Summary
نقدم هنا بروتوكولا لعزل الخلايا ليوكيميك من نخاع العظام في مرضى سرطان الدم وتحليل لدولته الأيضية. تقييم الشخصية الأيضية لخلايا سرطان الدم الأولية يمكن أن تساعد على أفضل وصف طلب الخلايا الأولية ويمكن أن تؤدي إلى الطب أكثر تخصيصاً.
Abstract
شرط الأيضية للخلايا السرطانية يمكن أن تؤثر سلبا على فعالية العلاج والبقاء على قيد الحياة. في الوقت الحاضر، يتم اختبار الصيدلية استهداف الأيضية في أنواع عديدة من الأورام. وهكذا، وصف سرطان الخلية الأيضي الإعداد أمر لا مفر منه بغية استهداف المسار الصحيح لتحسين الحصيلة العامة للمرضى. ولسوء الحظ، في معظم حالات السرطان، الخلايا الخبيثة يصعب جداً الحصول على أرقام أعلى وخزعة النسيج مطلوب. سرطان الدم استثناء، حيث يمكن أن يكون عدد كاف من الخلايا ليوكيميك المعزولة من نخاع العظام. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لعزل الخلايا ليوكيميك من نخاع العظام في مرضى سرطان الدم والتحليل اللاحق لدولته الأيضية استخدام محلل الجريان خارج الخلية. يتم عزل الخلايا ليوكيميك بالتدرج الكثافة، التي لا تؤثر على قدرتها على البقاء. الخطوة زراعة يساعدهم على تجديد، وبالتالي فالدولة الأيضية قياس حالة الخلايا في ظروف مثلى. يسمح هذا البروتوكول لتحقيق نتائج متسقة وموحدة جيدا، والتي يمكن أن تستخدم لعلاج شخصية.
Introduction
التشكيل الجانبي الأيض واحدة من الخصائص الرئيسية للخلايا والاستقلاب غيرت تعتبر الآن واحدة من السمات المميزة للسرطان1،،من23. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام التغييرات في إعداد التمثيل الغذائي في علاج السرطان باستهداف ممرات توصيل الإشارات أو الآلات الانزيمية من سرطان خلايا4،،من56. مع العلم نزعة الأيضية للخلايا السرطانية وبالتالي هي ميزة ويمكن أن تساعد في تحسين العلاج الحالي.
وهناك ير طرق القائمة بالفعل التي يمكن تقييم النشاط الأيضي للخلايا في الثقافة. فيما يتعلق بتحلل، امتصاص الجلوكوز يمكن أن تقاس بوصفها المشعة، باستخدام 2-نبدج (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) أو مستويات لاكتات خارج الخلية تقاس انزيماتيكالي7،8. معدل أكسدة الأحماض الدهنية معلمة الأيضية أخرى تقاس بنظير المسمى بالميتاتي،من910. معدل استهلاك الأكسجين أسلوب يستخدم على نطاق واسع لتحديد النشاط الميتوكوندريا في الخلايا11،12، جنبا إلى جنب مع غشاء الميتوكوندريا المحتملة التقييم13،14، (الادينوسين ATP/ADP 5 '5'-ثلاثي/الادينوسين-diphosphate) نسبة قياس15 أو مجموعة داخل الخلية ATP قياس16. إشارات المسارات المعروفة لتنظيم عمليات التمثيل الغذائي يمكن أن تحددها كوانتيفيكيشنز البروتين ويمكن تحسين فهم القياسات الأيضية17،،من18إلى19.
بيد أن جميع هذه الأساليب قياس واحد فقط، أو في أفضل سيناريو، عدد قليل من المعالم الأيضي في إحدى عينة في وقت واحد. الأهم من ذلك، يمكن قياس المتزامن لمعدل استهلاك الأوكسجين (OCR) ومعدل تحمض خارج الخلية (أكار) بتحليل الجريان خارج الخلية، على سبيل المثال، "فرس البحر XFp محلل". التعرف الضوئي على الحروف مؤشر على التنفس المتقدرية وعكر هو أساسا نتيجة لتحلل (لا يمكن أن نتجاهل CO2 الإنتاج ربما رفع عكر الخلايا مع النشاط الفسفرة عالية)20. حتى الآن، وقد درسنا مختلف أنواع الخلايا استخدام هذه المحلﻻت21،،من2223.
هنا نحن تصف البروتوكول لتحليل تدفق خارج الخلية من الانفجارات الأولية (خلايا اللوكيميا المستمدة من المرحلة غير ناضجة المكونة للدم) من مرضى اللوكيميا. أفضل معرفتنا، بروتوكول معين للانفجارات الأولية ليست متاحة بعد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع العينات التي تم الحصول عليها مع informed consent من الآباء أو الأوصياء للأطفال والموافقة من اللجنة الأخلاقية التابعة لجامعة تشارلز في براغ، الجمهورية التشيكية، الدراسة لا. NV15-28848A.
1-إعداد الكواشف
- إعداد 500 مل من برنامج تلفزيوني بتذويب 137 مم كلوريد الصوديوم، مم 4.3 غ2هبو4مم 1.47 خ2ص4، في ddH2O. ضبط ال pH إلى 7.4 مع HCl. تعقيم بالتعقيم، 2.7 مم بوكل.
- تحضير 100 مل من ربمي المتوسطة: المتوسطة RPMI 1640 مع ل-Alanyl-الجلوتامين تكملة مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين (100 U/mL) ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل).
- إعداد 50 مل ناكو 0.1 م3 في الماء المقطر. ضبط درجة الحموضة إلى 8.1، وتصفية تعقيم (0.22 ميكرومتر) وتخزينها في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: لاثنين لوحات محلل تدفق الخلية 8-جيدا، وإعداد 250 ميكروليتر من 0.1 م NaHCO3 الرقم الهيدروجيني 8.1. - إعداد 1 مل 2 م د-الجلوكوز في الماء المقطر. فلتر تعقيم (0.22 ميكرومتر) وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- إعداد 100 ميكروليتر من 1 مم أوليجوميسين A في الإيثانول. فلتر تعقيم (0.22 ميكرومتر) وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- إعداد ميكروليتر 250 1 م 2-ديوكسي-د-الجلوكوز (2-DG) في "الحد الأدنى دميم" (المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو). الحارة إلى 37 درجة مئوية وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 (القيام بقياس درجة الحموضة عند 37 درجة مئوية). فلتر تعقيم (0.22 ميكرومتر) وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- إعداد 100 ميكروليتر من 1 مم فككب (الكربونيل السيانيد-فتريفلوروميثوكسيفينيلهيدرازوني) في [دمس]. فلتر تعقيم (0.22 ميكرومتر) وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- إعداد 100 ميكروليتر من 1 مم والروتينون في الإيثانول. فلتر تعقيم (0.22 ميكرومتر) وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- إعداد 100 ميكروليتر 1 ملغ/مل أنتيميسين أ في الإيثانول. فلتر تعقيم (0.22 ميكرومتر) وتخزينها في-20 درجة مئوية.
- قبل استخدام وإعداد 10 مل من تحلل اختبار الإجهاد المتوسطة. الحارة "دميم ضئيل" إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 (القيام بقياس درجة الحموضة عند 37 درجة مئوية).
- قبل استخدام وإعداد 10 مل من "ميتو خلية" اختبار الإجهاد المتوسط مع جيش صرب البوسنة. الملحق "دميم الحد الأدنى" مع مم 2 لتر-الجلوتامين، 10 ملم د-الجلوكوز، 1 مم حبيس (درجة الحموضة 7.4)، بيروفات 1 مم وجيش صرب البوسنة 0.1% (ألبومين المصل البقري). الحارة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 (القيام بقياس درجة الحموضة عند 37 درجة مئوية).
- قبل استخدام وإعداد 10 مل من "ميتو خلية" اختبار الإجهاد المتوسط دون جيش صرب البوسنة. تكملة "دميم الحد الأدنى" مع مم 2 لتر-الجلوتامين، 10 ملم د-الجلوكوز، 1 مم هيبيس (درجة الحموضة 7.4) وبيروفات 1 مم. ميتو خلية اختبار الإجهاد المتوسط دون جيش صرب البوسنة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي دافئ وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 (القيام بقياس درجة الحموضة عند 37 درجة مئوية).
