Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Vurdering av metabolske profilen til primære leukemi celler

doi: 10.3791/58426 Published: November 21, 2018

Summary

Her presenterer vi en protokoll for isolering av leukemic celler fra leukemi pasienter benmargen og analyse av deres metabolske tilstand. Vurdering av metabolske profilen til primære leukemi celler kan bidra til å bedre karakterisere etterspørselen av primære celler og føre til mer personlig medisin.

Abstract

Metabolske behovet av kreftceller kan negativt påvirke overlevelse og behandling effekt. I dag, er farmasøytiske målretting av metabolske veier testet i mange typer av svulst. Dermed er karakteristikk av kreft cellen metabolske oppsett uunngåelig for å målrette den riktige veien for å øke det samlede resultatet av pasienter. Dessverre, i de fleste av kreft, ondartet cellene er ganske vanskelig å få tak i høyere tall og vev biopsi er nødvendig. Leukemi er et unntak, der et tilstrekkelig antall leukemic celler kan isoleres fra benmargen. Her gir vi en detaljert protokoll for isolering av leukemic celler fra leukemi pasienter benmargen og påfølgende analyse av sine metabolske staten ved hjelp av ekstracellulære flux analyzer. Leukemic celler er isolert av tetthet gradient, hvilke ikke påvirker sin levedyktighet. Neste dyrking trinn hjelper dem å regenerere, dermed metabolske staten målt er celler under optimale forhold. Denne protokollen tillater å oppnå konsistente, godt standardisert resultater, som kan brukes for personlig terapi.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Metabolsk profilen er en av de viktigste egenskapene av celler og endret bioenergi er nå regnet som en av kjennetegnene kreft1,2,3. Videre kan endringer i metabolske oppsettet brukes i behandling av kreft ved å målrette signaltransduksjon trasé eller enzymatisk maskiner kreft celler4,5,6. Å vite den metabolske predisposisjon av kreftceller er således en fordel og kan forbedre gjeldende terapi.

Det er en masse allerede etablerte metoder som kan vurdere metabolske aktiviteten til cellene i kultur. Om Glykolysen, glukose opptak kan måles ved radioaktivt merkingen, med 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) eller ekstracellulær laktat nivåer målt enzymatisk7,8. Fettsyrer er oksidasjon en annen metabolske parameter målt ved isotopically merket palmitate9,10. Oksygen forbruksraten er en metode mye brukt for å bestemme mitokondrie aktivitet i cellene11,12, sammen med de mitokondrie membran potensielle evaluering13,14, ATP/ADP (adenosin 5 '-trifosfat/5 '-adenosindifosfat) forholdet måling15 eller totalt intracellulær ATP måling16. Signalnettverk trasé kjent for å regulere metabolske prosesser kan bestemmes av protein quantifications og kan forbedre forståelsen av metabolske målinger17,18,19.

Men alle disse metodene mål bare ett, eller inne det best filmmanuskriptet, noen metabolske parametere i en prøve samtidig. Viktigere, kan samtidig måling av oksygen forbruksraten (OCR) og ekstracellulære forsuring rate (ECAR) oppnås ved ekstracellulære flux analysen av, for eksempel Seahorse XFp Analyzer. OCR er en indikator på mitokondrie åndedrett og ECAR skyldes hovedsakelig Glykolysen (vi ikke kan overse CO2 produksjon muligens heve ECAR celler med høy oxidative fosforylering aktivitet)20. Så langt, har ulike celletyper studert ved bruk av disse analyserer21,22,23.

Her beskriver vi protokollen for ekstracellulære flux analyse av primære eksplosjonene (leukemi celler avledet fra umodne blodkreft scenen) fra leukemi pasienter. Best av vår kunnskap er en bestemt protokoll for primære eksplosjonene ikke tilgjengelig ennå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle prøver ble oppnådd med informed consent av barnas foreldre eller foresatte og godkjenning av etiske Charles University i Praha, Tsjekkia, studien ingen. NV15-28848A.

1. forberedelse av reagenser

  1. Klargjør 500 mL PBS ved oppløsning 137 mM NaCl 2.7 mM KCl 4.3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, i ddH2O. justere pH 7,4 med HCl. Sterilize av autoklavering.
  2. Forberede 100 mL RPMI medium: RPMI-1640 medium med L-Alanyl-glutamin supplert med 10% fosterets bovin serum (FBS), penicillin (100 U/mL) og streptomycin (100 μg/mL).
  3. Forberede 50 mL av 0.1 M NaHCO3 i destillert vann. Justere pH til 8.1, filter sterilisere (0.22 μm) og lagre på 4 ° C.
    Merk: For to 8-vel ekstracellulære flux analyzer plater, forberede 250 μL 0.1 M NaHCO3 pH 8.1.
  4. Forberede 1 mL av 2 M D-glukose i destillert vann. Filteret sterilisere (0.22 μm) og lagre på 20 ° C.
  5. Forberede 100 μL 1 mM Oligomycin A i etanol. Filteret sterilisere (0.22 μm) og lagre på 20 ° C.
  6. Forberede 250 μL 1 M 2-deoxy-D-glukose (2-DG) i Minimal DMEM (Dulbeccos endret Eagle's medium). Varme til 37 ° C og justere pH 7,4 (gjennomføre pH-måling på 37 ° C). Filteret sterilisere (0.22 μm) og lagre på 20 ° C.
  7. Forberede 100 μL 1 mM FCCP (karbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) i DMSO. Filteret sterilisere (0.22 μm) og lagre på 20 ° C.
  8. Forberede 100 μL 1 mM rotenon i etanol. Filteret sterilisere (0.22 μm) og lagre på 20 ° C.
  9. Forberede 100 μL 1 mg/mL Antimycin A i etanol. Filteret sterilisere (0.22 μm) og lagre på 20 ° C.
  10. Like før bruk, forberede 10 mL av Glykolysen stresstest medium. Varm Minimal DMEM 37 ° c i et vannbad og justere pH 7,4 (gjennomføre pH-måling på 37 ° C).
  11. Før bruk, forberede 10 mL av cellen Mito stresstest medium med BSA. Supplere Minimal DMEM med 2 mM L-glutamin, 10 mM D-glukose, 1 mM HEPES (pH 7.4), 1 mM pyruvate og 0,1% BSA (bovine serum albumin). Varmt 37 ° c i et vannbad og justere pH 7,4 (gjennomføre pH-måling på 37 ° C).
  12. Før bruk, forberede 10 mL av cellen Mito stresstest medium uten BSA. Supplere Minimal DMEM med 2 mM L-glutamin, 10 mM D-glukose, 1 mM HEPES (pH 7.4) og 1 mM pyruvate. Varm celle Mito stresstest medium uten BSA 37 ° c i et vannbad og justere pH 7,4 (gjennomføre pH-måling på 37 ° C).
    Merk: BSA er lagt til celle Mito stresstest medium fordi cellene reagerer best på FCCP når mediet er supplert med BSA (ulike forhold var testet). Cellen Mito stresstest medium uten BSA brukes for lasting portene som produsenten ikke anbefaler bruk BSA i medium.

2. isolering av mononukleære celler fra benmargen

Merk: Ideelt måling av metabolske primære leukemi celler skal begynne umiddelbart etter benmarg samling og celle isolasjon. Likevel kan relevante data også hentes fra celler isolert etter transport fra andre hematologi sentre i Tsjekkia. Utfør alle undertrinnene i sterilt vev kultur hette.

  1. Varm opp PBS og tetthet gradert medium til romtemperatur.
  2. Fortynne benmarg prøven av leukemi pasient med PBS, i forholdet 1:1. Kontroller at utvalget inneholder minst 80% av leukemic støt.
  3. Bestemme prosentandelen av eksplosjonene ved flowcytometri med bestemte CD markører for immunophenotype karakteristikk av celletyper. Etter tetthet gradert separasjon, oppdage nukleinsyre positive hendelser med en kjernefysisk fargestoff for å etablere den totale celletall.
  4. Deretter bestemme leukemi celler med bestemte CD markører for hver leukemi: B-alle (CD19, CD45), T-alle (CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD99) og AML (CD45, CD33 og bestemt myelogen markører)24. Del antall leukemi celler positivt for bestemte CD markører av alle kjernefysiske cellene for å fastslå prosentandelen av leukemi blast celler.
    Merk: Benmargen har å bli samlet inn i rørene med antikoagulanter.
  5. Nøye laget 6 mL av utvannet benmarg prøve over 6 mL av tetthet gradert mediet i en 15 mL konisk rør. Sentrifuge 400 x g for 35 min ved 4 ° C i en svingende bøtte rotor uten brems.
    Merk: Større volum av utvalget kan deles inn i flere dele eller 50 mL konisk rør kan brukes med den store mengden av tetthet gradert medium.
  6. Bruke en Pasteur pipette, nøye overføre interphase laget som består av mononukleære celler (figur 1) til en ny 50 mL konisk tube med 5 mL PBS. Sentrifuge 400 × g i 10 min på 4 ° C i en svingende bøtte rotor.
    Merk: Overføre alle mononukleære celle lag til en enkelt 50 mL konisk tube med 5 mL PBS.
  7. Sug opp nedbryting og resuspend celle pellet i 2 mL steril PBS. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
    Merk: Antall leukemi celler i én mL av aspirerede benmarg avviker vesentlig blant pasienter25.

3. overnatting dyrking av mononukleære celler

Merk: Utfør alle undertrinnene i sterilt vev kultur hette.

  1. Forberede to MT75 flasker med 20 mL RPMI. Hver kolbe, legge 30 x 106 isolert mononukleære celler. Inkuber cellene med kolbe stå opp for 16-24 h på 5% CO2 og 37 ° C.

4. forberedelse av cellen lim-belagt plater

  1. Coat to 8-vel ekstracellulære flux analyzer plater.
    Merk: Utfør belegget i sterilt vev kultur hette.
  2. Tilsett 2.2 μL av cellen lim (tetthet: 2,54 mg/ml) å 250 μL 0.1 M NaHCO3pH 8.1 og pipette umiddelbart 12,5 μL løsningen i hver brønn.
    Merk: Cellen lim lager løsninger kan varierer i sine tetthet, justere volumet til NaHCO3 tilsvarende.
  3. La platene sitte i panseret i ca 20 min, og Sug opp cellen limet og vaske hver vel to ganger med 200 μL av sterilt vann. La det sitte i panseret med lokk åpent til brønner er tørre.
  4. Bruke platene umiddelbart eller lagre opptil 1 uke på 4 ° C med rim innpakket i parafin film å unngå kondens. Sikre at platene er varmet opp til romtemperatur (for ca 20 min) i panseret før såing cellene.

5. hydrering av Sensor patron

Merk: Hydrat to 8-vel ekstracellulære flux analyzer blekkpatroner.

  1. Separate verktøyet platen og sensor kassetten. Plassere sensoren kassetten opp ned på lab-benken.
  2. Fyll hver brønn av verktøyet platen med 200 μL calibrant. Fyll hver vollgrav rundt utsiden av brønnene med 400 μL calibrant.
  3. Returnere sensor kassetten til verktøyet plate som nå inneholder calibrant.
  4. Sett inn tonerkassettenheten i en fuktet, ikke-CO2, 37 ° C inkubator over natten.
  5. Slå på den ekstracellulære flux analyzer og la den varmes til 37 ° C over natten.

6. seeding celler i cellen lim belagte plater

Merk: For Glykolysen stress test, bruke Glykolysen stresstest medium. For cellen Mito stress test, bruker du cellen Mito stresstest medium med BSA.

  1. Frø celler for Glykolysen stresstest og celle Mito stresstest i separate plater. For hver test, bruker du cellene fra en flasken natten kultur.
  2. Sentrifuge cellene på 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Resuspend celler i 1 mL av aktuelle mediet og telle dem.
  3. Legge til 4 x 106 levende celler i det siste bindet 400 μL (bruk passende medium).
  4. Plate 50 μL av cellen suspensjon i brønner B-G. Sikre 500.000 celler er seeded i en brønn.
    Merk: Det er avgjørende å frø nøyaktig 500.000 celler per brønn som ingen andre normalisering er utført. Måten kan resultatene fra pasienter sammenlignes. Det optimale antallet gjentak er seks, som er beskrevet her. Bruke mindre gjentak anbefales ikke da primær celler kan noen ganger opptrer feilaktig.
  5. Legg til 180 μL aktuelle mediet i brønner A og H (disse brønnene vil tjene som en bakgrunn korrigering).
  6. Sentrifuge platen på 400 x g i 5 minutter ved romtemperatur med brems satt til 1.
  7. Legge til 130 μL av passende medium brønner B-G i to 8-vel ekstracellulære flux analyzer plater sakte og forsiktig. Visuelt Bekreft at cellene følges stabilt til bunnen av brønnene ved visning under mikroskopet.
  8. Plass platen i en fuktet, ikke-CO2, 37 ° C inkubator for 30 min.

7. lasting Sensor kassetten

  1. For Glykolysen stress test, forberede 250 μL hver av 100 mM glukose, 20 μM Oligomycin A og 1 M 2-DG, alle i Glykolysen stresstest medium.
  2. For cellen Mito stress test, forberede 250 μL hver av 20 μM Oligomycin, 15 μM FCCP, 30 μM FCCP og en blanding av 10 μM rotenon og 10 μg/ml Antimycin A, i celle Mito stresstest medium uten BSA.
    Merk: Sprøytebruk to konsentrasjoner av FCCP i en analysen anbefales siden det ikke er nok pasientenes materiale for FCCP Serine. Likevel bør konsentrasjonen fastsettes av forskeren.
  3. Laste forbindelser til riktig injektor portene av kassetten som følger (tabell 1):

8. sette opp programmet

  1. Glykolysen stress test, sette opp programmet som beskrevet i tabell 2.
  2. For cellen Mito stress test, angi programmet som beskrevet i tabell 3.
  3. Start programmet. Erstatte calibrant plate med analysen platen (når du blir spurt).

9. evaluering og tolkning av resultatene

  1. Glykolysen stresstest treff, trekk den laveste verdien ECAR etter 2-DG injeksjon fra alle andre ECAR verdier.
    Merk: Denne laveste verdien representerer den ikke-glycolytic forsuring. Den laveste verdien er vanligvis fra 4th målingen.
  2. Beregne basale forsuring, Glykolysen, maksimal Glykolysen og Glycolytic reserve parametere fra glycolytic funksjonen (figur 2A). Fratrukket laveste ECAR verdi, beregne basale forsuring som en ECAR fra første tre målepunktene (utelate den første ECAR-verdien hvis det er betydelig forskjellig fra to andre), beregne Glykolysen som en ECAR fra tre måling poeng etter glukose injeksjon og beregne maksimal Glykolysen som et gjennomsnitt på ECAR fra tre måling poeng etter Oligomycin en injeksjon. Beregne Glycolytic reserve som maksimal Glykolysen minus Glykolysen.
    Merk: Alternativt for maksimal Glykolysen beregning, bruke høyeste ECAR verdien fra tre poeng målt.
  3. I celle Mito stress testresultater, trekk den laveste OCR-verdien etter rotenon/Antimycin A injeksjon fra alle andre OCR-verdier.
  4. Beregne basale åndedrett, ATP produksjon, maksimal åndedrett og ledig kapasitet parametere fra Mitokondrielt funksjon (figur 2B). Fratrukket laveste OCR verdi, beregne basale åndedrett som en av OCR fra første tre målepunktene.
    Merk: Maksimal åndedrett er den høyeste OCR-verdien etter FCCP injeksjon.
  5. For beregning av ATP produksjonen, trekk gjennomsnittet av de tre OCR-målepunktene etter Oligomycin A injeksjon fra basale åndedrett. Beregne ledig kapasitet som maksimal åndedrett minus basale åndedrett.
    Merk: Alltid beregne maksimal åndedrett fra den høyeste OCR-verdien, uansett FCCP konsentrasjonen brukes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 3 viser kurvene etter Glykolysen stresstest og celle Mito stresstest målinger av leukemic støt fra BCP-alle (B-celle forløper akutt lymfatisk leukemi) og AML (akutt myelogen leukemi) pasienter. Beregningen av metabolske parameterne fra disse målingene er også indikert. 500.000 celler per brønn var frø og alle mål ble gjort i hexaplicates.

Bare basale mediet brukes i Glykolysen stress test, slik at cellene er fratatt næringsstoffer. Den første parameteren oppnådd er de basale forsuring, som bør gjenspeile glukose i cellene. Etter første injeksjon økes ECAR siden celler bruker glukose og kan gjære å laktat. Oligomycin A i andre injeksjon hemmer ATP syntase og dermed leder cellene til å produsere ATP hovedsakelig via Glykolysen. Dette skal gi ytterligere heving av ECAR. Injeksjon av 2-DG hemmer helt Glykolysen og ECAR faller.

I celle Mito stress test, et medium med glutamin og glukose er brukt, slik at cellene ikke er fratatt alle næringsstoffene og parameteren basale åndedrett gjenspeiler sin basal metabolske tilstand. Etter første injeksjon med Oligomycin A, celler hemme mitokondrie åndedrett og bytte til Glykolysen som er representert som en nedgang på OCR. FCCP (andre og tredje sprøytebruk), uncouples på den annen siden, ATP produksjonen fra åndedrett, slik at cellene nå forbruker oksygen maksimal hastighet og OCR stige til høyeste verdi. Siste injeksjon av rotenon og Antimycin A blanding hemmer helt mitokondrie åndedrett og OCR er redusert nær null.

Figure 1
Figur 1: tetthet gradert sentrifugering av benmarg utvalget. Mononukleære celler beriket for leukemic celler skilles med tetthet gradert medium. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: oversikt over Glykolysen stresstest og celle Mito stress test (A) eksemplarisk resultatet av Glykolysen stress test. (B) eksemplarisk resultatet av cellen Mito stress test. Parametere angis i kurver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: ekstracellulære flux analyse av leukemic støt fra BCP-alle (A, B) og AML (B, C) pasienten. (A og C) Glykolysen stress testresultater. Merk at den første målingen kan betydelig forskjellig fra resten og bør utelukkes fra analyse i så fall. (B og D) cellen Mito stress testresultater. Parametere angis i kurver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Port Glykolysen stresstest Cellen mito stresstest
Legg til port Siste konsentrasjon i brønnene Legg til port Siste konsentrasjon i brønnene
A 20 μL 100 mM glukose 10 mM glukose 20 μL 20 μM Oligomycin A 2 μM Oligomycin A
B 22 μL 20 μM Oligomycin A 2 μM Oligomycin A 22 μL 15 μM FCCP 1,5 ΜM FCCP
C 25 μL 1 M 2-DG 100 mM 2-DG 25 μL 30 μM FCCP 4,5 ΜM FCCP
D X 25 μL 10 μM rotenon og 10 μg/ml Antimycin A 1 μM rotenon og 1 μg/ml Antimycin A

Tabell 1: Sammensatte volumer.

Trinn Innstillinger
Kalibrering Automatisk
Balanse Automatisk
Opprinnelig plan måling Tre ganger: blande-3 min, vent-0 min, mål-3 min
Injeksjon av port A Injeksjon
Måling Tre ganger: blande-3 min, vent-0 min, mål-3 min
Injeksjon av porten B Injeksjon
Måling Tre ganger: blande-3 min, vent-0 min, mål-3 min
Injeksjon av porten C Injeksjon
Måling Fire ganger: blande-3 min, vent-0 min, mål-3 min

Tabell 2: Program for Glykolysen stress test.

Trinn Innstillinger
Kalibrering Automatisk
Balanse Automatisk
Opprinnelig plan måling Tre ganger: blande-3 min, vent-0 min, mål-3 min
Injeksjon av port A Injeksjon
Måling Tre ganger: blande-3 min, vent-0 min, mål-3 min
Injeksjon av porten B Injeksjon
Måling Tre ganger: blande-3 min, vent-0 min, mål-3 min
Injeksjon av porten C Injeksjon
Måling Tre ganger: blande-3 min, vent-0 min, mål-3 min
Injeksjon av porten D Injeksjon
Måling Tre ganger: blande-3 min, vent-0 min, mål-3 min

Tabell 3: Program for cellen Mito stress test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ovenfor beskrevet protokollen tillater for måling av metabolske aktiviteten vurdert av OCR og ECAR verdier i primære leukemic støt fra pasienter med akutt lymfatisk leukemi (alle) eller akutt myelogen leukemi (AML). Fordelen med måling ved hjelp av en ekstracellulære flux analyserer er at den lar påvisning av metabolske profil i sanntid i live cellene. Hovedsak kan alle trinn i angitte protokollen justeres avhengig celle man planlegger å studere. Her vil vi diskutere de viktigste parameterne som kan påvirke resultatene og kunne gi mindre enn optimal verdier.

Første skritt mot optimalisering var en sammenligning av data fra frisk materiale vs frosset materiale. Muligheten til å måle metabolske aktiviteten fra frosne materialet ville tillate retrospektiv studier av pasienter prøver lagret i flytende nitrogen bank. Ved alle prøver kunne vi oppdage konsekvent metabolsk aktivitet fra ferskt materiale mens AML celler ble målt også etter de fryser med optimale resultater.

Det andre trinnet mot optimalisering er dyrking av primære leukemic støt. Vi har testet metabolske aktiviteten til cellene rett etter tetthet gradert separasjon (uten dyrking) eller dyrking over natten. Selv om cellene etter tetthet gradert separasjonen så levedyktig og viktig under et mikroskop, var deres metabolsk aktivitet svekket. Samlet ECAR og OCR var lavere og også etter injeksjon, OCR-eller ECAR svarte ikke optimalt som de gjorde i dyrket celler.

Dyrking under ulike forhold kan også påvirke resultatene. Bruker insulin transferrin natrium selenitt supplement (ITS) anses lurt når dyrke primære eksplosjonene8, men dette tillegget forstyrrer metabolske aktiviteten til cellene. Under cellen Mito stress test, leukemic eksplosjonene dyrket med sin svarte ikke på Oligomycin A (OCR bør redusere for å beregne ATP-tilknyttet åndedrett). Vi har også prøvd å dyrke co cellene med mesenchymal stamceller (MSC), men i dette tilfellet OCR-og ECAR har vært lavere sammenlignet med celler dyrket uten MSCs. I sammendraget, dyrke primære støt fra leukemi pasienter i RPMI medium med 10% FBS er det beste alternativet.

Pasienter egnet for en karakterisering av metabolske profilen må oppfylle visse kriterier som på én hånd begrense antall testet prøver, men på den andre vil gi relevante resultater. Vi målt metabolsk funksjon av pasienter med høy cellularity (for en måling vi seeded 500.000 celler per brønner i hexaplicate) og bare prøver med 80 og en høyere prosentandel av leukemic eksplosjonene kan måles for å unngå deteksjon av uspesifikke Metabolsk aktivitet andre celletyper i suspensjon.

En av de avgjørende skritt i dataanalyse er normalisering, slik at metabolsk parametere mellom forskjellige leukemic eksempler kan sammenlignes. Etter vår forrige eksperimenter utført med leukemic cellelinjer, fant vi at normalisering antall celler gir de beste resultatene. Bestemt antall celler per brønn må bestemmes av forskeren og avhenger av størrelsen og metabolsk aktivitet testet celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi ønsker å takke den tsjekkiske Pediatric hematologi sentre. Dette arbeidet var støttet av Grant av Helsedepartementet (NV15-28848A), av Helsedepartementet av Tsjekkia, University Hospital Motol, Prague, Tsjekkia 00064203 og departementet for utdanning, ungdom og sport NPU jeg nr. LO1604.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement Gibco, ThermoFisher Scientific 61870-010
Fetal Bovine Serum Biosera FB-1001/100
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco, ThermoFisher Scientific 15240-062
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G
D-(+) Glucose Sigma-Aldrich G7021-100G
Oligomycin A Sigma-Aldrich 75351-5MG
2-Deoxy-D-glucose Sigma-Aldrich D8375-1G
FCCP Sigma-Aldrich C2920-10MG
DMSO Sigma-Aldrich D8418-100ML
Rotenone Sigma-Aldrich R8875-1G
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674-25MG
Seahorse XF Base Medium, 100 mL Agilent Technologies 103193-100
L-glutamine solution, 200 mM Sigma-Aldrich G7513-100ML
HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 Sigma-Aldrich H0887-100ML
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280-25G
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2153-10G
Ficoll-Paque Plus Sigma-Aldrich GE17-1440-02 Density gradient medium
Seahorse XFp FluxPak Agilent Technologies 103022-100
Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive ThermoFisher Scientific CB40240
Seahorse Analyzer XFp Agilent Technologies S7802A
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate Agilent Technologies 103025-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).
  2. Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate. Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).
  3. Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).
  4. Wise, D. R., Thompson, C. B. Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer. Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).
  5. Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel. Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).
  6. Liberti, M. V., et al. A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product. Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).
  7. Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
  8. Hermanova, I., et al. Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells. Leukemia. 30, 209-218 (2016).
  9. Malandrino, M. I., et al. Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).
  10. Patella, F., et al. Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).
  11. Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).
  12. Simonnet, H., Vigneron, A., Pouysségur, J. Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption. Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).
  13. Martínez-Reyes, I., et al. TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions. Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).
  14. Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).
  15. Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio. The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).
  16. Morciano, G., et al. Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals. Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).
  17. Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 12553-12558 (2010).
  18. Lee, K. -H., et al. Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator. The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).
  19. Godlewski, J., et al. MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells. Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).
  20. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).
  21. Kaplon, J., et al. A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence. Nature. 498, 109-112 (2013).
  22. Pardee, T. S., et al. A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).
  23. Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).
  24. Hrušák, O., Porwit-MacDonald, A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).
  25. Amin, H. M., et al. Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias. Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).
Vurdering av metabolske profilen til primære leukemi celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hlozková, K., Starková, J. Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (141), e58426, doi:10.3791/58426 (2018).More

Hlozková, K., Starková, J. Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (141), e58426, doi:10.3791/58426 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter