Summary
여기 선물이 leukemic 세포 백혈병 환자 골 수에서 격리 및 그들의 대사 상태 분석을 위한 프로토콜. 기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가 1 차 셀의 수요 특성을 더 나은 하는 데 도움이 수 그리고 더 맞춤된 의학까지 이어질 수 있습니다.
Abstract
암 세포의 대사 요구 부정적인 생존 및 치료 효능에 영향을 미칠 수 있습니다. 요즘, 변화 통로의 제약을 대상으로 다양 한 종양에서에서 테스트 됩니다. 따라서, 암 세포 대사 설치의 대상 환자의 전반적인 결과 개선 하기 위해 올바른 경로 위해 불가피 하다. 불행 하 게도, 암의 대다수에서 악성 세포가 더 높은 숫자를 매우 어려운 및 조직 생 검 필요 합니다. 백혈병은 예외, 어디 leukemic 세포의 충분 한 수 골에서 격리 될 수 있습니다. 여기, 우리는 leukemic 세포 백혈병 환자 골 수에서 분리 및 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 그들의 대사 상태의 이후 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. Leukemic 세포는 그들의 생존에는 영향을 미치지 않습니다 밀도 그라데이션에 의해 격리 됩니다. 다음 재배 단계 재생성 하 그들을 도와, 따라서 대사 상태 측정은 최적의 조건에서 셀의 상태. 이 프로토콜은 개인된 치료에 사용 될 수 있는 일관 된, 잘 표준화 된 결과 달성 수 있습니다.
Introduction
신진 대사 프로필 셀의 주요 특징 중 하나 이며 변경 된 생체는 지금 암1,2,3의 특징 중 하나를 간주 됩니다. 또한, 신진 대사 설치에 변경 신호 변환 통로 또는 암 세포4,,56의 효소 기계 장치를 대상으로 암 치료에 사용 될 수 있습니다. 암 세포의 변화 경향을 알고 따라서 이점을 이며 현재 치료를 향상 시킬 수 있습니다.
문화에 있는 세포의 대사 활동을 평가할 수 있는 이미 설정 된 방법의 많음이 있다. 분해에 대하여 포도 당 통풍 관 측정 될 수 있다 방사성 라벨 2-NBDG를 사용 하 여 (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) 또는 extracellular 젖 산 수준 측정 효소7,8. 지방산 산화 속도 isotopically 레이블된 물9,10에 의해 측정 하는 또 다른 대사 매개 변수입니다. 산소 소비 속도 셀11,12, 미토 콘 드리 아 막 잠재적인 평가13,14, ATP/ADP (아데노신 함께 미토 콘 드리 아 활동을 결정 하는 데 널리 사용 되는 방법 5 '-3 인산 염/아데노신 5 '-diphosphate) 비율 측정15 또는 총 세포내 ATP 측정16. 알려진 대사 과정을 조절 하는 통로 신호 단백질 quantifications에 의해 결정 될 수 있었다 고 대사 측정17,,1819의 이해를 향상 시킬 수 있습니다.
그러나, 이러한 모든 방법을 하나만 측정 또는, 최고의 시나리오 하나에 몇 가지 변화 매개 변수는 동시에 샘플. 중요 한 것은, 산소 소비 속도 (OCR) 및 세포 외 산성화 속도 (ECAR)의 동시 측정, 예를 들어 해 마 XFp 분석기에 의해 세포 외 유출 분석에 의해 얻을 수 있습니다. OCR은 미토 콘 드리 아 호흡 ECAR 이며 주로 분해 (우리는 CO2 생산 가능성이 높은 산화 인 산화 활동 ECAR 셀의 높이 무시할 수 없는)의 결과20. 지금까지, 다양 한 세포 유형 사용이 분석기21,,2223공부 되었습니다.
여기 우리는 백혈병 환자에서 주요 폭발 (미 숙 조 혈 단계에서 파생 된 백혈병 세포)의 세포 외 유출 분석에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 지식 최선을 주 폭발에 대 한 특정 프로토콜 사용할 아직 아니에요.