ملاحظة: جيش صرب البوسنة هو إضافة إلى وسيلة اختبار الإجهاد "ميتو خلية" للخلايا تستجيب على نحو أفضل إلى فككب عندما تستكمل المتوسطة مع جيش صرب البوسنة (تم اختبار ظروف مختلفة). خلية ميتو اختبار الإجهاد المتوسط دون جيش صرب البوسنة يستخدم لتحميل المنافذ حسب الشركة المصنعة لا تنصح باستخدام جيش صرب البوسنة في الأجل المتوسط.
2-عزل الخلايا وحيدات النوى من نخاع العظام
ملاحظة: من الناحية المثالية، ينبغي أن تبدأ قياس الدولة الأيضية لخلايا سرطان الدم الأولية مباشرة بعد عزلة جمع وخلايا نخاع العظام. ومع ذلك، يمكن أيضا الحصول البيانات ذات الصلة من الخلايا المعزولة بعد مراكز النقل من أمراض أخرى في الجمهورية التشيكية. تنفيذ كافة الخطوات الفرعية في غطاء زراعة الأنسجة عقيمة.
- الاحماء في برنامج تلفزيوني والمتوسطة الكثافة المتدرجة في درجة حرارة الغرفة.
- تمييع عينة نخاع العظم لمريض اللوكيميا مع برنامج تلفزيوني، بنسبة 1:1. تأكد من أن العينة تحتوي على 80 في المائة على الأقل من الانفجارات ليوكيميك.
- تحديد النسبة المئوية للانفجارات بالتدفق الخلوي استخدام علامات القرص المضغوط محددة لتوصيف إيمونوفينوتيبي من أنواع الخلايا. بعد الانفصال الكثافة المتدرجة، والكشف عن الحمض النووي من الأحداث الإيجابية مع صبغة نووية بغية إنشاء خلية العد الإجمالي.
- ثم تحديد خلايا سرطان الدم باستخدام علامات مؤتمر نزع السلاح المحددة لكل نوع من سرطان الدم: كل ب (CD19, CD45)، تي للجميع (CD3، خلايا CD4، CD8، CD5، CD7، CD99)، ومكافحة غسل الأموال (CD45، CD33، وعلامات محددة النقوي)24. تقسيم عدد خلايا سرطان الدم إيجابية بالنسبة لعلامات محددة في مؤتمر نزع السلاح بكافة الخلايا النووية لتحديد النسبة المئوية للخلايا اللوكيميا الانفجار.
ملاحظة: قد نخاع العظام التي سيتم جمعها في الأنابيب مع مضادات التخثر. - الطبقة 6 مل عينة نخاع العظم مخففة أكثر من 6 مل المتوسطة الكثافة المتدرجة في أنبوب مخروطي 15 مل بعناية. الطرد المركزي في 400 غرام x لمدة 35 دقيقة في 4 درجات مئوية في دوار دلو يتأرجح دون الفرامل.
ملاحظة: يمكن تقسيم أكبر حجماً من العينة إلى مختبرين أكثر أو يمكن استخدام أنبوب مخروطي 50 مل مع كمية أكبر من الكثافة المتوسطة التدرج. - استخدام ماصة باستور، بعناية بنقل الطبقة الطور البيني الذي يتكون من الخلايا وحيدات النوى (الشكل 1) إلى أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد مع 5 مل من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي في 400 غ × 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في دوار يتأرجح دلو.
ملاحظة: نقل جميع طبقات الخلايا وحيدات النوى في أنبوب مخروطي واحدة 50 مل مع 5 مل من برنامج تلفزيوني. - نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 2 مل PBS العقيمة. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
ملاحظة: عدد خلايا سرطان الدم في مل واحد من نخاع العظام يستنشق يختلف اختلافاً كبيرا بين المرضى25.
3-بين عشية وضحاها زراعة الخلايا وحيدات النوى
ملاحظة: جميع الخطوات الفرعية في غطاء زراعة الأنسجة عقيمة.
- إعداد اثنين من قوارير T75 مع 20 مل ربمي. لكل قارورة، إضافة 30 × 106 عزل الخلايا وحيدات النوى. احتضان الخلايا مع قارورة الوقوف ح 16-24 عند 5% CO2 و 37 درجة مئوية.
4-إعداد لوحات الخلايا المغلفة بمادة لاصقة
- معطف اثنان لوحات محلل التمويه 8-جيدا خارج الخلية.
ملاحظة: تنفيذ الطلاء في غطاء زراعة الأنسجة عقيمة. - إضافة ميكروليتر 2.2 من لاصق الخلية (الكثافة: 2.54 ملغ/مل) إلى 250 ميكروليتر من 0.1 م ناكو3الرقم الهيدروجيني 8.1 وميكروليتر ماصة 12.5 فورا للحل في كل بئر.
ملاحظة: يمكن أن تختلف في كثافتها الحلول الأسهم لاصقة الخلية، ضبط مستوى الصوت إضافة إلى ناكو3 تبعاً لذلك. - واسمحوا لوحات الجلوس في غطاء محرك السيارة لحوالي 20 دقيقة، ثم نضح لاصقة الخلية وتغسل كل جيدا مرتين باستخدام 200 ميكروليتر من الماء المعقم. وليكن على الجلوس في هود مع فتح الغطاء حتى آبار جافة.
- استخدام اللوحات الحق بعيداً أو إنقاذ يصل إلى 1 الأسبوع عند 4 درجة مئوية مع حافة ملفوفة في الفيلم البارافين لتجنب التكثيف. التأكد من أن اللوحات هي درجة حرارة تصل إلى درجة حرارة الغرفة (لحوالي 20 دقيقة) في هود قبل البذر في الخلايا.
5-ترطيب خرطوشة الاستشعار
ملاحظة: هيدرات اثنين من خراطيش محلل التمويه 8-جيدا خارج الخلية.
- لوحة الأداة المساعدة وخرطوشه الاستشعار منفصلة. ضع خرطوشة استشعار رأسا على مقاعد البدلاء المختبر.
- ملء كل من لوحة الأداة المساعدة مع 200 ميكروليتر كاليبرانت. ملء كل خندق حول الجزء الخارجي الآبار مع 400 ميكروليتر من كاليبرانت.
- العودة خرطوشة استشعار للوحة أداة يحتوي الآن كاليبرانت.
- وضع التجميع خرطوشة في هوميديفيد، غير CO2، 37 درجة مئوية حاضنة بين عشية وضحاها.
- قم بتشغيل محلل الجريان خارج الخلية والسماح لها الحارة إلى 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
6-زرع الخلايا في خلية ألواح مغلفة بمادة لاصقة
ملاحظة: لاختبار الإجهاد، وتحلل استخدام تحلل اختبار الإجهاد المتوسطة. لاختبار الإجهاد "ميتو الخلية"، استخدم "ميتو خلية" اختبار الإجهاد المتوسط مع جيش صرب البوسنة.
- خلايا البذور لاختبار الإجهاد تحلل واختبار الإجهاد "ميتو الخلية" في لوحات منفصلة. لكل اختبار، واستخدام خلايا من قارورة واحدة مع الثقافة بين عشية وضحاها.
- الطرد المركزي خلايا في 200 غ س لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ريسوسبيند الخلايا في 1 مل الوسط المناسب والاعتماد عليها.
- إضافة 4 × 106 خلايا حية لوحدة التخزين النهائي من 400 ميكروليتر (استخدام متوسط مناسب).
- لوحة 50 ميكروليتر من تعليق خلية في آبار ب-غ. تأمين الخلايا 500,000 هي تبذر في بئر واحدة.
ملاحظة: من الأهمية بمكان أن البذور الخلايا 500,000 بالضبط كل بئر كما يتم تنفيذ لا تطبيع الأخرى. وبهذه الطريقة، يمكن مقارنة النتائج من مختلف المرضى. العدد الأمثل ل replicates ستة، كما موضح هنا. لا ينصح باستخدام أقل replicates منذ الخلايا الأولية يمكن أن تتصرف في بعض الأحيان خطأ. - إضافة ميكروليتر 180 الوسيلة المناسبة في آبار A و H (سوف تخدم هذه الآبار كتصحيح خلفية).
- الطرد المركزي اللوحة في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الفرامل تعيينها إلى 1.
- إضافة ميكروليتر 130 الوسيلة المناسبة للآبار ب-ز في اثنين من لوحات محلل التمويه 8-جيدا خارج الخلية ببطء وبعناية. بصريا وتؤكد أن الخلايا ستابلي التقيد بالجزء السفلي من الآبار بالعرض تحت المجهر.
- ضع لوحة في هوميديفيد، وغير CO2وحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
7-تحميل خرطوشة الاستشعار
- لاختبار الإجهاد تحلل، إعداد 250 ميكروليتر كل من الجلوكوز 100 مم 20 ميكرو أوليجوميسين و 2 م 1-المديرية العامة، كل في تحلل اختبار الإجهاد المتوسطة.
- لاختبار الإجهاد "ميتو الخلية"، إعداد 250 ميكروليتر كل من 20 ميكرو أوليجوميسين A، 15 ميكرو فككب، 30 ميكرو فككب وخليط من 10 ميكرومترات والروتينون و 10 ميكروغرام/مل أنتيميسين أ، في كل "خلية ميتو" اختبار الإجهاد المتوسط دون جيش صرب البوسنة.
ملاحظة: حقن تركيزات اثنين من فككب في تحليل واحد يوصي بحيث لا توجد مواد المرضى تكفي للمعايرة فككب. ومع ذلك، ينبغي أن تحدده التركيزات الباحث. - تحميل المركبات إلى المنافذ المناسبة حاقن خرطوشة على النحو التالي (الجدول 1):
8-إعداد البرنامج
- لاختبار الإجهاد تحلل، بإعداد البرنامج كما هو موضح في الجدول 2.
- لاختبار الإجهاد "ميتو الخلية"، قم بإعداد البرنامج كما هو موضح في الجدول 3.
- بدء تشغيل البرنامج. استبدال لوحة كاليبرانت بلوحة المقايسة (عند مطالبتك بذلك).
9-تقييم وتفسير النتائج
- في تحلل نتائج اختبار الإجهاد، بطرح أقل قيمة عكر بعد حقن 2-المديرية العامة من كافة القيم الأخرى عكر.
ملاحظة: تمثل هذه القيمة الأدنى التحمض غير جليكوليتيك. عادة، أقل قيمة من قياسال 4. - حساب التحمض القاعدية وتحلل وتحلل القصوى ومعلمات الاحتياط Glycolytic من الدالة جليكوليتيك (الشكل 2A). بعد طرح قيمة أكار أدنى، حساب التحمض القاعدية كمتوسط أكار من نقاط القياس الثلاثة الأولى (حذف القيمة أكار الأولى إذا كان يختلف إلى حد كبير عن اثنين آخرين)، حساب تحلل كمتوسط أكار من قياس ثلاثة نقاط بعد حقن الجلوكوز وحساب تحلل القصوى كمتوسط عكر من قياس ثلاث نقاط بعد أوليجوميسين حقن. حساب Glycolytic الاحتياطي تحلل القصوى مطروحاً منها تحلل.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، لحساب تحلل القصوى، واستخدام أعلى قيمة أكار من ثلاث نقاط قياس. - في نتائج اختبار الإجهاد "ميتو الخلية"، بطرح أقل قيمة للتعرف الضوئي على الحروف بعد حقن والروتينون/أنتيميسين A من كافة القيم الأخرى التعرف الضوئي على الحروف.
- حساب تنفس القاعدية، وإنتاج ATP والتنفس القصوى والمعلمات القدرة الاحتياطية من الوظيفة المتقدرية (الشكل 2). وبعد طرح أقل قيمة للتعرف الضوئي على الحروف، حساب تنفس القاعدية كوسيلة للتعرف الضوئي على الحروف من نقاط القياس الثلاثة الأولى.
ملاحظة: يتم التنفس القصوى أعلى قيمة التعرف الضوئي على الحروف بعد حقن فككب. - لحساب إنتاج ATP، طرح متوسط نقاط القياس التعرف الضوئي على الحروف الثلاثة بعد حقن أ أوليجوميسين من تنفس القاعدية. حساب القدرة الاحتياطية كالتنفس القصوى مطروحاً منها التنفس القاعدية.
ملاحظة: حساب دائماً التنفس القصوى من أعلى قيمة التعرف الضوئي على الحروف، بغض النظر عن تركيز فككب المستخدمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 3 المنحنيات بعد اختبار الإجهاد تحلل وقياسات اختبار الإجهاد "ميتو الخلية" من الانفجارات ليوكيميك من BCP للجميع (ب-الخلايا السليفة الليمفاوي اللوكيميا الحادة) والمرضى مكافحة غسل الأموال (سرطان الدم النقوي الحاد). ويرد أيضا حساب المعلمات الأيضية من هذه القياسات. كانت تبذر الخلايا 500,000 كل بئر وجميع قياسات أجريت في هيكسابليكاتيس.
في اختبار الإجهاد تحلل، يستخدم المتوسط القاعدي فقط، حيث أنه يحرم الخلايا من المواد المغذية. المعلمة الأولى التي تم الحصول عليها من التحمض القاعدية، التي ينبغي أن تعكس كمية الجلوكوز المخزن في الخلايا. بعد الحقن الأول، هو زيادة أكار منذ الخلايا الاستفادة من الجلوكوز ويمكن الهياج إلى لاكتات. يحول دون ATP synthase A أوليجوميسين في الحقن الثاني وهكذا يوجه الخلايا لتنتج ATP أساسا عن طريق تحلل. يجب أن يتسبب هذا مواصلة الارتقاء بعكر. حقن 2-DG تماما يمنع تحلل وقطرات عكر.
في اختبار الإجهاد "ميتو الخلية"، تستخدم وسيلة تستكمل مع الجلوتامين والسكر، حيث أن الخلايا لا يحرمون من جميع المواد الغذائية والمعلمة التنفس القاعدية يعكس حالتها الأيض القاعدية. بعد أول حقن أ أوليجوميسين، تعوق التنفس المتقدرية الخلايا وقم بالتبديل إلى تحلل الذي يمثل بوصفه نقصانا للتعرف الضوئي على الحروف. فككب (حقن الثانية والثالثة)، من ناحية أخرى، uncouples إنتاج ATP من التنفس، حيث أن الخلايا الآن تستهلك الأوكسجين معدل القصوى وزيادة التعرف الضوئي على الحروف إلى قيمة أعلى. حقن خليط والروتينون وألف أنتيميسين الماضي تماما يمنع التنفس المتقدرية والتعرف الضوئي على الحروف يتناقص قريبة من الصفر.
رقم 1: كثافة الطرد المركزي التدرج من عينة نخاع العظم. يتم فصل الخلايا وحيدات النوى أثري للخلايا ليوكيميك المتوسطة الكثافة المتدرجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: مخطط تفصيلي لاختبار الإجهاد تحلل و "ميتو خلية" الإجهاد test. (أ) النتيجة المثالية لاختبار الإجهاد تحلل. (ب) النتيجة المثالية لاختبار الإجهاد "ميتو الخلية". يتم الإشارة إلى المعلمات داخل المنحنيات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 3: تحليل الجريان خارج الخلية من الانفجارات ليوكيميك من BCP للجميع (أ، ب) ومكافحة غسل الأموال (ب، ج) المريض. (أ وج) تحلل نتائج اختبار الإجهاد. يرجى ملاحظة أن أول نقطة القياس يمكن أن تختلف إلى حد كبير عن بقية، وينبغي أن تستبعد من التحليل في هذه الحالة. (ب ود) نتائج اختبار الإجهاد "ميتو الخلية". يتم الإشارة إلى المعلمات داخل المنحنيات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| منفذ | اختبار الإجهاد تحلل | اختبار الإجهاد ميتو الخلية | ||
| تحميل إلى منفذ | التركيز النهائي في الآبار | تحميل إلى منفذ | التركيز النهائي في الآبار | |
| A | 20 ميكروليتر من الجلوكوز 100 مم | جلوكوز 10 ملم | 20 ميكروليتر من 20 ميكرو أوليجوميسين A | 2 ميكرومتر أوليجوميسين A |
| ب | ميكروليتر 22 من 20 ميكرو أوليجوميسين A | 2 ميكرومتر أوليجوميسين A | ميكروليتر 22 من 15 ميكرو فككب | فككب 1.5 ميكرومتر |
| ج | 25 ميكروليتر من 1 م 2-المديرية العامة | 100 مم 2-المديرية العامة | 25 ميكروليتر من 30 ميكرو فككب | فككب ميكرو 4.5 |
| د | X | 25 ميكروليتر من والروتينون 10 ميكرومترات و 10 ميكروغرام/مل أنتيميسين أ | 1 ميكرومتر والروتينون و 1 ميكروغرام/مل أنتيميسين أ | |
الجدول 1: مجمع وحدات التخزين.
