Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Birincil lösemi hücrelerinin metabolik profili değerlendirilmesi

doi: 10.3791/58426 Published: November 21, 2018

Summary

Burada bir protokol lösemi hastalarında kemik iliği lösemik hücrelerin izolasyonu ve metabolik durumlarına analizi için mevcut. Birincil lösemi hücrelerinin metabolik profili değerlendirilmesi daha iyi primer hücre talep karakterize etmek için yardımcı olabilir ve daha fazla kişiselleştirilmiş tıp neden olabilir.

Abstract

Kanser hücrelerinin metabolik gereksinimi hayatta kalma ve tedavi etkinliği olumsuz yönde etkileyebilir. Günümüzde, ilaç metabolik yollar hedefleme tümörler birçok türde sınanır. Böylece, kanser hücre metabolik Kur karakterizasyonu, hastaların genel sonucunu iyileştirmek için doğru yolu hedeflemek için kaçınılmazdır. Ne yazık ki, kanserlerin çoğunluğu, kötü huylu hücreleri daha yüksek miktarlarda elde etmek oldukça zordur ve doku biyopsisi gereklidir. Lösemi bir istisnadır, nerede lösemik hücreler yeterli sayıda kemik iliği ayrılmış olabilir. Burada, biz lösemi hastalarında kemik iliği lösemik hücrelerin izolasyonu ve metabolik durumlarına ekstraselüler akı Çözümleyicisi'ni kullanarak, daha sonraki analiz için detaylı bir protokol sağlar. Lösemik hücre canlılığı etkilemez yoğunluk gradient tarafından yalıtılır. Ekimi bir adım onları yeniden oluşturmak için yardımcı olur, böylece ölçülen metabolik durum optimal koşullar hücrelerde durumudur. Bu iletişim kuralı için kişiselleştirilmiş terapi kullanılabilir tutarlı, iyi standart sonuçlar elde sağlar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Metabolik hücreler ana özelliklerinden biri olması ve değiştirilmiş bioenergetics şimdi kanser1,2,3işaretlerinden biri kabul edilir. Ayrıca, metabolik Kur değişiklikleri sinyal iletim yollarının veya kanser hücreleri4,5,6enzimatik makine hedefleyerek kanser tedavisinde kullanılan. Kanser hücrelerinin metabolik yatkınlık bilmek böylece bir avantajdır ve geçerli terapi artırmaya yardımcı olabilir.

Bir çok sayıda hücre kültüründe metabolik etkinliğini değerlendirmek zaten kurulmuş yöntemler vardır. Glikoliz ile ilgili, Glikoz alımı ölçülebilir radyoaktif etiketleme tarafından 2-NBDG kullanarak (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) veya hücre dışı laktat seviyeleri ölçülen enzimatik7,8. Başka bir metabolik parametre isotopically etiketli palmiat9,10tarafından ölçülen yağ asidi oksidasyon oranıdır. Oksijen tüketim oranını hücreleri11,12' mitokondrial membran potansiyeli değerlendirme13,14, ATP/ADP (adenozin birlikte mitokondrial etkinliği belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir 5 '-trifosfat/Adenozin 5 '-nükleotittir) oranı ölçümü15 veya toplam hücre içi ATP ölçümü16. Metabolik süreçleri düzenleyen bilinen yolları sinyal protein quantifications tarafından belirlenen ve metabolik ölçüleri17,18,19anlayış artırabilirsiniz.

Ancak, tüm bu yöntemler sadece bir tedbir veya en iyi senaryoda, aynı anda birkaç metabolik parametreleri bir örnek. Önemlisi, eş zamanlı ölçüm oksijen tüketim oranını (OCR) ve ekstraselüler asitleştirme oranı (D.H.T.) göre örneğin, deniz atı XFp Analyzer ekstraselüler akı analiz elde edilebilir. OCR mitokondrial solunum bir göstergesidir ve D.H.T. ağırlıklı olarak (biz CO2 üretim muhtemelen D.H.T. hücrelerinin yüksek Oksidatif fosforilasyon aktivite ile yükselen görmezden değil) glikoliz sonucu20. Şimdiye kadar çeşitli hücre tiplerinin bu Analizörleri21,22,23kullanılarak incelenmiştir.