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Protocol
모든 샘플 어린이 부모 또는 보호자의 informed consent와 찰스 대학에서 프라하, 체코 공화국, 연구 윤리 위원회의 승인을 얻어 졌다 아니. NV15-28848A입니다.
1입니다. 시 약의 준비
- 137 mM NaCl, 2.7 m m KCl, 4.3 m m 나2HPO4, 1.47 m m KH2포4, ddH2HCl Sterilize와 O. 조절 pH 7.4에 압력가 마로 소독 하 여 용 해 하 여 PBS의 500 mL를 준비 합니다.
- 100ml RPMI 매체의 준비: L-Alanyl-글루타민 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 μ g/mL)와 RPMI-1640 매체.
- 0.1 m M NaHCO3 증류수 50 mL를 준비 합니다. 8.1에 pH를 조정, 필터 (0.22 μ m) 소독 및 4 ° c.에 저장
참고: 두 개의 8-잘 세포 외 유출 분석기 접시, 0.1 m M NaHCO3 pH 8.1의 250 μ 준비. - 1 mL의 증류수에 2 M D-포도 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장
- 1mm Oligomycin A 에탄올에서의 100 μ를 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장
- 1 M 2-의하여-D-포도 당 (2-DG) 최소 DMEM (Dulbecco의 수정이 글의 중간)에서 250 μ를 준비 합니다. 37 ° C로 온난 하 고 pH 7.4 (37 ° C에서 pH 측정 수행)를 조정 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장
- 1mm DMSO에 FCCP (carbonyl 시안-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone)의 100 μ를 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장
- 100 μ에서 에탄올 1 m m로 테 논의를 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장
- 1 mg/mL 에탄올에 Antimycin A의 100 μ를 준비 합니다. 필터 (0.22 μ m)을 소독 하 고-20 ° c.에 저장
- 바로 사용 전에 분해 스트레스 테스트 매체의 10 mL를 준비 합니다. 물 욕조에 37 ° C 최소한 DMEM 따뜻한 고 pH 7.4 (37 ° C에서 pH 측정 수행)를 조정 합니다.
- 이전에 사용 하 여, BSA와 셀 미토 스트레스 테스트 매체의 10 mL를 준비 합니다. 2 m L-글루타민, 10 m m D-포도 당, 1mm HEPES (pH 7.4), 1 mM pyruvate와 0.1 %BSA (소 혈 청 알 부 민) 최소 DMEM을 보충. 따뜻한 물 욕조에 37 ° C를 pH 7.4 (37 ° C에서 pH 측정 수행)를 조정 합니다.
- 이전에 사용 하 여, BSA 없이 셀 미토 스트레스 테스트 매체의 10 mL를 준비 합니다. 2 m L-글루타민, 10 m m D-포도 당, 1mm HEPES (pH 7.4) 최소 DMEM 보충 및 1 mM pyruvate. 따뜻한 물 욕조에 37 ° C에 BSA 없이 셀 미토 스트레스 테스트 매체 고 pH 7.4 (37 ° C에서 pH 측정 수행)를 조정 합니다.
참고: BSA 매체 BSA와 보충 때 셀 FCCP에 더 나은 응답 때문에 셀 미토 스트레스 테스트 중간에 추가 됩니다 (다른 조건 테스트를 했다). BSA 없이 세포 미토 스트레스 테스트 매체 제조자는 매체에서 BSA를 사용 하 여 권장 하지 않습니다 포트 로드 사용 됩니다.
2. 단 세포 골 수에서 격리
참고: 이상적으로, 기본 백혈병 세포의 대사 상태의 측정은 골 수 수집 및 셀 격리 후 즉시 시작 한다. 그럼에도 불구 하 고, 관련 데이터 셀 분리 후 체코 공화국에 있는 다른 혈액학에서 교통 센터에서 또한 얻을 수 수 있습니다. 메 마른 조직 문화 후드에 모든 하위 단계를 수행 합니다.
