putje.
Opmerking: Zelfklevende stamoplossingen van de cel kan verschillen in hun dichtheid, het volume toegevoegd aan NaHCO3 dienovereenkomstig aanpassen. - Laat de platen zitten in de kap voor ongeveer 20 min, vervolgens de cel lijm gecombineerd en elkaar goed tweemaal met 200 μL van steriel water wassen. Laat het zitten in de kap met het deksel open totdat putten droog zijn.
- De platen meteen gebruiken of opslaan van maximaal 1 week bij 4 ° C met de velg verpakt in paraffine film om condensatie te voorkomen. Ervoor zorgen dat de platen zijn opgewarmd tot kamertemperatuur (voor ongeveer 20 min) in de kap voor het zaaien van de cellen.
5. hydratatie van Sensor Cartridge
Opmerking: Hydraat twee 8-well extracellulaire flux analyzer cartridges.
- Scheid de hulpprogramma-plaat- en de sensor cartridge. Plaats de sensor cartridge ondersteboven op de lab-Bank.
- Vul elk goed van de utility plaat met 200 μl kalibrant. Vul elke gracht rond de buitenkant van de putjes met 400 μL van kalibrant.
- Retourneer de cartridges van de sensor naar de hulpprogramma-plaat waarin nu de kalibrant.
- Plaats de cartridge-vergadering in een bevochtigde, niet-CO2, 37 ° C incubator's nachts.
- Zet op de extracellulaire flux analyzer en laat deze warm tot 37 ° C's nachts.
6. zaaien van de cellen in cel lijm beklede platen
Opmerking: Gebruik voor stresstest glycolyse, glycolyse stress testmedium. Voor cel Mito stresstest, gebruikt u cel Mito stress testmedium met BSA.
- De cellen van het zaad voor de glycolyse stress-test en de stresstest cel Mito in afzonderlijke platen. Voor elke test, door cellen te gebruiken uit een kolf met overnachting cultuur.
- Centrifugeer cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen in 1 mL van het juiste medium, en ze tellen.
- 4 x 10,6 van levende cellen aan het eindvolume van 400 μL (gebruik geschikte voedingsbodem) toevoegen.
- Typeplaatje 50 μl van de celsuspensie in putten B-G. Zorgen voor 500.000 cellen worden overgeënt in een put.
Opmerking: Het is cruciaal om het zonebeheer van precies 500.000 cellen per putje als geen andere normalisatie wordt uitgevoerd. Op die manier kunnen de resultaten van verschillende patiënten worden vergeleken. Het optimale aantal replicatieonderzoeken is zes, zoals hier is beschreven. Met behulp van minder replicatieonderzoeken wordt niet aanbevolen aangezien primaire cellen kan soms ten onrechte gedragen. - Voeg 180 μL van de geschikte voedingsbodem in putten A en H (deze putten zal dienen als een achtergrondcorrectie).
- Centrifugeer de plaat bij 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met rem ingesteld op 1.
- Voeg 130 μL van geschikte voedingsbodem toe aan putjes B-G in twee 8-well extracellulaire flux analyzer platen langzaam en zorgvuldig. Visueel bevestigen dat de cellen zijn stabiel gehandeld naar de onderkant van de putten door bekijken onder de Microscoop.
- Plaats de plaat in een bevochtigde, niet-CO2, 37 ° C incubator voor 30 min.
7. veilig laden van de Sensor-Cartridge
- Voorbereiden voor de glycolyse stress-test, 250 μL elk van 100 mM glucose, 20 μM Oligomycin A en 1 M 2-DG, allemaal in de glycolyse stress testmedium.
- Voor de cel Mito stress-test, bereiden 250 μL elk van 20 μM Oligomycin A, 15 μM FCCP, 30 μM FCCP en een mengsel van 10 μM rotenon en 10 μg/ml Antimycin A, allemaal in de cel Mito stress testmedium zonder BSA.
Opmerking: Injecteren van twee concentraties van FCCP in één bepaling wordt aanbevolen omdat er niet genoeg patiënten materiaal bij de titratie met FCCP. Niettemin, moeten de concentraties worden bepaald door de onderzoeker. - De stoffen in de passende injector-poorten van de cartridge als volgt (tabel 1) laden:
8. het opzetten van het programma
- Voor de glycolyse stress-test, ingesteld zoals beschreven in tabel 2.