Burada lösemi hastalarına Protokolü birincil patlamaların (olgunlaşmamış hematopoetik sahne alanı'ndan elde edilen lösemi hücreleri) hücre dışı akı analizi için açıklamak. Bizim bilgi en iyi şekilde, belirli bir iletişim kuralı birincil patlamaların henüz kullanılabilir değil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm örneklerini informed consent çocukların anne veya veliler ve Charles Üniversitesi Prag, Çek Cumhuriyeti, çalışma etik kurul onayı ile elde edilmiştir yok. NV15-28848A.

1. hazırlanması reaktifler

  1. PBS 500 mL 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, GKD2O. ayarlama 7.4 için pH HCl. Sterilize tarafından ısıyla eriterek hazırlayın.
  2. 100 mL RPMI orta hazırlamak: L-Alanyl-Glutamine % 10 fetal Sığır serum (FBS), penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 μg/mL) ile RPMI-1640 orta.
  3. 50 mL 0.1 M NaHCO3 distile su içinde hazırlamak. 8.1 için pH ayarlama, filtre (0,22 mikron) sterilize ve 4 ° C'de depolayın
    Not: 0.1 M NaHCO3 pH 8.1 250 μL iki 8-şey ekstraselüler akı analyzer tabak için hazır olun.
  4. 1 mL distile su içinde 2 M D-glikoz hazırlayın. Filtre (0,22 mikron) sterilize ve -20 ° C'de depolayın
  5. 1 mm Oligomycin A etanol içinde 100 μL hazırlayın. Filtre (0,22 mikron) sterilize ve -20 ° C'de depolayın
  6. 1 M 2-deoksi-D-glikoz (2-DG) en az DMEM (Dulbecco'nın modifiye kartal orta) 250 μL hazırlayın. 37 ° C sıcak ve pH 7,4 (pH ölçüm 37 ° C'de yürütmek) için ayarlayın. Filtre (0,22 mikron) sterilize ve -20 ° C'de depolayın
  7. 1 mm FCCP (karbonil siyanür-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) DMSO içinde 100 μL hazırlayın. Filtre (0,22 mikron) sterilize ve -20 ° C'de depolayın
  8. 1 mm Rotenon etanol içinde 100 μL hazırlayın. Filtre (0,22 mikron) sterilize ve -20 ° C'de depolayın
  9. 1 mg/ml etanol içinde Antimycin A 100 μL hazırlayın. Filtre (0,22 mikron) sterilize ve -20 ° C'de depolayın
  10. Kullanmadan önce 10 mL glikoliz stres testi orta hazırlayın. En az DMEM bir su banyosu içinde 37 ° c sıcak ve pH 7,4 (pH ölçüm 37 ° C'de yürütmek) için ayarlayın.
  11. Kullanımdan önce BSA ile hücre Mito stres testi orta 10 mL hazırlayın. En az DMEM ile 2 mM L-glutamin, 10 mM D-glikoz, 1 mM HEPES (pH 7,4), 1 mM pyruvate ve % 0.1 BSA (Sığır serum albümin) ek. Bir su banyosu içinde 37 ° c sıcak ve pH 7,4 (pH ölçüm 37 ° C'de yürütmek) için ayarlayın.
  12. Kullanımdan önce hücre Mito stres testi orta BSA olmadan 10 mL hazırlayın. Ek en az DMEM ile 2 mM L-glutamin, 10 mM D-glikoz, 1 mM HEPES (pH 7,4) ve 1 mM pyruvate. BSA olmadan cep Mito stres testi orta-37 ° C su banyosu içinde sıcak ve pH 7,4 (pH ölçüm 37 ° C'de yürütmek) için ayarlayın.
    Not: ne zaman orta BSA ile desteklenmiş hücreleri daha iyi FCCP için yanıt için BSA hücre Mito stres testi orta olarak eklenir (farklı koşullarda test edildi). Hücre Mito stres testi orta BSA olmadan üretici BSA ortamda kullanmanızı öneririz değil gibi bağlantı noktalarını yüklemek için kullanılır.