- PBS와 실내 온도에 밀도 그라데이션 중간에 워밍업.
- 1: 1의 비율에 PBS 가진 백혈병 환자의 골 수 샘플을 희석. 샘플 leukemic 돌풍의 80% 이상 포함 되어 있는지 확인 합니다.
- Cytometry 특정 CD 마커를 사용 하 여 셀의 immunophenotype 특성에 의해 폭발의 백분율을 결정 합니다. 밀도 그라데이션 분리 후 전반적인 세포 수를 설치 하기 위하여 핵 산 핵 염료와 긍정적인 이벤트를 감지 합니다.
- 그런 다음, 백혈병의 각 유형에 대 한 특정 CD 마커를 사용 하 여 백혈병 세포를 결정: B-모든 (CD19, CD45), T-모든 (CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD99) 및 AML (CD45, CD33, 그리고 특정 골수성 마커)24. 모든 핵 세포 백혈병 폭발 세포의 백분율을 확인 하 여 특정 CD 표식에 대 한 긍정적인 백혈병 세포의 수를 나눕니다.
참고: 골 수 anticoagulants 튜브에 수집 수 있다. - 신중 하 게 6 mL 희석된 골 수 샘플 15 mL 원뿔 튜브에 밀도 그라데이션 매체의 이상 6 mL의 레이어. 브레이크 없이 진동 물통 회전자에 4 ° C에서 35 분에 대 한 400 x g에서 원심.
참고: 샘플의 더 큰 볼륨은 더 aliquots로 분할 될 수 또는 50 mL 원뿔 튜브 밀도 그라데이션 매체의 더 큰 금액으로 사용 될 수 있습니다. - 5 mL PBS의 새로운 50 mL 원뿔 튜브 interphase 레이어 단 세포 (그림 1)으로 구성 된 전송 신중 하 게 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여. 진동 물통 회전자에 4 ° C에서 10 분 동안 400 × g에서 원심.
참고: 단일 50 mL 원뿔 튜브 PBS의 5 mL에 모든 단 세포 층을 전송. - 상쾌한 발음 하 고 메 마른 PBS의 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
참고: aspirated 골의 1 mL에 백혈병 세포의 수는 환자25마다 크게 다릅니다.
3. 하룻밤 재배 단 세포의
참고: 모든 하위 단계를 수행 하는 살 균 조직 문화 후드.
- RPMI의 20 mL으로 두 T75 플라스 크를 준비 합니다. 각 플라스 크에 고립 된 30 x 106 단 셀을 추가 합니다. 16-24 h 5% CO2 와 37 ° C에 서 플라스 크로 셀을 품 어
4. 셀 접착제 코팅 접시의 준비
- 코트 두 8 잘 세포 외 유출 분석기 접시.
참고: 메 마른 조직 문화 후드에 코팅을 수행 합니다. - 2.2 μ의 세포 접착제 추가 (밀도: 2.54 mg/ml)을 0.1 m M NaHCO3, pH 8.1, 고 각 잘으로 피 펫 즉시 12.5 μ의 250 μ.
참고: 셀 접착제 재고 솔루션 그들의 밀도에 차이가, NaHCO3 에 따라 추가 볼륨을 조정할 수 있습니다. - 약 20 분, 후드에 앉아 셀 접착제 발음 그리고 잘 두 번 살 균 물 200 μ를 사용 하 여 각 세척 접시를 보자. 웰 스는 건조 때까지 뚜껑 열기와 후드에 앉아 보자.
- 지금 당장 접시를 사용 하 여 또는 응축을 피하기 위해 파라핀 영화에 싸여 테두리와 4 ° C에서 최대 1 주를 저장 합니다. 그 접시는 예 열 (약 20 분) 동안 실내 온도에 후드에 셀을 뿌리기 전에 확인 하십시오.
5입니다. 수 분이 센서 카트리지
참고: 수화물 2 8 잘 세포 외 유출 분석기 카트리지.