- Voor de cel Mito stress-test, instellen het programma zoals beschreven in tabel 3.
- Start het programma. De plaat kalibrant wordt vervangen door de assay plaat (indien gevraagd).
9. evaluatie en interpretatie van de resultaten
- Aftrekken in de glycolyse stress testresultaten, de laagste waarde van de ECAR na 2-DG injectie van alle andere ECAR waarden.
Opmerking: Deze laagste waarde vertegenwoordigt de niet-glycolytic verzuring. Meestal is de laagste waarde van de 4th -meting. - Bereken basale verzuring, glycolyse, maximale glycolyse en Glycolytic reserve parameters van glycolytic functie (figuur 2A). Na de laagste ECAR-waarde af te trekken, basale verzuring te berekenen als een gemiddelde van ECAR uit de eerste drie meetpunten (weglaten de eerste ECAR waarde indien deze aanzienlijk van de andere twee verschilt), berekenen glycolyse als een gemiddelde van ECAR drie metingen wijst na injectie van glucose en berekenen van maximale glycolyse als een gemiddelde van ECAR drie metingen na Oligomycin een injectie punten. Berekenen Glycolytic reserve als maximale glycolyse minus glycolyse.
Opmerking: Als alternatief voor de berekening van de maximale glycolyse, gebruiken de hoogste ECAR waarde van de drie punten gemeten. - Aftrekken in de cel Mito stress testresultaten, de laagste waarde van de OCR na rotenon/Antimycin A injectie van alle andere OCR-waarden.
- Bereken basale ademhaling, de productie van ATP, maximale ademhaling en reservecapaciteit parameters van mitochondriale functie (figuur 2B). Na de laagste OCR-waarde af te trekken, basale ademhaling als een gemiddelde voor OCR uit de eerste drie meetpunten te berekenen.
Opmerking: Maximale ademhaling is de hoogste waarde van de OCR na FCCP injectie. - Aftrekken voor ATP productie berekening, het gemiddelde van de drie OCR-meetpunten na Oligomycin A injectie uit basale ademhaling. Bereken reservecapaciteit als de maximale ademhaling minus de basale ademhaling.
Opmerking: Berekenen altijd de maximale ademhaling van de hoogste waarde van de OCR, ongeacht de concentratie van de FCCP gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 3 toont de bochten na de glycolyse stresstest en cel Mito stresstest metingen van leukemische ontploffing van de BCP-ALL (B-cel voorloper acute lymfatische leukemie) en AML (acute myeloïde leukemie) patiënten. De berekening van de metabole parameters van deze metingen wordt ook aangegeven. 500.000 cellen per well zijn overgeënt en alle metingen werden gedaan in hexaplicates.
In de glycolyse stress-test, wordt het alleen Basaal medium gebruikt, zodat de cellen worden beroofd van voedingsstoffen. De eerste parameter verkregen is de basale verzuring, die de hoeveelheid glucose in cellen opgeslagen weerspiegelen moet. Na de eerste injectie, is ECAR toegenomen sinds cellen glucose gebruiken en het lactaat kunnen fermenteren. Oligomycin A in de tweede injectie remt van ATP-synthase en dus stuurt de cellen voor de productie van ATP hoofdzakelijk via de glycolyse. Dit moet verder leiden tot misbruik van ECAR. Injectie van 2-DG volledig remt glycolyse en ECAR druppels.
In de cel Mito stress-test, een medium aangevuld met glutamine en glucose gebruikt, zodat de cellen niet wordt ontzegd van alle voedingsstoffen en de basale ademhaling parameter weerspiegelt hun basale metabole staat. Na de eerste injectie met Oligomycin A, cellen remmen mitochondriale ademhaling en overschakelen op glycolyse die wordt weergegeven als een daling van OCR. FCCP (de tweede en de derde injectie), reddingsprocedure aan de andere kant, ATP productie van ademhaling, zodat de cellen nu zuurstof op een maximale snelheid en OCR aanleiding tot de hoogste waarde verbruiken. De laatste injectie van rotenon en Antimycin A mengsel volledig remt mitochondriale ademhaling en OCR dicht bij nul is gedaald.