2. kemik iliği mononükleer hücre izolasyon

Not: İdeal olarak, birincil lösemi hücreleri metabolik durumunu ölçümü sonra toplama ve hücre izolasyon kemik iliği hemen başlayacaktır. Yine de, ilgili veri ayrıca Çek Cumhuriyeti diğer Hematoloji ulaşım merkezleri sonra izole hücrelerden elde edilebilir. Steril doku kültürü mahallede tüm alt adımları gerçekleştirin.

  1. PBS ve yoğunluk gradient Orta oda sıcaklığında ısıtın.
  2. 1:1 oranında PBS, lösemi hastanın kemik iliği örneği sulandırmak. Örnek lösemik patlamaların en az % 80'i içerdiğinden emin olun.
  3. Hücre tipleri immunophenotype karakterizasyonu için özel CD işaretçileri kullanarak akış sitometresi tarafından patlamaların yüzdesini belirleyin. Yoğunluk gradient ayrılıktan sonra nükleik asit olumlu olaylar nükleer bir boya ile genel hücre sayısı oluşturulabilmesi için tespit.
  4. Sonra lösemi hücreleri lösemi her türü için belirli CD işaretçileri kullanarak belirleyin: B-ALL (CD19, CD45), T-ALL (CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD99) ve AML (CD45, CD33 ve belirli miyeloid işaretleri)24. Lösemi hücreleri belirli CD işaretler için olumlu lösemi blast hücre yüzdesini belirlemek için tüm nükleer hücreleri tarafından sayısına bölün.
    Not: Kemik iliği antikoagülanlar tüplerini içine alınması gerekir.
  5. Dikkatle 6 mL sulandırılmış kemik iliği örneği üzerinde 6 mL 15 mL konik tüp içinde yoğunluk gradient orta katman. Sallanan-kova Open End fren olmadan 4 ° C'de 35 dk 400 x g, santrifüj kapasitesi.
    Not: Örnek daha büyük hacim daha fazla aliquots bölünmüş olabilir veya 50 mL konik tüp yoğunluk gradient orta büyük miktarı ile kullanılabilir.
  6. Pasteur pipet kullanarak, dikkatle mononükleer hücrelerin (Şekil 1) oluşan Interphase katman yeni bir 50 mL konik tüp 5 mL de PBS ile aktarın. Sallanan-kova Open End 4 ° C'de 10 dakika için 400 × g, santrifüj kapasitesi.
    Not: tüm mononükleer hücre katmanları ile 5 mL PBS de bir tek 50 mL konik tüp içine aktarın.
  7. Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet 2 mL steril PBS resuspend. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
    Not: Emişli kemik iliği bir ml lösemi hücrelerinin sayısı önemli ölçüde hasta25arasında farklılık gösterir.

3. gece ekimi mononükleer hücre

Not: bir steril doku kültürü mahallede tüm alt adımları gerçekleştirin.