- 유틸리티 플레이트와 센서 카트리지를 분리 합니다. 거꾸로 실험실 벤치에 센서 카트리지를 놓습니다.
- 각 채우기 200 μ calibrant와 유틸리티 플레이트의 잘. Calibrant의 400 μ로 각 굴 우물의 외부 주위를 채우십시오.
- 이제는 calibrant를 포함 하는 유틸리티 접시에 센서 카트리지를 반환 합니다.
- 습도, 비 CO2, 37 ° C 배양 기 하룻밤 카트리지 어셈블리를 놓습니다.
- 세포 외 유출 분석기를 켜고 하자 37 ° C에 따뜻한 하룻밤.
6. 시드 셀 셀 접착제 코팅 판에
참고: 분해 스트레스 테스트를 사용 하 여 분해 스트레스 테스트 매체. 셀 미토 스트레스 테스트를 위해 BSA와 셀 미토 스트레스 테스트 매체를 사용 합니다.
- 씨 셀 분해 스트레스 테스트와 별도 접시에 셀 미토 스트레스 테스트에 대 한. 각 테스트에 대 한 숙박 문화 한 플라스 크에서 셀을 사용 합니다.
- 실 온에서 5 분 동안 200 x g에서 셀 원심 Resuspend 적절 한 매체의 1 mL에 셀과 그들.
- 4 x 106 라이브 셀 400 μ (사용 적절 한 매체)의 최종 볼륨을 추가 합니다.
- B-G. 웰 스에 세포 현 탁 액의 50 μ 접시 500000 셀 한 잘에 시드는 확인 합니다.
참고: 다른 정규화 수행 잘 당 정확 하 게 500, 000 셀을 시드하 결정적 이다. 그런 식으로 다른 환자에서 결과 비교할 수 있습니다. 여기 설명 대로 복제의 최적의 수 6,입니다. 적은 복제를 사용 하 여 이후 1 차 셀 잘못 행동 때로는 수 권장 하지 않습니다. - 웰 스 A와 H (이 웰 스 배경 수정 될 것입니다)에 적절 한 매체의 180 μ를 추가 합니다.
- 1로 설정 하는 브레이크와 함께 실 온에서 5 분에 대 한 400 x g에서 격판덮개 원심.
- 천천히, 그리고 신중 하 게 두 개의 8-잘 세포 외 유출 분석기 플레이트에 웰 스 B G에 적절 한 매체의 130 μ를 추가 합니다. 시각적으로 확인 하는 세포는 현미경에서 여 우물의 바닥에 안정적으로 준수는.
- 30 분 동안 37 ° C 배양 기, 습도, 비 CO2로 접시를 놓습니다.
7. 로드 센서 카트리지
- 분해 스트레스 테스트에 대 한 각 포도 당 100 m m, 20 μ M Oligomycin A와 1 M 2-DG, 분해 스트레스 테스트 중간에 모두 250 μ를 준비 합니다.
- 셀 미토 스트레스 테스트 준비 250 μ 각각 20 μ M Oligomycin A의 15 μ FCCP, 30 μ FCCP, 10 μ M의 혼합물으로 테 논 및 10 μ g/ml Antimycin A, BSA 없이 셀 미토 스트레스 테스트 중간에 모두.
참고: FCCP 적정에 대 한 충분 한 환자의 자료 없기 때문에 좋습니다 FCCP의 한 분석 결과에 두 개의 농도 주입. 그럼에도 불구 하 고, 농도 연구원에 의해 결정 되어야 합니다. - 화합물의 카트리지 (표 1)을 다음과 같이 적절 한 인젝터 포트 로드:
8. 프로그램 설정
- 표 2에 설명 된 대로 해당 분해 스트레스 테스트에 대 한 프로그램을 설정 합니다.
- 표 3에 설명 된 대로 셀 미토 스트레스 테스트에 대 한 프로그램을 설정 합니다.
- 프로그램을 시작 합니다. 분석 결과 플레이트 (나타나면) calibrant 플레이트를 교체 합니다.
9. 평가 및 결과의 해석
- 분해 스트레스 테스트 결과에 다른 모든 ECAR 값에서 2-DG 주입 후 최저 ECAR 값을 뺍니다.
참고:이 값이 낮은 비 glycolytic 산성화를 나타냅니다. 일반적으로, 가장 낮은 값은 4회 측정에서. - 기저 산성화, 분해, 최대한 분해 및 glycolytic 함수 (그림 2A)에서 Glycolytic 예약 매개 변수를 계산 합니다. 첫 번째 3 개의 측정 지점에서 ECAR의 의미로 기저 산성화 ECAR 최소값을 뺀 후 계산 (생략 첫 번째 ECAR 값 크게 다른 2에서와 다른 경우), 3 측정에서 ECAR의 뜻으로 분해를 계산 포도 당 주입 후 포인트와 최대한 분해 ECAR의 3 측정에서 평균 포인트 Oligomycin 후 주사를 계산. 계산 Glycolytic 분해 마이너스 최대한 분해로 예비.
참고: 또는, 최대한 분해 계산에 대 한 3 점 측정에서 가장 높은 ECAR 값을 사용 합니다. - 셀 미토 스트레스 테스트 결과에 다른 모든 OCR 값에서로 테 논/Antimycin A 주입 후 최저 OCR 값을 뺍니다.
- 기초 호흡, ATP 생산, 최대한 호흡 및 미토 콘 드리 아 기능 (그림 2B)에서 예비 용량 매개 변수를 계산 합니다. 뺀 후 OCR 최소값, 첫번째 3 개의 측정 지점에서 OCR의 뜻으로 기저 호흡을 계산 합니다.
참고: 최대한 호흡 FCCP 주입 후 가장 높은 OCR 값입니다. - ATP 생산 계산, 기초 호흡에서 Oligomycin A 주입 후 3 OCR 측정 포인트의 평균을 뺍니다. 기초 호흡 마이너스 최대한 호흡으로 예비 용량을 계산 합니다.
참고: 항상 사용 FCCP 농도 상관 없이 높은 OCR 값에서 최대한 호흡을 계산 합니다.
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Representative Results
그림 3 BCP-모든 (B 세포 선구자 급성 림프 구성 백혈병)과 급성 골수성 백혈병 (급성 골수성 백혈병) 환자에서 분해 스트레스 테스트 및 leukemic 돌풍의 셀 미토 스트레스 테스트 측정 후 곡선을 보여준다. 이 측정에서 대사 매개 변수 계산도 표시 됩니다. 잘 당 500000 셀 시드 했다 그리고 모든 측정 hexaplicates에서 수행 했다.
분해 스트레스 테스트 셀 양분의 박탈 하는 유일한 기저 매체 사용 됩니다. 얻은 첫 번째 매개 변수는 셀에 저장 된 포도 당의 양을 반영 한다 기저 산성화. 첫 번째 주사 후 ECAR 이후 세포 포도 당을 활용 하 고 젖이 나올 그것을 발효 수 있습니다 증가 합니다. 두 번째 주입에서 Oligomycin A ATP synthase를 억제 하 고 따라서 주로 분해를 통해 ATP를 생산 하는 세포를 지시. 이 추가 상승 ECAR로 인해 한다. 2-DG의 주사는 완전히 분해를 억제 하 고 ECAR 드랍 스.
세포는 모든 양분의 박탈 하지 하 고 그들의 기저 대사 상태를 반영 하는 기저 호흡 매개 변수 셀 미토 스트레스 테스트에서 글루타민과 포도 당으로 보충 하는 매체 사용 됩니다. Oligomycin A와 함께 첫 번째 주사 후 세포 미토 콘 드리 아 호흡을 억제 하 고 분해 감소 OCR로 표시 되는 전환. FCCP (두 번째 및 세 번째 주사), 다른 한편으로, uncouples, 호흡에서 ATP 생산 있도록 셀 지금 최대한 속도 그것의 가장 높은 값을 OCR 상승에 산소 소비. 로 테 논, Antimycin A 혼합물의 마지막 주입 완전히 미토 콘 드리 아 호흡을 억제 하 고 OCR 0에 가까운 감소.
그림 1: 골 수 샘플의 밀도 그라데이션 원심. 단 세포 농축 leukemic 세포에 대 한 밀도 그라데이션 매체에 의해 구분 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 해당 분해 스트레스 테스트 및 셀 미토 스트레스 테스트의 개요 (A) 분해 스트레스 테스트의 모범적인 결과. (B) 세포 미토 스트레스 테스트의 모범적인 결과. 매개 변수 곡선 내에서 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: leukemic 돌풍 BCP-모든 (A, B) 및 (B, C) 급성 골수성 백혈병 환자에서의 세포 외 유출 분석. (A 와 C) 분해 스트레스 테스트 결과. 첫 번째 측정 지점 나머지에서 크게 다를 수 있습니다 및 경우에 분석에서 제외 되도록 note 하시기 바랍니다. (B 와 D) 셀 미토 스트레스 테스트 결과. 매개 변수 곡선 내에서 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 포트 | 분해 스트레스 테스트 | 셀 미토 스트레스 테스트 | ||
| 포트 로드 | 우물에서 최종 농도 | 포트 로드 | 우물에서 최종 농도 | |
| A | 포도 당 100 m m의 20 μ | 10 m m 포도 당 | 20 μ M Oligomycin A의 20 μ | 2 μ M Oligomycin A |
| B | 20 μ M Oligomycin A의 22 μ | 2 μ M Oligomycin A | 15 μ FCCP의 22 μ | 1.5 Μ M FCCP |
| C | 1 M 2-DG의 25 μ | 100 m m 2-DG | 30 μ FCCP의 25 μ | 4.5 Μ M FCCP |
| D | X | 10 μ M로 테 논의 25 μ와 10 μ g/ml Antimycin A | 1 μ M로 테 논 및 1 μ g/ml Antimycin A | |
표 1: 복합 볼륨.
| 단계 | 설정 |
| 교정 | 자동 번역 |
| 재래식 | 자동 번역 |
| 초기 측정 | 3 시간: 0 분, 측정-3 분-3 분, 대기-혼합 |
| 포트 A의 주입 | 사출 |
| 측정 | 3 시간: 0 분, 측정-3 분-3 분, 대기-혼합 |
| 포트 B의 주입 | 사출 |
| 측정 | 3 시간: 0 분, 측정-3 분-3 분, 대기-혼합 |
| 포트 C의 주입 | 사출 |
| 측정 | 4 시간: 0 분, 측정-3 분-3 분, 대기-혼합 |
표 2: 해당 분해 스트레스 테스트에 대 한 프로그램입니다.
| 단계 | 설정 |
| 교정 | 자동 번역 |
| 재래식 | 자동 번역 |
| 초기 측정 | 3 시간: 0 분, 측정-3 분-3 분, 대기-혼합 |
| 포트 A의 주입 | 사출 |
| 측정 | 3 시간: 0 분, 측정-3 분-3 분, 대기-혼합 |
| 포트 B의 주입 | 사출 |
| 측정 | 3 시간: 0 분, 측정-3 분-3 분, 대기-혼합 |
| 포트 C의 주입 | 사출 |
| 측정 | 3 시간: 0 분, 측정-3 분-3 분, 대기-혼합 |
| D 포트의 주입 | 사출 |
| 측정 | 3 시간: 0 분, 측정-3 분-3 분, 대기-혼합 |
표 3: 셀 미토 스트레스 테스트에 대 한 프로그램.
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Discussion
(모두) 급성 림프 구성 백혈병 환자에서 파생 하는 기본 leukemic 돌풍에 OCR 및 ECAR 값으로 평가 하는 신진 대사 활동의 측정에 대 한 상기 설명 된 프로토콜 허용 또는 급성 골수성 백혈병 (AML). 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 측정의 장점은 실시간으로 살아있는 세포에서 대사 프로 파일의 검색 수 있습니다. 기본적으로 제공 된 프로토콜에서 모든 단계 하나 공부 계획 셀 유형에 따라 조정 될 수 있습니다. 여기, 우리는 결과 영향을 미칠 수 있는 최적의 값 보다 적게 제공할 수 있는 가장 중요 한 매개 변수를 설명 합니다.
최적화 향한 첫 번째 단계는 재료를 냉동 신선한 소재 대에서 가져온 데이터의 비교 했다. 액체 질소 은행에 저장 된 환자의 샘플의 회고전 연구에 대 한 냉동된 재료에서 신진 대사 활동을 측정 하는 능력 수 있습니다. 모든 샘플의 경우 AML 셀 드 최적의 결과와 동결 후 또한 측정 하는 반면 신선한 소재로 일관 된 신진 대사 활동을 감지할 수 있었습니다.
최적화 쪽으로 두 번째 단계는 기본 leukemic 돌풍의 재배 이다. (경작) 하지 않고 밀도 그라데이션 분리 후 바로 또는 하룻밤 배양 한 후 세포의 대사 활동을 테스트 했습니다. 경우에 밀도 그라데이션 분리 후 셀 실용적이 고 중요 한 현미경을 보 니, 그들의 신진 대사 활동 장애인 이었다. 전반적인 ECAR 및 OCR 값 낮은 고도, 주입, 후 OCR 또는 ECAR 값 응답 하지 않았습니다 최적의 재배 셀에.
다른 조건 하에서 재배 또한 결과 좌우할 수 있다. 인슐린 처리가 나트륨 selenite 보충 (ITS)를 사용 하 여8, 폭발의 주요 재배 하지만이 보충 교재는 세포의 신진 대사 활동 방해 좋은 연습으로 간주 됩니다. 셀 미토 스트레스 테스트 동안 leukemic 돌풍 ITS와 재배 Oligomycin A에 응답 하지 않았습니다 (OCR는 ATP 연결 호흡을 계산 하려면 감소 한다). 우리는 또한 공동 중간 엽 줄기 세포 (MSC)와 세포 배양 하려고 하지만 경우에, OCR 및 ECAR 값가지고 되었습니다 낮은에 비해 MSCs 없이 재배 하는 셀. 요약 하자면, 재배 RPMI에 백혈병 환자에서 1 차 폭발 중간 10 %FBS 최상의 옵션입니다.
그들의 신진 대사 프로필 특성에 대 한 적합 한 환자는 한 손으로 테스트 샘플 수에 하지만 다른 관련성이 높은 결과 얻을 것 이다 특정 기준을 충족 해야 합니다. 우리가 높은 cellularity 환자 대사 기능 측정 (하나의 측정에 대 한 우리 500000 셀 시드 / hexaplicate 웰 스 당) 80와 leukemic 돌풍의 더 높은 백분율 샘플만 난다의 탐지를 피하기 위해 측정 될 수 다른 종류의 세포 현 탁 액에 있는 신진 대사 활동.
데이터 분석에 중요 한 단계 중 하나는 정상화, 다른 leukemic 샘플 사이 변화 매개 변수를 비교할 수입니다. 우리의 이전 실험 leukemic 세포 선으로 수행에 따르면 우리는 셀의 수를 정규화 최상의 결과 제공 발견. 잘 당 세포의 특정 번호는 연구원에 의해 결정 되어야 하 고 크기와 시험된 세포의 대사 활동에 따라 달라 집니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 체코 소아 혈액학 센터 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 내가 nr 부여의 사역의 건강 (NV15-28848A), 보건 및 교육, 청소년 및 스포츠 NPU 대학 병원 Motol, 체코 공화국, 프라하, 체코 공화국 00064203에 의해에서 지원. LO1604입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
| Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
| L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
| HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
| Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
| Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |
References
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