| الخطوة | إعدادات |
| معايرة | تلقائي |
| الموازنة | تلقائي |
| قياس خط الأساس | ثلاث مرات: مزيج – 3 دقيقة، الانتظار – 0 دقيقة، التدبير – 3 دقيقة |
| حقن أ المنفذ | حقن |
| قياس | ثلاث مرات: مزيج – 3 دقيقة، الانتظار – 0 دقيقة، التدبير – 3 دقيقة |
| حقن منفذ ب | حقن |
| قياس | ثلاث مرات: مزيج – 3 دقيقة، الانتظار – 0 دقيقة، التدبير – 3 دقيقة |
| حقن المنفذ ج | حقن |
| قياس | أربع مرات: مزيج – 3 دقيقة، الانتظار – 0 دقيقة، التدبير – 3 دقيقة |
الجدول 2: برنامج لاختبار الإجهاد تحلل.
| الخطوة | إعدادات |
| معايرة | تلقائي |
| الموازنة | تلقائي |
| قياس خط الأساس | ثلاث مرات: مزيج – 3 دقيقة، الانتظار – 0 دقيقة، التدبير – 3 دقيقة |
| حقن أ المنفذ | حقن |
| قياس | ثلاث مرات: مزيج – 3 دقيقة، الانتظار – 0 دقيقة، التدبير – 3 دقيقة |
| حقن منفذ ب | حقن |
| قياس | ثلاث مرات: مزيج – 3 دقيقة، الانتظار – 0 دقيقة، التدبير – 3 دقيقة |
| حقن المنفذ ج | حقن |
| قياس | ثلاث مرات: مزيج – 3 دقيقة، الانتظار – 0 دقيقة، التدبير – 3 دقيقة |
| حقن المنفذ د | حقن |
| قياس | ثلاث مرات: مزيج – 3 دقيقة، الانتظار – 0 دقيقة، التدبير – 3 دقيقة |
الجدول 3: برنامج لاختبار الإجهاد "ميتو الخلية".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يسمح البروتوكول المذكور أعلاه لقياس النشاط الأيضي المقررة حسب القيم التعرف الضوئي على الحروف وعكر في انفجارات ليوكيميك الأولية المستمدة من المرضى المصابين بسرطان الدم الليمفاوي الحاد (الكل) أو سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال). ميزة قياس استخدام محلل الجريان خارج الخلية أنه يمكن الكشف عن الشخصية الأيض في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية. أساسا، يمكن تعديل كل خطوة في البروتوكول المقدمة تبعاً لنوع الخلية أحد خطط لدراسة. وهنا سوف نناقش أهم البارامترات التي يمكن أن تؤثر على النتائج، ويمكن أن توفر أقل من القيم المثلى.
وكان الخطوة الأولى نحو التحسين مقارنة البيانات التي تم الحصول عليها من مقابل المواد الطازجة المجمدة المواد. القدرة على قياس النشاط الأيضي من المواد المجمدة التي ستسمح للدراسات الاستعادية لعينات المرضى المخزنة في البنك النتروجين السائل. وفي حالة جميع العينات، كنا قادرين على الكشف عن النشاط الأيضي متسقة من المواد الطازجة فقط في حين تم قياس خلايا مكافحة غسل الأموال أيضا بعد إزالة التجميد مع تحقيق أفضل النتائج.
والخطوة الثانية نحو الأمثل هو زراعة الانفجارات ليوكيميك الأولية. قد اختبرنا النشاط الأيضي للخلايا مباشرة بعد فصل الكثافة المتدرجة (دون استزراع) أو بعد استزراع بين عشية وضحاها. حتى ولو بدت الخلايا بعد انتهاء التدرج في كثافة قابلة للاستمرار والحيوية تحت مجهر، كان نشاطها الأيضي البصر. عموما كانت أقل قيم أكار، والتعرف الضوئي على الحروف وأيضا، وبعد الحقن، قيم التعرف الضوئي على الحروف أو أكار لم يستجب على النحو الأمثل كما فعلوا في الخلايا المزروعة.
زراعة تحت ظروف مختلفة يمكن أيضا أن تؤثر على النتائج. ويعتبر استخدام الملحق سيلينيت الصوديوم في الأنسولين ترانسفيرين (البحث عن) ممارسة جيدة عند زراعة الابتدائي انفجارات8، ولكن هذا الملحق يتداخل مع النشاط الأيضي للخلايا. أثناء اختبار الإجهاد "ميتو الخلية"، لم يستجب ليوكيميك الانفجارات المزروعة مع البحث عن إلى أوليجوميسين أ (ينبغي خفض التعرف الضوئي على الحروف لحساب ATP المرتبطة التنفس). حاولنا أيضا أن يشترك زراعة الخلايا مع الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC)، ولكن في هذه الحالة، قد تم أقل مقارنة القيم التعرف الضوئي على الحروف وعكر على الخلايا المزروعة دون MSCs. وباختصار، زراعة الانفجارات الأولية من مرضى اللوكيميا في ربمي المتوسطة مع 10% FBS هو الخيار الأفضل.
مناسبة لوصف تلك الشخصية الأيضية المرضى يجب أن تفي بمعايير معينة التي على الحد من ناحية عدد العينات المختبرة ولكن في الآخر سوف تسفر عن نتائج ذات الصلة. قمنا بقياس وظيفة التمثيل الغذائي للمرضى مع سيلولاريتي عالية (لقياس واحد نحن المصنف الخلايا 500,000 كل الآبار في هيكسابليكاتي) ويمكن قياس العينات فقط مع 80 ونسبة مئوية أعلى من الانفجارات ليوكيميك لتجنب الكشف غير محدد النشاط الأيضي لأنواع الخلايا الأخرى الموجودة في التعليق.
واحدة من الخطوات الحاسمة في تحليل البيانات هو التطبيع، حيث يمكن مقارنة المعلمات الأيضية بين عينات ليوكيميك مختلفة. حسب تجاربنا السابقة مع خطوط الخلايا ليوكيميك، وجدنا أن التطبيع إلى عدد الخلايا ويعطي نتائج أفضل. عدد محدد من الخلايا للبئر الواحد يحتاج يحددها الباحث ويعتمد على الحجم والنشاط الأيضي لاختبار الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نود أن نشكر مراكز أمراض الدم طب الأطفال التشيكية. وكان هذا العمل يدعم "منحة من وزارة الصحة" (NV15-28848A)، حسب وزارة الصحة في الجمهورية التشيكية، و "جامعة مستشفى موتول"، براغ، الجمهورية التشيكية 00064203 ووزارة التربية والتعليم والشباب و "الرياضة نبو" nr. LO1604.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
| Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
| L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
| HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
| Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
| Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |
References
- DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).
- Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate. Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).
- Wise, D. R., Thompson, C. B. Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer. Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).
- Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel. Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).
- Liberti, M. V., et al. A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product. Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).
- Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
- Hermanova, I., et al. Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells. Leukemia. 30, 209-218 (2016).
- Malandrino, M. I., et al. Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).
- Patella, F., et al. Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).
- Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).
- Simonnet, H., Vigneron, A., Pouysségur, J. Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption. Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).
- Martínez-Reyes, I., et al. TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions. Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).
- Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio. The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).
- Morciano, G., et al. Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals. Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).
- Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).
- Lee, K. -H., et al. Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator. The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).
- Godlewski, J., et al. MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells. Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).
- Kaplon, J., et al. A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence. Nature. 498, 109-112 (2013).
- Pardee, T. S., et al. A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).
- Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).
- Hrušák, O., Porwit-MacDonald, A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).
- Amin, H. M., et al. Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias. Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).