Figuur 1: de kleurovergang centrifugeren van de dichtheid van het beenmerg monster. Mononucleaire cellen verrijkt voor leukemische cellen worden gescheiden door de kleurovergang medium dichtheid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: overzicht van glycolyse stresstest en cel Mito stress test (A) voorbeeldig resultaat glycolyse stress test. (B) voorbeeldig resultaat van cel Mito stress test. Parameters worden aangegeven binnen de curves. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: extracellulaire flux analyse van leukemische ontploffing van de BCP-ALL (A, B) en AML (B, C) patiënt. (A en C) glycolyse stress testresultaten. Houd er rekening mee dat het eerste meetpunt aanzienlijk van de rest verschillen kan en moet in dat geval worden uitgesloten van de analyse. (B en D) cel Mito stress testresultaten. Parameters worden aangegeven binnen de curves. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Poort | Glycolyse stresstest | Cel mito stresstest | ||
| Laden op de poort | Eindconcentratie in de putten | Laden op de poort | Eindconcentratie in de putten | |
| A | 20 μL van 100 mM glucose | 10 mM glucose | 20 μL van 20 μM Oligomycin A | 2 μM Oligomycin A |
| B | 22 μL van 20 μM Oligomycin A | 2 μM Oligomycin A | 22 μL van 15 μM FCCP | 1.5 ΜM FCCP |
| C | 25 μL van 1 M 2-DG | 100 mM 2-DG | 25 μL van 30 μM FCCP | 4,5 ΜM FCCP |
| D | X | 25 μL van 10 μM rotenon en 10 μg/ml Antimycin A | 1 μM rotenon en 1 μg/ml Antimycin A | |
Tabel 1: Samengestelde volumes.
| Stap | Instellingen |
| Kalibratie | Automatisch |
| Evenwichtsinstelling | Automatisch |
| Nulmeting | Driemaal: Meng-3 min, wachten – 0 min, maatregel-3 min |
| Injectie van de poort A | Injectie |
| Meting | Driemaal: Meng-3 min, wachten – 0 min, maatregel-3 min |
| Injectie van de poort B | Injectie |
| Meting | Driemaal: Meng-3 min, wachten – 0 min, maatregel-3 min |
| Injectie van de haven C | Injectie |
| Meting | Viermaal: Meng-3 min, wachten – 0 min, maatregel-3 min |
Tabel 2: Programma voor glycolyse stress test.
| Stap | Instellingen |
| Kalibratie | Automatisch |
| Evenwichtsinstelling | Automatisch |
| Nulmeting | Driemaal: Meng-3 min, wachten – 0 min, maatregel-3 min |
| Injectie van de poort A | Injectie |
| Meting | Driemaal: Meng-3 min, wachten – 0 min, maatregel-3 min |
| Injectie van de poort B | Injectie |
| Meting | Driemaal: Meng-3 min, wachten – 0 min, maatregel-3 min |
| Injectie van de haven C | Injectie |
| Meting | Driemaal: Meng-3 min, wachten – 0 min, maatregel-3 min |
| Injectie van de poort D | Injectie |
| Meting | Driemaal: Meng-3 min, wachten – 0 min, maatregel-3 min |
Tabel 3: Programma voor cel Mito stress test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hierboven beschreven protocol voorziet in het meten van de metabole activiteit beoordeeld door OCR en ECAR waarden in de primaire leukemische ontploffing afgeleid van patiënten met acute lymfatische leukemie (ALL) of acute myeloïde leukemie (AML). Het voordeel van de meting met behulp van een extracellulaire flux analyzer is dat hierdoor de detectie van metabole profiel in de real time in de levende cellen. In wezen, elke stap in het meegeleverde protocol kan worden aangepast afhankelijk van het celtype een plan om te studeren. Hier bespreken we de belangrijkste parameters die de resultaten kunnen beïnvloeden en minder dan optimale waarden zou kunnen bieden.
De eerste stap op weg naar optimalisatie was een vergelijking van de gegevens die zijn verkregen uit verse materiële vs ingevroren materiaal. De mogelijkheid voor het meten van de metabole activiteit van de ingevroren materiaal zou voor retrospectieve studies van patiënten monsters opgeslagen in vloeibare stikstof bank. In het geval van alle monsters waren wij kundig voor speurder consistente metabole activiteit alleen uit de vers materiaal overwegende dat AML cellen ook gemeten werden na de invriezing met optimale resultaten.
De tweede stap naar optimalisatie is de teelt van primaire leukemische ontploffing. We hebben getest de metabole activiteit van de cellen direct na de dichtheid verlopende scheiding (zonder kweken) of na overnachting kweken. Zelfs als de cellen na de dichtheid verlopende scheiding keek leefbare en vitale onder een Microscoop, was hun metabole activiteit bijzondere waardevermindering heeft ondergaan. Over het geheel genomen ECAR en OCR waarden lager waren en ook na injectie, OCR of ECAR waarden reageerde niet optimaal zoals ze in gekweekte cellen deden.
Teelt onder verschillende omstandigheden kan ook invloed hebben op de resultaten. Met behulp van insuline transferrine natrium seleniet supplement (ITS) wordt beschouwd als een goede praktijk als het cultiveren van primaire ontploffing8, maar dit supplement met de metabole activiteit van de cellen interfereert. Tijdens de cel Mito stresstest, leukemische ontploffing gekweekt met ITS niet reageren op Oligomycin A (OCR moet verkleinen om te berekenen van de ATP-verbonden ademhaling). We hebben ook geprobeerd om te cultiveren mede de cellen met mesenchymale stamcellen (MSC), maar in dit geval OCR en ECAR waarden hebben is lager in vergelijking met de cellen gekweekt zonder MSCs. Kortom, het cultiveren van primaire ontploffing van leukemie-patiënten in de RPMI gemiddeld met 10% FBS is de beste optie.
Patiënten geschikt voor de karakterisatie van hun metabole profiel moeten voldoen aan bepaalde criteria die enerzijds het aantal geteste monsters beperken maar aan de andere relevante resultaten zal opleveren. We de metabole functie van patiënten met hoge buiten gemeten (voor één meting overgeënt we 500.000 cellen / per putten in hexaplicate) en alleen de monsters met 80 en een hoger percentage van leukemische ontploffingen kon worden gemeten om te voorkomen dat de detectie van aspecifieke metabole activiteit van andere celtypes aanwezig in de opschorting.
Een van de cruciale stappen in data-analyse is de normalisatie, zodat metabole parameters tussen de verschillende leukemische monsters kunnen worden vergeleken. Volgens onze eerdere experimenten met leukemische cellijnen, vonden we dat normalisatie aan het aantal van de cellen het beste resultaat geeft. Het specifieke aantal cellen per putje moet worden bepaald door de onderzoeker en hangt af van de grootte en de metabole activiteit van geteste cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken de Tsjechische pediatrisch hematologie centra. Dit werk werd ondersteund door de subsidie van Ministerie van volksgezondheid (NV15-28848A), door het ministerie van gezondheid van het universitaire ziekenhuis Motol, Tsjechische Republiek, Praag, Tsjechische Republiek 00064203 en door het ministerie van onderwijs, jeugd en sport Binengrenzen ik nr. LO1604.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
| Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
| L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
| HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
| Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
| Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |
References
- DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).
- Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate. Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).
- Wise, D. R., Thompson, C. B. Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer. Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).
- Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel. Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).
- Liberti, M. V., et al. A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product. Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).
- Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
- Hermanova, I., et al. Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells. Leukemia. 30, 209-218 (2016).
- Malandrino, M. I., et al. Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).
- Patella, F., et al. Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).
- Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).
- Simonnet, H., Vigneron, A., Pouysségur, J. Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption. Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).
- Martínez-Reyes, I., et al. TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions. Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).
- Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio. The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).
- Morciano, G., et al. Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals. Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).
- Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).
- Lee, K. -H., et al. Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator. The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).
- Godlewski, J., et al. MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells. Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).
- Kaplon, J., et al. A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence. Nature. 498, 109-112 (2013).
- Pardee, T. S., et al. A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).
- Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).
- Hrušák, O., Porwit-MacDonald, A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).
- Amin, H. M., et al. Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias. Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).