  1. İki T75 şişeler RPMI 20 mL ile hazırlayın. Her şişe için 30 x 106 izole mononükleer hücreler ekleyin. 16-24 h % 5 CO2 ve 37 ° c için ayakta şişesi ile hücreleri kuluçkaya

4. hücre yapışkan kaplama plakaları hazırlanması

  1. İki 8-şey ekstraselüler akı analyzer tabak kat.
    Not: kaplama steril doku kültürü mahallede gerçekleştirin.
  2. 2.2 μL hücre yapıştırıcı eklemek (yoğunluk: 2,54 mg/ml) 250 μL 0.1 M NaHCO3, pH 8.1 ve pipet hemen 12.5 μL her kuyuya çözüm için.
    Not: Hücre yapıştırıcı hisse senedi çözümleri onların dansitesi farklı, NaHCO3 ' e eklendi buna göre ses düzeyini ayarlama.
  3. Mahalle için yaklaşık 20 dk, oturup sonra hücre yapıştırıcı Aspire edin ve her şey iki kez 200 μL steril su kullanarak yıkayın plakaları ver. Kapak açıkken mahalledeki Kuyu kuru olana oturmak izin.
  4. Tabakları hemen kullanmak veya 4 ° C'de 1 hafta kadar yoğunlaşma önlemek için parafin filmde sarılmış RIM ile kaydedin. Tabakları oda sıcaklığında (için yaklaşık 20 dk) için mahallede hücreleri tohum önce ısındı ki emin olun.

5. hidrasyon sensör kartuş

Not: iki 8-şey ekstraselüler akı analyzer kartuşları hidrat.

  1. Yardımcı program plaka ve sensör kartuş ayırın. Sensör kartuş baş aşağı laboratuvar bankta yerleştirin.
  2. Her doldurmak 200 μL calibrant yardımcı programı plakalı, de. Her hendek dışında Wells etrafında calibrant 400 μL ile doldurun.
  3. Sensör kartuş şimdi calibrant içeren yardımcı programı plaka dönün.
  4. Kartuş grubunu bir oksijen, Sigara-CO2' de, 37 ° C kuluçka gecede yerleştirin.
  5. Hücre dışı akı analyzer açmak ve 37 ° C sıcak gecede izin verin.

6. tohum hücrelerinde hücre yapıştırıcı / galvanizleme levhalar

Not: Glikoliz stres testi orta glikoliz stres testi için kullanın. Hücre Mito stres testi için BSA ile hücre Mito stres testi aracı kullanın.

  1. Glikoliz stres testi ve hücre Mito stres testinde ayrı levhalar için tohum hücreleri. Her test için bir şişeye gecede kültür ile hücreler kullanın.
  2. Hücreleri 200 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi. Uygun orta 1 mL hücrelerde resuspend ve bunları kabul.
  3. 4 x 106 canlı hücre 400 μL (kullanım uygun orta) son hacim için ekleyin.
  4. B-G. wells hücre süspansiyon 50 μL plaka 500.000 hücreleri bir kuyuda seribaşı emin olun.
    Not: Diğer normalleştirme uyguladıkları iyi başına tam olarak 500.000 hücreleri temel çok önemlidir. Bu şekilde, farklı hastaların sonuçları karşılaştırılır. Çoğaltır en uygun sayısı altı, burada açıklandığı gibi var. Primer Hücre bazen yanlışlıkla davranır bu yana daha az çoğaltır kullanmanız önerilmez.
  5. 180 μL uygun orta kuyu A ve H (Bu wells bir arka plan düzeltme olarak görev yapacak) içine ekleyin.
  6. 400 x g oda sıcaklığında 5 min için plaka santrifüj kapasitesi ile fren 1 olarak ayarlayın.
  7. Uygun orta 130 μL wells iki 8-şey ekstraselüler akı analyzer tabak B-G yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde ekleyin. Görsel olarak hücreleri stabil kuyu dibine mikroskop altında görüntüleyerek uyduğunu doğrulayın.
  8. Koyun bir oksijen, Sigara-CO2plaka, 37 ° C kuluçka 30 dk için.

