Summary
Här presenterar vi ett protokoll för isolering av leukemiska celler från benmärg leukemi patienter och analys av deras metaboliska tillstånd. Bedömning av den metabola profilen av primära leukemiceller kan bidra till att bättre karaktärisera efterfrågan av primära celler och leda till mer personlig medicin.
Abstract
Den metabola kraven av cancerceller kan negativt påverka överlevnad och behandlingseffektivitet. Nuförtiden, är farmaceutiska inriktningen av metaboliska vägar testad i många typer av tumörer. Karakterisering av cancer cell metabola setup är alltså oundvikliga för att rikta den rätta vägen för att förbättra det totala resultatet av patienter. Tyvärr i de flesta cancerformer, elakartade cellerna är ganska svårt att få i högre siffror och vävnad biopsi krävs. Leukemi är ett undantag, där ett tillräckligt antal leukemic celler kan isoleras från benmärgen. Här, ger vi ett detaljerat protokoll för isolering av leukemiska celler från benmärg leukemi patienter och efterföljande analys av deras metaboliska tillstånd att använda extracellulära flux analyzer. Leukemiska celler isoleras av täthetlutningen, som inte påverkar deras livskraft. Nästa odling steg hjälper dem att regenerera, således den metabola stat mätt är densamma av celler i optimala förhållanden. Detta protokoll tillåter att uppnå konsekvent, väl standardiserade resultat, som skulle kunna användas för personlig terapin.
Introduction
Den metabola profilen är en av de viktigaste egenskaperna hos celler och förändrad bioenergetik anses nu vara ett av kännetecknen av cancer1,2,3. Dessutom skulle förändringar i metabola setup kunna användas i behandling av cancer genom att rikta cellsmedierade reaktioner eller enzymatisk maskiner cancer celler4,5,6. Att veta den metabola anlag för cancerceller är således en fördel och kan bidra till att förbättra den nuvarande behandlingen.
I området i närheten finns det gott om redan etablerade metoder som kan bedöma den metaboliska aktiviteten av celler i kultur. Angående glykolys, kan glukosupptag mätas av radioaktiva märkningen, med 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) eller extracellulära laktat nivåer mätt enzymatiskt7,8. Fettsyra är oxidation en annan metabolisk parameter mätt med isotopically märkta palmitat9,10. Syre materialåtgången är en metod som ofta används för att bestämma mitokondriell aktivitet i cellerna11,12, tillsammans med den mitokondriella membranet potentiella utvärdering13,14, ATP/ADP (adenosin 5 '-trifosfat/5′-adenosindifosfat) baserat på mätning15 eller totalt intracellulära ATP mätning16. Signalering vägar kända för att reglera metabola processer kunde fastställas av protein kvantifieringar och kan förbättra förståelsen av metabola mätningar17,18,19.
Men alla dessa metoder mäter endast en eller, i bästa fall, några metabola parametrar i en prov samtidigt. Ännu viktigare, kan samtidig mätning av syre materialåtgången (OCR) och extracellulära försurning rate (ECAR) uppnås genom den extracellulära flux analysen av, till exempel Seahorse XFp Analyzer. OCR är en indikator på mitokondriell respiration och ECAR är huvudsakligen en följd av glykolys (vi inte kan ignorera CO2 produktion möjligen upphöja ECAR celler med hög oxidativ fosforylering aktivitet)20. Hittills har har olika celltyper studerats med hjälp av dessa analysatorer21,22,23.
Här beskriver vi protokollet för extracellulära flux analys av primära Blaster (leukemiceller från omogna hematopoetiska scenen) från leukemipatienter med. Till bäst av vår kunskap är ett visst protokoll för primära Blaster inte tillgänglig ännu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla prover erhölls med informed consent av barnens föräldrar eller vårdnadshavare och godkännande av etisk kommitté vid Karlsuniversitetet i Prag, Tjeckien, studien ingen. NV15-28848A.
1. beredning av reagens
- Förbereda 500 mL PBS genom upplösning 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, i ddH2O. Justera pH till 7,4 med HCl. Sterilize genom autoklavering.
- Bereda 100 mL RPMI medium: RPMI-1640 medium med L-Alanyl-glutamin kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), penicillin (100 U/mL) och streptomycin (100 μg/mL).
- Förbereda 50 mL 0,1 M NaHCO3 i destillerat vatten. Justera pH till 8,1, filter sterilisera (0,22 μm) och förvaras vid 4 ° C.
Obs: För två 8-väl extracellulära flux analyzer plattor, förbereda 250 μl 0,1 M NaHCO3 pH 8,1. - Laga 1 mL 2 M D-glukos i destillerat vatten. Filter sterilisera (0,22 μm) och förvaras vid-20 ° C.
- Förbereda 100 μL av 1 mM Oligomycin A i etanol. Filter sterilisera (0,22 μm) och förvaras vid-20 ° C.
- Förbereda 250 μL av 1 M 2-deoxy-D-glukos (2-DG) i Minimal DMEM (Dulbeccos modifierade örnens medium). Värm till 37 ° C och justera pH till 7,4 (bär ut pH-mätning vid 37 ° C). Filter sterilisera (0,22 μm) och förvaras vid-20 ° C.
- Förbereda 100 μL av 1 mM FCCP (Karbonylklorid cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) i DMSO. Filter sterilisera (0,22 μm) och förvaras vid-20 ° C.
- Förbereda 100 μL av 1 mM Rotenon i etanol. Filter sterilisera (0,22 μm) och förvaras vid-20 ° C.
- Förbereda 100 μL av 1 mg/mL Antimycin A i etanol. Filter sterilisera (0,22 μm) och förvaras vid-20 ° C.
- Precis innan användning, förbereda 10 mL av glykolys stresstest medium. Värm Minimal DMEM till 37 ° C i ett vattenbad och justera pH till 7,4 (bär ut pH-mätning vid 37 ° C).
- Före användning, förbereda 10 mL av Cell Mito stresstest medium med BSA. Komplettera Minimal DMEM med 2 mM L-glutamin, 10 mM D-glukos, 1 mM HEPES (pH 7,4), 1 mM pyruvat och 0,1% BSA (bovint serum albumin). Värm till 37 ° C i ett vattenbad och justera pH till 7,4 (bär ut pH-mätning vid 37 ° C).
- Före användning, förbereda 10 mL av Cell Mito stresstest medium utan BSA. Komplettera Minimal DMEM med 2 mM L-glutamin, 10 mM D-glukos, 1 mM HEPES (pH 7,4) 1 mM pyruvat. Värm Cell Mito stresstest medium utan BSA till 37 ° C i ett vattenbad och justera pH till 7,4 (bär ut pH-mätning vid 37 ° C).
Obs: BSA läggs till Cell Mito stresstest medium eftersom cellerna svarar bättre på FCCP när mediet är kompletteras med BSA (olika villkor testades). Cell Mito stresstest medium utan BSA används för inläsning av hamnarna som tillverkaren inte rekommenderar användning BSA på medellång.
2. isolering av mononukleära celler från benmärg
Obs: Helst, mätning av metabola tillstånd av primära leukemiceller bör börja omedelbart efter benmärgen insamling och cell isolering. Dock kunde relevanta uppgifter erhållas också från celler isolerade efter transport från andra hematologi centra i Tjeckien. Utföra alla delsteg i en steril vävnadsodling huva.
- Värm upp PBS och täthet lutning medellång till rumstemperatur.
- Späd benmärgsprov av leukemi patienten med PBS, i förhållandet 1:1. Se till att provet innehåller minst 80% av leukemiska Blaster.
- Bestämma procentandelen av Blaster av flödescytometri med specifika CD-markörer för immunophenotype karakterisering av celltyper. Efter densitet gradient separation, upptäcka nukleinsyra positiva händelser med en nukleär färgämne för att fastställa det totala celltalet.
- Sedan bestämma leukemiceller använder specifika CD-markörer för varje typ av leukemi: B-ALL (CD19, CD45), T-ALL (CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD99) och AML (CD45, CD33 och specifika myeloiska markörer)24. Dividera antalet leukemiceller som positivt för specifika CD-markörer av alla nukleära celler att bestämma andelen leukemiceller blast.
Obs: Benmärgen har samlas in i rören med antikoagulantia. - Noggrant lager 6 mL utspädd benmärgsprov över 6 mL täthet lutning mediet i en 15 mL koniska rör. Centrifugera vid 400 x g i 35 minuter vid 4 ° C i en svängande-hink rotor utan bromsen.
Obs: Större volym av provet kunde delas in i fler heltalsfaktorer eller 50 mL koniska rör kan användas med större mängd täthet lutning medium. - Med Pasteur pipett noggrant att överföra det interphase lagret som består av mononukleära celler (figur 1) till en ny 50 mL koniska tub 5 ml PBS. Centrifugera vid 400 × g i 10 minuter vid 4 ° C i en svängande-hink rotor.
Obs: Överföra alla mononukleära celler lager till en enda 50 mL koniska rör med 5 mL PBS. - Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 2 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Räkna de celler som använder en hemocytometer.
Anmärkning: Antalet leukemiceller i en mL aspirerade benmärgen skiljer sig avsevärt bland patienter25.
3. övernattning odling av mononukleära celler
Obs: Utför alla delsteg i en steril vävnadsodling huva.
- Förbered två T75 kolvar med 20 mL RPMI. Till varje kolv, lägga 30 x 106 isolerade mononukleära celler. Inkubera cellerna med kolven står upp för 16 – 24 h vid 5% CO2 och 37 ° C.
4. beredning av Cell lim-belagda plattor
- Coat två 8-väl extracellulära flux analyzer plattor.
Obs: Utföra beläggning i en steril vävnadsodling huva. - Tillsätt 2.2 μL av cell lim (densitet: 2,54 mg/ml) till 250 μl 0,1 M NaHCO3pH 8,1 och pipett genast 12,5 μl av lösningen i varje brunn.
Obs: Cell självhäftande lager lösningar kan skilja sig åt i deras täthet, justera volymen NaHCO3 kompletteras med detta. - Låt plattorna sitter i huven för ca 20 min, sedan aspirera cell limmet och tvätta vart väl två gånger med 200 μl sterilt vatten. Låt det sitta i huven med locket öppet tills brunnar är torra.
- Använda plattorna direkt eller Spara upp till 1 vecka vid 4 ° C med fälgen insvept i paraffin filma att undvika kondens. Se till att plattorna är värmas upp till rumstemperatur (för ca 20 min) i huven innan sådd cellerna.
5. hydrering av Sensor patron
Obs: Återfukta två 8-väl extracellulära flux analyzer patroner.
- Separat verktyget plattan och sensorn patronen. Placera sensorn kassetten uppochned på bänken lab.
- Fylla varje väl av verktyget plattan med 200 μL standard. Fyll varje vallgrav runt utsidan av brunnarna med 400 μL standard.
- Returnera sensor patronen till verktyget plattan som nu innehåller standard.
- Lägg den i en fuktad, icke-CO2, 37 ° C inkubator över natten.
- Slå på den extracellulära flux analyzer och låt det varma till 37 ° C under natten.
6. sådd celler i Cell lim-belagda plattor
Obs: För glykolys stresstest, använda glykolys stresstest medium. För Cell Mito stresstest, använda Cell Mito stresstest medium med BSA.
- Utsäde celler för glykolys stresstestet och Cell Mito stresstestet i separata plattor. För varje test använda celler från en kolv med övernattning kultur.
- Centrifugera celler vid 200 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Omsuspendera cellerna i 1 mL av lämpligt medium och räkna dem.
- Lägga till 4 x 10-6 i levande celler till slutvolymen av 400 μL (Använd lämpligt medium).
- Plåt 50 μl cellsuspension i brunnar B-G. Se till 500.000 celler är seedad i en brunn.
Obs: Det är viktigt att utsäde exakt 500 000 celler per brunn som inga andra normalisering utförs. På så sätt kan resultaten från olika patienter jämföras. Det optimala antalet replikat är sex, som beskrivs här. Använda mindre replikat rekommenderas inte eftersom primära celler kunde ibland beter sig felaktigt. - Tillsätt 180 μL av lämpligt medium i brunnar A och H (dessa brunnar kommer att fungera som en bakgrundskorrigering).
- Centrifugera plattan vid 400 x g i 5 min i rumstemperatur med broms anges till 1.
- Tillsätt 130 μL i lämpligt medium wells B-G i två 8-väl extracellulära flux analyzer plattor långsamt och försiktigt. Visuellt bekräfta att cellerna stabilt följs botten av brunnarna av visning under mikroskopet.
- Placera den plattan i en fuktad, icke-CO2, 37 ° C inkubator för 30 min.
7. lastning Sensor patronen
- För glykolys stresstestet, förbereda 250 μL varje 100 mM glukos, 20 μM Oligomycin A och 1 M 2-DG, alla i glykolys stresstest medium.
- För Cell Mito stresstestet, förbereda 250 μL var och en av 20 μM Oligomycin A, 15 μM FCCP, 30 μM FCCP och en blandning av 10 μM Rotenon och 10 μg/ml Antimycin A, alla i Cell Mito stresstest medium utan BSA.
Obs: Injicera två koncentrationer av FCCP i en analys rekommenderas eftersom det inte är tillräckligt patienternas material för FCCP titrering. Dock bör halterna bestämmas av forskaren. - Fyll föreningarna i lämpliga spridare hamnarna i kassetten enligt följande (tabell 1):
8. installera programmet
- För glykolys stresstestet, ställa in programmet som beskrivs i tabell 2.
- För Cell Mito stresstestet, ställa in programmet som beskrivs i tabell 3.
- Starta programmet. Ersätta standard plattan med assay plattan (när du uppmanas).
9. utvärdering och tolkning av resultaten
- I glykolys stresstest resultaten, subtrahera det lägsta ECAR värdet efter 2-DG injektion från alla andra ECAR värden.
Notera: Detta lägsta värde representerar icke-glycolytic försurningen. Vanligtvis är det lägsta värdet från 4th mätningen. - Beräkna Basal försurning, glykolys, Maximal glykolys och Glycolytic reserve parametrar från glycolytic funktion (figur 2A). Efter att subtrahera värdet för lägsta ECAR, beräkna Basal försurning som ett medelvärde på ECAR från de första tre mätpunkterna (utelämna första ECAR värdet om det avsevärt skiljer sig från de andra två), beräkna glykolys som ett medelvärde på ECAR från tre mätning Poäng efter glukos för injektion och beräkna Maximal glykolys som ett medelvärde på ECAR från tre mätning pekar efter Oligomycin en injektion. Beräkna Glycolytic reserv som Maximal glykolys minus glykolys.
Obs: Alternativt för Maximal glykolys beräkning, använda högsta ECAR värdet från tre punkter mätas. - I Cell Mito stresstest resultaten, subtrahera det lägsta OCR-värdet efter Rotenon/Antimycin A injektion från alla andra OCR-värden.
- Beräkna Basal respiration, ATP-produktion, Maximal andning och reservkapacitet parametrar från mitokondriefunktion (figur 2B). Efter att subtrahera det lägsta OCR-värdet, beräkna Basal respiration som ett medelvärde av OCR från de första tre mätpunkterna.
Obs: Maximal andning är det högsta OCR-värdet efter FCCP injektion. - För beräkningen av ATP-produktion, subtrahera medelvärdet av de tre OCR-mätpunkterna efter Oligomycin A injektion från Basal andning. Beräkna reservkapacitet som Maximal respirationen minus den basala respirationen.
Obs: Beräkna alltid Maximal respirationen från det högsta OCR-värdet, oavsett den FCCP koncentration som används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 visar kurvorna efter glykolys stresstest och Cell Mito stresstest mätningar av leukemiska Blaster från BCP-ALL (B-cell prekursor akut lymfatisk leukemi) och AML (akut myeloisk leukemi) patienter. Beräkning av metabola parametrar från dessa mätningar är också indicerat. 500 000 celler per brunn var seedad och alla mätningar utfördes i hexaplicates.
I stresstestet glykolys används endast basala medium, så att cellerna berövas näringsämnen. Den första parametern som erhålls är den basala försurning, som bör återspegla mängden glukos som lagras i celler. Efter den första injektionen ökas ECAR eftersom celler utnyttja glukos och kan jäsa för att laktat. Oligomycin A i den andra injektionen hämmar ATP-syntas och därmed styr cellerna att producera ATP huvudsakligen via glykolys. Detta bör leda till ytterligare behörighetshöjning ECAR. Injektion av 2-DG hämmar helt glykolys och ECAR droppar.
I Cell Mito stresstestet används ett medium som kompletteras med glutamin och glukos, så att cellerna inte berövas alla näringsämnen och parametern Basal respiration återspeglar deras basala metaboliska tillstånd. Efter den första injektionen med Oligomycin A, celler hämmar mitokondriell respiration och växla till glykolys som representeras som en minskning med OCR. FCCP (andra och tredje injektionen), uncouples å andra sidan, ATP produktionen från andning, så att cellerna nu konsumerar syre vid en maximal skattesats och OCR upphov till sitt högsta värde. Den sista injektionen av Rotenon och Antimycin A blandning hämmar helt mitokondriell respiration och OCR minskas nära noll.
Figur 1: densitet gradient centrifugering av benmärgsprov. Mononukleära celler berikad för leukemic celler separeras av täthet lutning medium. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Skissera av glykolys stresstest och Cell Mito stress test. (A) exemplariska resultatet av glykolys stresstest. (B) exemplariska resultatet av Cell Mito stresstest. Parametrar anges i kurvorna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: extracellulära flux analys av leukemiska Blaster från BCP-ALL (A, B) och AML (B, C) patienten. (A och C) glykolys stresstest resultaten. Observera att den första mätpunkten kan avsevärt skiljer sig från resten och bör undantas från analysen i så fall. (B och D) Cell Mito stresstest resultaten. Parametrar anges i kurvorna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Hamn | Glykolys stresstest | Cell mito stresstest | ||
| Ladda till porten | Slutlig koncentration i brunnarna | Ladda till porten | Slutlig koncentration i brunnarna | |
| A | 20 μL av 100 mM glukos | 10 mM glukos | 20 μL av 20 μM Oligomycin A | 2 μM Oligomycin A |
| B | 22 μL av 20 μM Oligomycin A | 2 μM Oligomycin A | 22 μL av 15 μM FCCP | 1,5 ΜM FCCP |
| C | 25 μL av 1 M 2-GD | 100 mM 2-GD | 25 μL av 30 μM FCCP | 4,5 ΜM FCCP |
| D | X | 25 μL 10 μM Rotenon och 10 μg/ml Antimycin A | 1 μM Rotenon och 1 μg/ml Antimycin A | |
Tabell 1: Sammansatta volymer.
| Steg | Inställningar |
| Kalibrering | Automatiska |
| Jämviktstiden | Automatiska |
| Baslinjemätning | Tre gånger: Blanda – 3 min, vänta – 0 min, åtgärd – 3 min |
| Injektion av port A | Injektion |
| Mätning | Tre gånger: Blanda – 3 min, vänta – 0 min, åtgärd – 3 min |
| Injektion av port B | Injektion |
| Mätning | Tre gånger: Blanda – 3 min, vänta – 0 min, åtgärd – 3 min |
| Injektion av hamnen C | Injektion |
| Mätning | Fyra gånger: Blanda – 3 min, vänta – 0 min, åtgärd – 3 min |
Tabell 2: Program för glykolys stresstest.
| Steg | Inställningar |
| Kalibrering | Automatiska |
| Jämviktstiden | Automatiska |
| Baslinjemätning | Tre gånger: Blanda – 3 min, vänta – 0 min, åtgärd – 3 min |
| Injektion av port A | Injektion |
| Mätning | Tre gånger: Blanda – 3 min, vänta – 0 min, åtgärd – 3 min |
| Injektion av port B | Injektion |
| Mätning | Tre gånger: Blanda – 3 min, vänta – 0 min, åtgärd – 3 min |
| Injektion av hamnen C | Injektion |
| Mätning | Tre gånger: Blanda – 3 min, vänta – 0 min, åtgärd – 3 min |
| Injektion av port D | Injektion |
| Mätning | Tre gånger: Blanda – 3 min, vänta – 0 min, åtgärd – 3 min |
Tabell 3: Program för Cell Mito stresstest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ovan beskrivna protokollet tillåter för mätning av den metaboliska aktiviteten bedömt OCR och ECAR värden i primära leukemiska Blaster härrör från patienter med akut lymfatisk leukemi (ALL) eller akut myeloisk leukemi (AML). Fördelen med mätning med en extracellulär flux analysator är att det möjliggör upptäckt av metabola profilen i realtid i levande celler. I huvudsak kunde varje steg i enlighet med protokollet justeras beroende på vilken celltyp en planerar att studera. Här, kommer vi att diskutera de viktigaste parametrarna som kan påverka resultaten och kan ge mindre än optimala värden.
Det första steget mot optimering var en jämförelse av uppgifter som erhållits från färskt material vs fryst material. Förmågan att mäta den metaboliska aktiviteten från fryst material skulle möjliggöra retrospektiva studier av patienters prover lagras i flytande kväve. Vid alla prover kunde vi upptäcka konsekvent metabolisk aktivitet endast från det färska materialet medan AML celler mättes också efter de frysning med optimala resultat.
Det andra steget mot optimering är odling av primära leukemiska Blaster. Vi har testat den metaboliska aktiviteten i cellerna direkt efter densitet gradient avskiljandet (utan odling) eller efter odling över natten. Även om cellerna efter densitet gradient avskiljandet såg livskraftiga och vital under ett mikroskop, var deras metaboliska aktiviteten nedsatt. ECAR och OCR värden var generellt lägre och också, efter injektion, OCR eller ECAR värden svarade inte optimalt som de gjorde i odlade celler.
Odling under olika förhållanden kan också påverka resultaten. Användning av insulin transferrin natrium selenit tillägg (ITS) anses bra praxis när odla primära Blaster8, men detta tillägg stör den metaboliska aktiviteten i cellerna. Under Cell Mito stresstest, leukemiska Blaster odlas med ITS svarade inte på Oligomycin A (OCR bör minska för att beräkna ATP-kopplad andning). Vi försökte också Co odla cellerna med mesenkymala stamceller (MSC), men i detta fall OCR och ECAR värden har varit lägre jämfört med de celler som odlas utan MSCs. Sammanfattningsvis, odla primära Blaster från leukemipatienter i RPMI medium med 10% FBS är det bästa alternativet.
Patienter lämpliga för karakterisering av deras metabola profilen måste uppfylla vissa kriterier som på en hand antalet testade prover men å andra sidan kommer att ge relevanta resultat. Vi mätte metabola funktionen av patienter med hög cellularitet (för en mätning vi seedade 500 000 celler per brunnar i hexaplicate) och endast prov med 80 och en högre andel av leukemiska Blaster kan mätas för att undvika upptäckt av ospecifika metaboliska aktiviteten av andra celltyper i suspensionen.
En av de avgörande stegen i dataanalys är normalisering, så att metabola parametrar mellan olika leukemiska prover kunde jämföras. Enligt våra tidigare experiment som utförs med leukemic cellinjer, fann vi att normalisering till antalet celler ger bäst resultat. Det bestämda antalet celler per brunn måste fastställas av forskaren och beror på storleken och metaboliska aktiviteten av testade celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka de tjeckiska pediatriska hematologi centra. Detta arbete var stöds av Grant av hälsoministeriet (NV15-28848A), av hälsoministeriet av Tjeckien, University Hospital Motol, Prag, Tjeckien 00064203 och ministeriet för utbildning, ungdom och sport NPU jag nr. LO1604.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
| Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
| L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
| HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
| Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
| Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |
References
- DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).
- Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate. Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).
- Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).
- Wise, D. R., Thompson, C. B. Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer. Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).
- Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel. Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).
- Liberti, M. V., et al. A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product. Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).
- Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
- Hermanova, I., et al. Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells. Leukemia. 30, 209-218 (2016).
- Malandrino, M. I., et al. Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).
- Patella, F., et al. Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).
- Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).
- Simonnet, H., Vigneron, A., Pouysségur, J. Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption. Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).
- Martínez-Reyes, I., et al. TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions. Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).
- Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).
- Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio. The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).
- Morciano, G., et al. Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals. Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).
- Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).
- Lee, K. -H., et al. Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator. The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).
- Godlewski, J., et al. MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells. Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).
- Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).
- Kaplon, J., et al. A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence. Nature. 498, 109-112 (2013).
- Pardee, T. S., et al. A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).
- Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).
- Hrušák, O., Porwit-MacDonald, A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).
- Amin, H. M., et al. Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias. Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).