7. yükleme sensör kartuş

  1. Glikoliz stres testi için her biri 100 mM glikoz, 20 mikron Oligomycin A ve 1 M 2-DG, glikoliz stres testi ortamda tüm 250 μL hazırlayın.
  2. Her 20 mikron Oligomycin a, 15 mikron FCCP, 30 mikron FCCP ve 10 mikron karışımı 250 μL hücre Mito stres test için hazırlamak Rotenon ve 10 μg/ml Antimycin A, tüm hücre Mito stres testi orta BSA olmadan.
    Not: FCCP titrasyon için yeterli hastaların malzeme olmadığından iki FCCP konsantrasyonlarda bir tahlil enjekte önerilir. Yine de, konsantrasyonları araştırmacı tarafından tespit edilmelidir.
  3. Bileşikleri (Tablo 1) aşağıdaki gibi kartuş uygun enjektör bağlantı noktalarına yüklemek:

8. Program kurma

  1. Glikoliz stres testi için programını Tablo 2' de açıklandığı gibi ayarlayın.
  2. Hücre Mito stres testi için programını Tablo 3' te açıklandığı gibi ayarlayın.
  3. Programı başlatın. Calibrant plaka (istendiğinde) tahlil plaka ile değiştirin.

9. değerlendirme ve sonuçların yorumlanması

  1. Glikoliz stres testi sonuçlarında en düşük D.H.T. değeri 2-DG enjeksiyon diğer D.H.T. değerlerden sonra çıkarma.
    Not: Glycolytic asitleştirme bu en düşük değerini temsil eder. Genellikle, en düşük değeri 4th ölçümdür.
  2. Bazal asitleştirme, glikoliz, maksimal glikoliz ve glycolytic işlev (Şekil 2A) parametrelerinden Glycolytic rezerv hesaplamak. En düşük D.H.T. değer çıkarılarak sonra bazal asitleştirme ilk üç ölçüm noktalarından D.H.T. ortalaması olarak hesaplamak (atın ilk D.H.T. değeri önemli ölçüde diğer ikisini farklıysa), D.H.T. ortalaması üzerinden üç ölçü olarak glikoliz hesaplamak puan glikoz enjeksiyon sonra ve maksimal glikoliz D.H.T. ortalaması üzerinden üç ölçüm Oligomycin sonra bir enjeksiyon puan hesaplamak. Glycolytic hesaplamak rezerv maksimal glikoliz glikoliz eksi olarak.
    Not: Alternatif olarak, üç noktalarından ölçülen en yüksek D.H.T. değeri maksimal glikoliz hesaplama için kullanın.
  3. Hücre Mito stres testi sonuçlarında en düşük OCR değeri Rotenon/Antimycin A enjeksiyon diğer OCR değerlerden sonra çıkarma.
  4. Bazal solunum, ATP üretimi, maksimal solunum ve mitokondriyal işlev (Şekil 2B) parametrelerinden yedek kapasite hesaplayın. En düşük fiyat OCR değeri çıkarılarak sonra ortalama olarak ilk üç ölçü noktaları bazal solunum OCR hesaplayın.
    Not: Maksimal solunum en yüksek OCR FCCP enjeksiyon sonra değerdir.
  5. ATP üretimi hesaplaması için üç OCR ölçüm puan ortalaması Oligomycin A enjeksiyon bazal solunum dan sonra çıkarma. Yedek kapasitesi maksimal solunum bazal solunum eksi olarak hesaplayın.
    Not: Her zaman en yüksek OCR değerinden bağımsız olarak kullanılan FCCP konsantrasyon maksimal solunum hesaplayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BCP-ALL (B-hücre habercisi akut lenfoblastik lösemi) ve AML (Akut myeloid lösemi) hastalar, glikoliz stres testi ve lösemik patlamaların hücre Mito stres testi ölçümleri sonra eğrileri Şekil 3 gösterir. Bu ölçümler metabolik parametreleri hesaplanması da belirtilir. iyi başına 500.000 hücre tohumlari ve tüm ölçümler hexaplicates yapılmıştır.

Böylece hücrelerin besin yoksun bulunmaktadır glikoliz stres testinde sadece bazal orta, kullanılır. Elde edilen ilk parametredir hücrelerde depolanan glikoz miktarını yansıtmalıdır bazal asitleşme. Hücreleri Glikoz kullanmak ve laktat için fermente beri ilk enjeksiyon sonra D.H.T. artar. Oligomycin A ikinci enjeksiyon içinde ATP sentaz engeller ve böylece hücreleri esas olarak glikoliz ATP üretmek için yönlendirir. Bu daha da D.H.T. yükselmesine neden olmamalıdır. 2-DG enjeksiyon tamamen glikoliz engeller ve D.H.T. düşer.

Hücre Mito stres testinde glutamin ve glukoz ile desteklenmiş bir orta kullanılır, böylece hücreleri tüm besin yoksun değil ve bazal solunum parametre onların Bazal metabolik durumunu gösterir. İlk enjeksiyon Oligomycin a sonra hücreler mitokondrial solunum inhibe ve OCR bir azalma temsil glikoliz geçin. Böylece hücreleri şimdi maksimum hızı ve en yüksek değerini OCR yükselişi oksijen tüketmek FCCP (ikinci ve üçüncü enjeksiyon), diğer yandan, solunum, ATP üretimi uncouples. Rotenon ve Antimycin bir karışımı son enjeksiyon tamamen mitokondrial solunumu engeller ve OCR sıfıra yakın azalır.

Figure 1
Şekil 1: kemik iliği örneği yoğunluk gradient Santrifüjü. Mononükleer hücreler lösemik hücreler için zenginleştirilmiş yoğunluk gradient medyum tarafından ayrılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: anahat glikoliz stres testi ve hücre Mito stres testi (A)örnek glikoliz stres testi sonucu. (B) örnek hücre Mito stres testi sonucu. Parametreleri eğrileri içinde gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: BCP-ALL (A, B) ve (B, C) AML hasta lösemik patlamaların analizini ekstraselüler akı. (A ve C) glikoliz stres test sonuçları. Unutmayın ilk ölçüm noktası önemli ölçüde diğerlerinden farklı olabilir ve analiz bu durumda tutulmalıdır. (B ve D) hücre Mito stres test sonuçları. Parametreleri eğrileri içinde gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bağlantı noktası Glikoliz stres testi Hücre mito stres testi
Bağlantı noktasına yüklemek Wells son konsantrasyonu Bağlantı noktasına yüklemek Wells son konsantrasyonu
A 100 mM glikoz 20 μL 10 mM glikoz 20 mikron Oligomycin A 20 μL 2 mikron Oligomycin A
B 20 mikron Oligomycin A 22 μL 2 mikron Oligomycin A 15 mikron FCCP 22 μL 1,5 MİKRON FCCP
C 1 M 2-DG 25 μL 100 mM 2-DG 30 mikron FCCP 25 μL 4,5 MİKRON FCCP
D X 10 mikron Rotenon 25 μL ve 10 μg/ml Antimycin A 1 mikron Rotenon ve 1 μg/ml Antimycin A

Tablo 1: Bileşik birimleri.

Adım Ayarlar
Kalibrasyon Otomatik
Denge Otomatik
Temel ölçüm Üç kez:-3 dk, bekle-0 dk, ölçü-3 dk karıştırın.
Enjeksiyon'ın bağlantı noktası a Enjeksiyon
Ölçüm Üç kez:-3 dk, bekle-0 dk, ölçü-3 dk karıştırın.
Enjeksiyon bağlantı noktası B Enjeksiyon
Ölçüm Üç kez:-3 dk, bekle-0 dk, ölçü-3 dk karıştırın.
Enjeksiyon C noktasının Enjeksiyon
Ölçüm Dört kez:-3 dk, bekle-0 dk, ölçü-3 dk karıştırın.

Tablo 2: Program glikoliz stres testi için.

Adım Ayarlar
Kalibrasyon Otomatik
Denge Otomatik
Temel ölçüm Üç kez:-3 dk, bekle-0 dk, ölçü-3 dk karıştırın.
Enjeksiyon'ın bağlantı noktası a Enjeksiyon
Ölçüm Üç kez:-3 dk, bekle-0 dk, ölçü-3 dk karıştırın.
Enjeksiyon bağlantı noktası B Enjeksiyon
Ölçüm Üç kez:-3 dk, bekle-0 dk, ölçü-3 dk karıştırın.
Enjeksiyon C noktasının Enjeksiyon
Ölçüm Üç kez:-3 dk, bekle-0 dk, ölçü-3 dk karıştırın.
D bağlantı enjeksiyon Enjeksiyon
Ölçüm Üç kez:-3 dk, bekle-0 dk, ölçü-3 dk karıştırın.

Tablo 3: Program hücre Mito stres testi için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Akut lenfoblastik lösemi (ALL) ile hastalardan elde edilen birincil lösemik patlamaların OCR ve D.H.T. değerleri tarafından değerlendirildi metabolik aktivite ölçümü için yukarıda açıklanan protokolü sağlar veya akut miyeloid lösemi (AML). Bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak ölçüm gerçek zamanlı canlı hücrelerdeki metabolik profili tespiti sağlar avantajdır. Esasen, her adımda sağlanan iletişim kuralı bir çalışma planları hücre türüne bağlı olarak ayarlanmış olabilir. Burada, hangi sonuçları etkileyebilecek ve en uygun değerler daha az sağlayabilir en önemli parametreler tartışacağız.

En iyi duruma getirme yolunda ilk adım malzeme donmuş taze malzeme vs elde edilen veri karşılaştırması yapıldı. Yetenek donmuş malzeme metabolik etkinliğini ölçmek için sıvı azot bankada saklanan hastaların örneklerinin retrospektif çalışmalar için izin vermez. TÜM örneklerini durumunda AML hücreleri de en iyi sonuçları ile de-dondurma sonra ölçüldü, ancak yalnızca gelen taze malzeme tutarlı metabolik aktivite tespit edebildik.

İkinci en iyi duruma getirme birincil lösemik patlamaların ekimi adımdır. Biz bir gecede kültür ya da (kültür) olmadan düz yoğunluk gradient ayırma sonra hücrelerin metabolik aktivite test ettik. Hücreler yoğunluk gradient ayırma kalıcı ve hayati bir mikroskop altında baktı sonra onların metabolik aktivite Engelli olsa bile. Genel olarak D.H.T. ve OCR değerleri düşük bulunmuştur ve ekili hücrelerde yaptıkları gibi Ayrıca, enjeksiyon sonra OCR veya D.H.T. değerleri en iyi şekilde yanıt vermedi.

Farklı koşullar altında ekimi de sonuçları etkileyebilir. İnsülin transferrin Sodyum selenit ek (ITS) kullanarak iyi bir uygulama birincil yetiştirilmesi8patlamaların, ancak bu ek hücreleri metabolik aktivite ile müdahale kabul edilir. Hücre Mito stres testi sırasında lösemik patlamaların Its ile ekili Oligomycin A için yanıt vermedi (OCR azaltmak ATP bağlı solunum hesaplamak için). Ayrıca mezenkimal kök hücre (MSC) hücrelerle birlikte yetiştirmeye çalıştık ama bu durumda, OCR ve D.H.T. değerleri daha düşük MSCs ekili hücrelere karşılaştırılmıştır. Özet olarak, birincil patlamaların RPMI lösemi hastalardan yetiştirilmesi % 10 ile orta FBS en iyi seçenektir.

Hastalarda metabolik profilleri karakterizasyonu için uygun olan bir yandan limit test örnekleri sayısı üzerinde ancak diğer yandan ilgili sonuçlar verir bazı ölçütlere uyması gerekir. İle yüksek cellularity hastalarda metabolik fonksiyon şiddetindeydi (bir ölçüm için 500.000 hücreleri numaralı seribaşı / hexaplicate wells başı) ve sadece 80 ve lösemik patlamalar daha yüksek bir yüzdesi örnekleriyle belirsiz olarak algılanmasını önlemek için ölçülen metabolik aktivite diğer hücre tiplerinin süspansiyon mevcut.

Veri analizi çok önemli adımlardan biri normalleştirme, farklı lösemik örneği arasında metabolik parametreleri karşılaştırıldığında olabilir olduğunu. Lösemik hücre hatları ile gerçekleştirilen önceki deneylerimiz göre bulduk normalleştirme hücre sayısı için en iyi sonucu verir. İyi başına hücreleri belirli sayıda araştırmacı tarafından belirlenecek ihtiyacı ve büyüklüğüne ve test hücrelerinin metabolik aktivite bağlıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Çek Pediatrik Hematoloji merkezleri teşekkür etmek istiyorum. Bu eser yapıldı tarafından desteklenen Grant, Sağlık Bakanlığı (NV15-28848A), Sağlık Bakanlığı Çek Cumhuriyeti, Prag, Çek Cumhuriyeti 00064203 Üniversitesi Hastanesi konuşlanmıştır ve Milli Eğitim Bakanlığı, gençlik ve spor NPU tarafından ben nr. LO1604.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement Gibco, ThermoFisher Scientific 61870-010
Fetal Bovine Serum Biosera FB-1001/100
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco, ThermoFisher Scientific 15240-062
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G
D-(+) Glucose Sigma-Aldrich G7021-100G
Oligomycin A Sigma-Aldrich 75351-5MG
2-Deoxy-D-glucose Sigma-Aldrich D8375-1G
FCCP Sigma-Aldrich C2920-10MG
DMSO Sigma-Aldrich D8418-100ML
Rotenone Sigma-Aldrich R8875-1G
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674-25MG
Seahorse XF Base Medium, 100 mL Agilent Technologies 103193-100
L-glutamine solution, 200 mM Sigma-Aldrich G7513-100ML
HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 Sigma-Aldrich H0887-100ML
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280-25G
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2153-10G
Ficoll-Paque Plus Sigma-Aldrich GE17-1440-02 Density gradient medium
Seahorse XFp FluxPak Agilent Technologies 103022-100
Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive ThermoFisher Scientific CB40240
Seahorse Analyzer XFp Agilent Technologies S7802A
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate Agilent Technologies 103025-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).
  2. Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate. Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).
  3. Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).
  4. Wise, D. R., Thompson, C. B. Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer. Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).
  5. Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel. Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).
  6. Liberti, M. V., et al. A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product. Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).
  7. Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
  8. Hermanova, I., et al. Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells. Leukemia. 30, 209-218 (2016).
  9. Malandrino, M. I., et al. Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).
  10. Patella, F., et al. Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).
  11. Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).
  12. Simonnet, H., Vigneron, A., Pouysségur, J. Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption. Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).
  13. Martínez-Reyes, I., et al. TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions. Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).
  14. Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).
  15. Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio. The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).
  16. Morciano, G., et al. Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals. Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).
  17. Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 12553-12558 (2010).
  18. Lee, K. -H., et al. Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator. The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).
  19. Godlewski, J., et al. MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells. Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).
  20. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).
  21. Kaplon, J., et al. A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence. Nature. 498, 109-112 (2013).
  22. Pardee, T. S., et al. A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).
  23. Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).
  24. Hrušák, O., Porwit-MacDonald, A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).
  25. Amin, H. M., et al. Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias. Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).
Birincil lösemi hücrelerinin metabolik profili değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hlozková, K., Starková, J. Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (141), e58426, doi:10.3791/58426 (2018).More

Hlozková, K., Starková, J. Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (141), e58426, doi:10.3791/58426 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter