Summary
ここでは、3 アダルト ゼブラフィッシュ損傷モデルと免疫抑制薬の治療との併用について述べる。再生組織のイメージングに関するガイダンスをそこに骨石灰化を検出することに提供します。
Abstract
ゼブラフィッシュは切断後 (フィン) の付属肢を含む様々 な臓器を再生することができます。受傷後約 2 週間以内に復元する骨の再生が含まれます。さらに、ゼブラフィッシュ、スカルの穿頭後急速に骨を癒すし、ゼブラフィッシュ骨ひれ光線に簡単に導入することができます亀裂を修復することができます。これらの傷害アッセイは、急速に骨の形成に及ぼす投与薬をテストする実現可能な実験パラダイムを表現します。ここでは、これら 3 損傷モデルの使用と骨抑制と免疫抑制効果を発揮する全身性ステロイド治療との併用について述べる。アダルト ゼブラフィッシュにおける免疫抑制療法の準備、フィン切断、頭蓋骨の骨やひれ骨折の穿頭を実行する方法を示す、グルココルチコイドの使用で両方の骨の形成が与える影響について説明する方法でワークフローを提供します。骨芽細胞と骨の自然免疫の一部として単球/マクロファージ系統の細胞。
Introduction
ゼブラフィッシュでは、脊椎動物の発生と疾患研究に強力な動物モデルを表します。これは、彼らは、非常によく繁殖小動物とそのゲノムは完全にシーケンス化された操作1に従うことという事実のためです。その他の利点には、生体内イメージング アダルト ゼブラフィッシュ2とゼブラフィッシュ幼虫3で高スループット薬物画面を実行する機能など、さまざまな段階での継続的なライブ イメージングを実行するためのオプションが含まれます。さらに、ゼブラフィッシュはさまざまな臓器や骨などの組織に高い再生能力を持っているし、骨疾患を勉強して4,5を修復する有用なシステムとして提供します。
ステロイド性骨粗鬆症 (GIO) は、グルココルチコイド、たとえば喘息や慢性関節リウマチの自己免疫疾患治療の過程で長期的治療に起因する疾患です。ジオを表しグルココルチコイド治療を受けた患者の約 30% で成長する、主要な健康上の問題6。したがって、非常に詳細に骨免疫抑制の影響を調査することが重要です。近年さまざまなジオの病態を扱うゼブラフィッシュ モデルが開発されています。グルココルチコイドを介した骨の損失は、ゼブラフィッシュの幼虫、たとえば、薬剤スクリーン7で骨量を増やす中和化合物の同定につながったに誘導されてきました。さらに、ステロイド性骨抑制効果に真似されているゼブラフィッシュ スケールの in vitroとin vivoの8,9。これらの試金は非常に説得力のあるアプローチ、特にに関して新規免疫抑制と骨の同化作用の薬の同定。しかし、彼らは部分的にしか内骨格を考慮し、再生のコンテキストで実行されていません。したがって、彼らは大人、再生骨の急速なモード中のグルココルチコイドを介した効果の調査を許さない。
ここでは、大人のゼブラフィッシュ骨再生を受けているグルココルチコイドを介した効果を研究する研究者を有効にするプロトコルを提案します。傷害モデル ゼブラフィッシュ尾びれ、スカルの穿頭およびひれ光線骨折 (図 1 a-1 C) の作成の部分の切断が含まれ、インキュベーション (図 1Eを介してグルココルチコイド露出と組み合わせて).最近フィンと頭蓋骨の骨10を再生成する大人のゼブラフィッシュの 1 つ一般的に規定する副腎皮質ステロイド薬のプレドニゾロンへの露出の結果を記述するこの議定書の部分を使いました。ゼブラフィッシュ、プレドニゾロン内服は減少した骨芽細胞増殖、不完全な骨芽細胞分化や単球/マクロファージ系統10におけるアポトーシスの急速な誘導につながります。このプロトコルでも述べる骨折が骨のシングルフィンの線のセグメント11に導入できる方法として破壊修復中にグルココルチコイドを介した骨発生効果を勉強して、このアプローチが役に立つかもしれません。紹介した方法は、急速に骨の再生の糖質コルチコイド作用機序を基になる更に対処するのに役立ち、ゼブラフィッシュ組織再生のコンテキストで全身薬物管理の他の設定に用いることもできます。
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Protocol
ここで説明したすべてのメソッドは、Landesdirektion ドレスデンによって承認された (許可番号: AZ 24 D-9168.11-1/2008-1 AZ 24-9168.11-1/2011-52、AZ 24-9168.11-1/2013-5、AZ 24-9168.11-1/2013-14、アリゾナ州 DD24.1-5131/354/87)。
1. 材料とソリューションの準備
注: プレドニゾロン、他のステロイド薬のようにつながる免疫抑制。したがって、予防措置は、実験中に扱われた動物での感染を防ぐために取られなければなりません。この最後、オートクレーブ ガラス陶器、'水を魚' (すなわち、大人のゼブラフィッシュをリアに使用される水) 実験を開始する前に。
- 実験で使用するゼブラフィッシュの数を計算します。コントロールとして個人を必ず入れてください。
- オートクレーブ 600 mL ガラス ビーカー オートクレーブ テープでアルミ箔で覆われています。ゼブラフィッシュが個別に扱われる、従って 1 ガラス ビーカーはゼブラフィッシュごとに必要です。
- 実験に必要な魚の水の量を計算します。300 mL が個人と一日あたり必要です。実験の長さを考慮 (例えば、 1 週/7 日)。
- 魚の水とガラスの瓶を埋める、それらとオートクレーブ オートクレーブ テープでボトルを閉じます。理想的には、2 L ボトルを使用、1 L や 5 L のような他のボトルを使用することもできます。
注: 実験が長い場合 (例えば、 4 週間/28 日) とガラスびんの量は限られている、時に数日以上のボトルを用意し、実験を通して (1.3 〜 1.4) を繰り返して確認します。 - ジメチルスルホキシド (DMSO) で 100 mM の無菌ろ過プレドニゾロン プレドニゾロンの原液を準備します。1 mL や 2 mL 遠心チューブ因数でストックを固定します。
警告: 常に摩耗保護時を服のプレドニゾロン (保護手袋、安全ゴーグル、白衣) 作業。 - 実験の最初の日にそれぞれプレドニゾロンと DMSO、インキュベーション ソリューションを準備します。このため、100 mM プレドニゾロン原液の必要量を解凍し、プレドニゾロンを 50 μ M の最終的な集中にオートクレーブ処理した魚の水に追加します。
- コントロール治療のオートクレーブ処理した魚の水に DMSO の対応するボリュームを追加します。例として 2 L プレドニゾロン含まれている魚の水を生成する魚水 2 L に 100 mM プレドニゾロンの在庫の 1 つの mL を追加します。魚の水の別の 2 L 瓶でそれに応じ 1 mL の DMSO を追加します。
- 27 ° C の部屋で理想的に薬物治療を実行する指定されている適切な場所における業務します。
2 ゼブラフィッシュのヒレで怪我の発生
注: ゼブラフィッシュのヒレの骨を傷つけないように、フィン (切断、尾鰭で通常) の切除を実行または個々 の骨ひれ光線 (破壊モデル) を破壊します。この目的のために大人のゼブラフィッシュをまず anaesthetize します。
- 切断
- 大人のゼブラフィッシュを anaesthetize に準備 100 φ シャーレの 0.02% を含む MS 222 (メタンスルホン酸アミノ安息香酸エチル 3) を魚水 (この水では、オートクレーブ処理する必要はありません)。
- 魚ネットを使用して MS 222 含むシャーレに一度に 1 つゼブラフィッシュを転送し、動きなしその側にタッチしても反応しないし、それを孵化させなさい。鈍い鉗子で肛門のひれに触れることによって後者をテストします。
- フィン切除12の適切なレベルである麻酔のレベル 4 に達するまで待機します。この段階での蓋の動きの速度の低下、筋肉の緊張が失われ、タッチ12時に魚が移動しません。
- 鈍い鉗子がかかるし、100 mm ペトリ皿の逆蓋にハイパーカプニア ゼブラフィッシュを慎重に転送します。その側に、ゼブラフィッシュを配置します。ゼブラフィッシュの右の側面などに、同じ方向に常にあるされていることを確認します。メスまたはかみそりの刃、フィン (図 1 a, 2 a) の 50% を切除します。
注: ゼブラフィッシュのヒレ再生の速度は切除フィン組織の量に依存、すなわちより多くのフィン組織切除は、フィンが13を再生成、高速。したがって、最小限に抑えるためフィンの再生の変化は常にすべてのゼブラフィッシュの同じレベルでフィンを切除しておきます。 - プレドニゾロンやオートクレーブ処理した魚の水を含む DMSO の 300 mL を含むオートクレーブ ガラス ビーカーに負傷したゼブラフィッシュを転送します。ゼブラフィッシュのエスケープを避けるためにアルミ箔をガラスのビーカーをカバーします。
- ゼブラフィッシュ実験のための必要な数に達するまで、手順 2.1.2 する 2.1.3.
- 大人のゼブラフィッシュを anaesthetize に準備 100 φ シャーレの 0.02% を含む MS 222 (メタンスルホン酸アミノ安息香酸エチル 3) を魚水 (この水では、オートクレーブ処理する必要はありません)。
- 尾翼破壊
- 魚の水や E3 で 2% アガロース溶液を加熱することによってアガロース コーティング 100 mm ペトリ皿を準備 (胚メディア 3、50 mM 塩化ナトリウム 0.17 mM 塩化カリウム、0.33 mM 塩化カルシウム、硫酸マグネシウム 0.33 mM)。慎重にペトリ皿にソリューションの約 10-15 mL を注ぐ。皿の底を完全にカバーされなければなりません。固めるアガロースをしましょう。
- セクション 2.1 で説明されているように、ゼブラフィッシュを anaesthetize します。
- 鈍い鉗子がかかるし、ハイパーカプニア ゼブラフィッシュを慎重に agarose コーティングの 100 mm ペトリ皿に転送します。その側に、ゼブラフィッシュを配置します。解剖顕微鏡の下で完全に異なる骨ひれ光線を特定し、線セグメントをフィンができなければ尾鰭に広がった。ゼブラフィッシュの右の側面などに、同じ方向に常にあるされていることを確認します。
- 注射針 (0.3 mm × 13 mm) で骨ひれ線セグメント (図 1 b) の中心部に破壊を紹介します。これを行うには、針がわずかにプッシュ セグメント亀裂 (図 2 bの矢印) が表示されるまで。穏やかな圧力が強い 2 つの反対 hemirays の 1 つだけの破壊につながるしながら圧力は両方の hemiray セグメントの破壊に します。
- これが大きくフィンの安定性が損なわれるので、フィンであまりにも多くの骨折を取り上げないでください。提案として、骨折 3 に 5 フィン光線にのみを適用します。
- 常に異なるひれ光線、3、7 (または 8) の背びれ光線と腹ひれレイ 3 でたとえば、ゼブラフィッシュの対応するセグメントで骨折を生成します。骨折の近位遠位のレベルは 3 セグメントひれ光線の分岐ポイント11に近位に最適です。
- プレドニゾロンやオートクレーブ処理した魚の水を含む DMSO の 300 mL を含むオートクレーブ ガラス ビーカーに負傷したゼブラフィッシュを転送します。ゼブラフィッシュのエスケープを避けるためにアルミ箔をガラスのビーカーをカバーします。
- ゼブラフィッシュ実験のための必要な数に達するまでは、2.2.2 に 2.2.5 手順を繰り返します。
3. 頭蓋骨の頭蓋骨損傷 (穿孔) の生成
注: ゼブラフィッシュの研究は、哺乳類の頭蓋骨の骨に相同。つまり、これらの骨格の骨14は、GIO の病因を調査するとき、特別な興味の組織を表します。頭蓋骨を傷つける、trepanation はドリル11の助けを借りてOs フロンターレやOs parietale (図 1、2 の C) の穴をドリルダウンして実行します。
- セクション 2.1 によるとゼブラフィッシュを anaesthetize します。
- 麻酔のゼブラフィッシュを直立した握る鉗子で、頭蓋骨の骨がよく上記の (図 1) 解剖顕微鏡の下で目に見える。
- 前頭骨 (Os フロンターレ) の中央に回転のドリルを見つけ、骨をタッチします。作り出された穴は、ドリルはり (図 2, 図 3 b500 μ m) のサイズのことです。
注: する傷害を生産しながら、ドリルを横方向に移動しないようにしてください。また停止直後に骨の抵抗が急に値下がりしました。さらにいずれかをドリルはしない、そうでなければ脳損傷15になります。 - それは完全に麻酔から回復するまでの魚の水で満たされたケージに負傷したゼブラフィッシュを転送します。慎重に見る
- 魚の水に加えてプレドニゾロンまたは DMSO 含有ガラス ビーカーに負傷したゼブラフィッシュを転送します。
4. 孵卵中ゼブラフィッシュの治療
注: プレドニゾロン/DMSO の適用時に魚の水を含む薬、毎日変わる、ゼブラフィッシュは定期的に供給する必要があります。
- 水の変化
- 魚の水を交換し、100 mM プレドニゾロンの在庫を解凍し、準備にオートクレーブ処理した魚で 50 μ M のプレドニゾロンの量は水新鮮な治療期間の毎日です。それに応じてコントロール ゼブラフィッシュの魚の水を含む DMSO を準備します。
- そのインキュベーション ソリューションで単一収容されたゼブラフィッシュを含むガラス ビーカーを取るし、適切なコンテナー、たとえば住宅のケージにゼブラフィッシュを含むソリューションを転送します。
注: 常にプレドニゾロンと DMSO の使用別の中間容器処理ゼブラフィッシュ、それぞれ、DMSO コントロール ゼブラフィッシュしプレドニゾロン公開されませんを確認します。 - 魚の水 (300 mL) を含む新鮮な薬剤でガラス ビーカーを補充します。
- 中間コンテナーから純魚を使用した新鮮なインキュベーション ソリューションを含むガラス ビーカーに、ゼブラフィッシュを転送します。ゼブラフィッシュのエスケープを避けるために箔を戻します。
- 実験の時は、2 週間を超えた場合、ガラス ビーカーを交換します。
- 給餌
- (2 日前) までの短い治療中ゼブラフィッシュを与えないでください。長い実験中にゼブラフィッシュをフィードします。培養液の汚染を避けるために特別な注意を取る。したがって、アルテミアの sspではなく薄片の食糧と 1 日おきにのみをフィードします。
注: アルテミア若いゼブラフィッシュを飼料に使用されて定期的に、ゼブラフィッシュの haltering ユニットで利用可能にする必要があります。- 魚の水を交換すると、フィードのガラス ビーカーでアルテミア sspとゼブラフィッシュ前に約 2 時間。プラスチック ピペットを使用し、ガラス製ビーカーあたり孵化アルテミア溶液 0.5 を 1 mL をフィードします。
- 2 h 待ち、新鮮な薬剤セクション 4.1 によると魚の水を含むと孵化ソリューションを交換します。
- (2 日前) までの短い治療中ゼブラフィッシュを与えないでください。長い実験中にゼブラフィッシュをフィードします。培養液の汚染を避けるために特別な注意を取る。したがって、アルテミアの sspではなく薄片の食糧と 1 日おきにのみをフィードします。
5. 試料の分析
注: プレドニゾロンと魚の水を含む DMSO で負傷したゼブラフィッシュの培養後, 骨石灰化/石灰化解析 (5.1 の 5.3) を実行または解剖顕微鏡 (5.4)ゼブラフィッシュのライブ イメージングを実施10,11,16。フィンの再生の長さを決定してトランスジェニックゼブラフィッシュのレポーター遺伝子発現の違いを検出するライブ イメージングを使用します。
-
興味の組織の固定
- フィンおよび/または頭蓋骨の固定のため PBS で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を準備し、ストレージの-20 ° C で凍結します。作りたての使用 4% PFA PBS または使用する前に必要な量の雪解け。PBS に PFA を使用ことができますまた、2%。
注意: PFA は毒性がありヒューム フードの下で慎重に処理する必要があります。防護服を着用します。 - フィンの固定小さいペトリ皿を準備 (など30 mm) 冷たい 4 %pbs で PFA と皿の底は完全に覆われていることを確認してください。頭蓋骨の固定、準備ふた付きの小さなガラスの瓶や管冷 4% PFA PBS で。
注意: ハンドル PFA 有毒な発煙のフードの下でのみソリューションを含みます。防護服を着用します。 - 興味の組織を収穫します。
- 再収穫するフィンの組織や骨折フィン anaesthetize セクション 2.1 によるとゼブラフィッシュ セクション 5.1.5 によるとゼブラフィッシュを安楽死させるか。
- シャーレの蓋にハイパーカプニア ゼブラフィッシュを転送します。メスや剃刀の刃を使用して、フィンの再生を収穫します。収穫された組織の処理を容易にするフィンの再生に断端の組織を含めることを確認します。
- 一晩 4 ° C でシャーレを含む PFA でフラット、フィンを修正します。フラット固定固定中にフィンの組織のカーリング避けることができます。
- フラットを修正するには、切り株の背側または腹側の端に 1 つの微細鉗子でフィンの組織をつかむし、固定の解決で浸します。2 番目の微細鉗子で切り株の反対側のエッジをつかむし、皿の底にティッシュを少し下げて下さい。
- 20 に 10 を保持解放する前に s。フィンの組織する必要がありますもう丸くないです。場合を繰り返します。
- 負傷した頭蓋骨組織を収穫するためにゼブラフィッシュを安楽死させます。100 mm 径 0.1% を含むペトリ皿を準備 MS-222 魚の水で。漁網を使用して一度に 1 つゼブラフィッシュを MS 222 含むペトリ皿に転送します。麻酔 (延髄崩壊) のレベル 6 に達したとき供試体12の死を保証するために、少なくとも 10 分を待ちます。
- 頭と体の残りの部分から少しトランク組織を切ったメスします。ガラス瓶やプラスチック製のチューブの準備 4 %pfa ソリューションで収穫された組織を浸します。穏やかな揺動 4 ° C で 24 時間の修正。
- 長期固定後のサンプルを格納する PBS (3 × 20 分常温) で洗ってと増加のメタノール シリーズにメタノール御馳走 (1 x 30%、1 x 50%、1 x 70%、20 分の PBS で 2 x 100% メタノール)。
- -20 ° C で 100% メタノールでそれらを格納します。それ以外の場合、直接進む骨染色または他の分析に PBS で洗浄後。
- フィンおよび/または頭蓋骨の固定のため PBS で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を準備し、ストレージの-20 ° C で凍結します。作りたての使用 4% PFA PBS または使用する前に必要な量の雪解け。PBS に PFA を使用ことができますまた、2%。
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骨染色技術で私 (赤いアリザリン染色)
注: この染色・ ヴァン ・ Eeden et al. 199617とウォーカー ・ キンメル 2007年18変更によるとされます。- アダルト フィンまたは頭蓋骨の赤いアリザリン染色を収穫して苦境のティッシュ セクション 5.1 で説明。
- サンプルは、-20 ° C でメタノールに格納されていた、(70%、50%、30%、PBS 各 1 × 20 分) 逆メタノール シリーズを実行してサンプルを水分補給し、PBS で 2 回 20 分を洗います。脱イオン水で最低 5 分間のサンプルを洗います。
- 赤いアリザリン染色頭蓋骨、30% で 50 mg/mL のトリプシンとサンプルを扱う Na2B4O7室温を一晩飽和。この時間の間に岩石。リンス サンプル 30% 飽和 Na2B4O7ソリューションです。サンプルを 2 回各 5 分の脱イオン水を洗ってください。フィンの組織には、この手順は実行されません。
- アリザリン赤ソリューション (パート b: 0.5% アリザリンレッド S パウダー、脱イオン水で 10% グリセロール) を追加し、ルート チェックで潜伏中に後 1、2、4 時間または一晩染色サンプルをロックします。
- クリアするサンプルは、減少 1% カリウム水酸化物: グリセロール シリーズ (3:1 一晩、一晩 1:1, 1:3) とそれらを扱います。
- 0.1% 水酸化カリウムの 1:1 溶液中のサンプルを格納: 80% グリセロールとイメージングのための 80% のグリセロールでそれらをマウントします。
注: を組み合わせてアルシアン ブルー/アリザリン赤, アルシアン御馳走サンプルを減少エタノール シリーズとした治療フィンで 2 時間 (セクション 5.2.2) 水分補給後染色液 (一部 a: 最終的な 0.02% アルシアン ブルー、50 mM MgCl270% エタノール) 青染色50 mM MgCl2 (70%、50%、30%、各 1 × 15 分) と洗浄で 1 h (3 x 20 分) での最小値のためにそれらは脱イオン水。アリザリン赤染色 (セクション 5.2) を続行します。
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骨染色技術 II (カルセイン染色)
注: フィン骨折と頭蓋骨損傷で、カルシウムの沈着を検出するため活魚はカルセイン溶液で培養しました。- 脱イオン水 (pH 7.5) で 0.2% カルセインの必要量を準備します。PH が中性であることを確認します。1 M NaOH を使って pH を調整します。
- アルミ箔で覆われているガラス ビーカーで 20 分間カルセイン溶液 100 mL で同時に 3 ゼブラフィッシュまで孵化させなさい。
- 魚の水をビーカーに、ゼブラフィッシュを転送します。魚の水に新しいビーカーに転送する前に簡潔に泳ぐことができます。この新しいビーカー洗浄する 20 分間で泳ぐことができます。撮影 (セクション 5.4 を参照)。
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ゼブラフィッシュのライブ イメージング
- ゼブラフィッシュを損なうことがなく実験を通して頭蓋骨またはひれのように骨組織を再生の画像を取得するのにこの方法を使用します。セクション 2.1 によるとゼブラフィッシュを anaesthetize します。
- フィン再生の画像を取得するには、アガロース コーティング ペトリ皿 (セクション 2.2.1 を参照および図 1 b) にハイパーカプニア ゼブラフィッシュを転送します。
- 頭蓋骨の骨を再生の画像を取得するには、ゼブラフィッシュをスポンジ (図 1) で縦置きやゼブラフィッシュの幹を保持するために準備されているアガロース コーティングの皿に置きます。
- 目的の拡大および表面のセットアップを使用して解像度で画像を取得します。
- 新鮮なコンテナーや魚の水を含んでいる薬物に、ゼブラフィッシュを返します。
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Representative Results
ここで提示されたプロトコルは、ゼブラフィッシュ フィンと頭蓋骨10、11,16の再生過程で急激な骨形成を誘導するために繰り返し使用されています。プレドニゾロン内服の提案手法と組み合わせて、骨再生中のプレドニゾロンの効果に関する研究を追求できます。たとえば、骨の形成と再生成するにおける鉱化作用に関する研究を実行できます。プレドニゾロン、他グルココルチコイド19,20アリザリンレッド尾鰭組織 (図 3 a) を固定に染色によって検出された骨形成を含む、フィンの再生の全体的な抑制に します。同様に、プレドニゾロン (頭蓋骨) 頭蓋骨損傷閉鎖アリザリン赤 (図 3 b) またはカルセイン体内染色によって説明することができます遅らせる効果があります。さらに、プレドニゾロンは、単球/マクロファージ系統のアポトーシスを誘発することによってフィンと頭蓋骨の両方の組織の深遠な抗炎症効果を発揮します。凍結切片の免疫組織化学で数字を検出できる減らされたマクロファージ セクション、例えば、抗 mcherry 抗体を用いたトランスジェニックmpeg1: mCherry ゼブラフィッシュ (図 3)10,21.同様に、数、分布、増殖、アポトーシス エキソ - とエンドスケルトン (例えば椎) の関心の両方の他の細胞型の免疫組織化学の助けを借りて分析できます。
図 1: ゼブラフィッシュの実施します。メスの助けを借りてハイパーカプニア ゼブラフィッシュ尾びれ (切断) の (A) 切除。赤い破線は、切断レベルを示します。(B) フィンはレイ、実体顕微鏡下で注射針で実施ハイパーカプニアのゼブラフィッシュの破壊です。魚は、プロシージャの間に agarose コーティング シャーレ上に敷設されています。ペトリ皿の Agarose コーティングも再生または破壊修理中にゼブラフィッシュ フィンの画像を取得する使用されます。Anaestetized ゼブラフィッシュ、実体顕微鏡下でドリルの助けを借りて研究 (頭蓋骨損傷) の穿頭は (C) が実行されます。(D) 画像取得損傷後の頭蓋骨の骨を再生します。ハイパーカプニアのゼブラフィッシュはスポンジで上向きに置かれた、画像は顕微鏡の助けを借りて、取得されます。ペトリ皿は 0.02% を含む魚の水で満たされた MS 222。(E) プレドニゾロンまたは魚の水を含む DMSO のゼブラフィッシュのインキュベーション。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 0 h ポスト傷害 hpi の傷害の微視的ライブビュー).(A) Amputated 尾鰭。スケール バー = 200 μ m。 (B) フラクチャされたフィン レイ。骨折は、赤い矢印で示されます。スケールバー = 100 μ m。 (C) Trepanated スカル。損傷部位は、白の矢印によって示されます。スケール バー = 500 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 大人のゼブラフィッシュのプレドニゾロン治療の代表の結果。(A) アリザリン赤染色フィン再生 14 日ポスト切断 (dpa) で治療 (dt) の日。プレドニゾロン治療フィンは短い (図示せず) と肯定的な骨のマトリックスが検出されるアリザリン赤の小さいドメインが再生成されます。スケール バー 500 μ m。 (B) アリザリン赤染色 7 日ポスト傷害 (dpi) や dt で頭蓋骨を =。スケールバー = 100 μ m。この図は、アクセス許可10に変更されています。(C) Cryosection 無傷のスカルを見るし、脳の処理 (プレドニゾロン) と未処理 (DMSO) Tg の組織 (mpeg1: mCherry) Tg x (osterix: nGFP) 遺伝子改変レポーター魚、大食細胞 (自然免疫系細胞) が赤のラベルが緑22 21と骨芽細胞を形成する骨が付きます。マクロファージの数は、プレドニゾロン治療ゼブラフィッシュの大幅値下がりしました。免疫組織染色を行った Geurtzenらで説明されているよう10します。 ラベルに青 (DAPI) の核です。スケール バー = 20 μ m. BF: 明視野、epid: 表皮、bn: 骨。この図は、アクセス許可10に変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ゼブラフィッシュは、多くの点で骨格の研究に役立っています。選択した突然変異体が骨形成不全症、変形性関節症23,24,25,26,27などのひと疾患の側面を模倣し、体重計と同様、幼虫に使用されています。小分子画面7,28,29骨同化化合物を識別します。ゼブラフィッシュ臨床適用される薬での治療は、さらに骨にたとえば、推定の副作用を勉強する最適です。この中で、急速に骨の再生の有無は薬物誘発性骨不足の基になるメカニズム解明のため有利です。ここでは、骨の組織に悪影響を与える一般的に使用される抗炎症薬、糖質コルチコイド プレドニゾロンの薬物治療は成人の骨再生体制と組み合わされプロトコルを提案します。このプロトコルでは、正常に免疫を誘導し、骨のゼブラフィッシュ、再生組織の抑制効果に使用されているし、プレドニゾロンと背骨などの大人のティッシュの他の薬の影響に関する研究にも適応できます。ゼブラフィッシュ受けてフィンまたは頭蓋骨再生で免疫抑制剤治療を実行すると、次の詳細考慮に入れする必要があります。
傷害アッセイの再現性
フィンの再生中に再生速度 (すなわち、時間ユニットごとの骨を含むフィン組織の再生) は切除13されているフィンの組織の量に非常に依存します。フィンの再生の不要な変動を避けるために、常にすべての標本にフィンの組織の相当量を切除することを確認します。
骨ひれ光線骨折の実行は、少し骨ひれを選択した線セグメントの中央に注射針を押すことによって実施されています。骨ひれ光線は 2 hemirays を反対から成っている、1 つまたは両方の hemirays を骨折かどうか使用される圧力の量を決定します。我々 は両方 hemirays の破壊は、フィンのレイは、結果として次の日の間に切断可能性がありますを不安定にする傾向があるので、1 つだけの hemiray を破壊する低圧を適用することを好みます。
小径穴による頭蓋骨の頭蓋骨損傷は慎重に行わなければなりません。(すなわち小脳) 姿勢と運動の脳への損傷が行われる場合、赤字は供試体15の不安定なスイミングで明白になります。ゼブラフィッシュ小脳損傷は、薬物治療の副作用を示し、骨再生の研究には使用しないでください。
薬物治療の注意点
大人のゼブラフィッシュで一貫性のある免疫抑制と抗再生効果を生成するには、魚の水で 50 μ M のプレドニゾロンの投与量を採用しています。幼虫及び成虫のゼブラフィッシュの初期用量-反応の実験中にこの線量を同定しました。したがって、用量反応実験が適用され、その他の免疫抑制剤の必要量を識別するために実施されなければなりません。フィンの再生の長さは組織変化を高感度・検出が簡単な読み出しと、大人のためにフィン再生政権とこれらの最初の実験を組み合わせることをお勧めします。
免疫抑制療法は、扱われた標本を微生物感染症素因となります。したがって、オートクレーブ ビーカー オートクレーブ魚水を含んでいる 1 つの住宅は、重要です。これらの条件は遂行するより面倒な滅菌ではないが扱われたゼブラフィッシュの感染を最小限に抑えることができます。我々 はない (滅菌) 前処理したアルテミアの卵。ただし、必要に応じて、これはゼブラフィッシュ、感染を防止する追加措置かもしれません。さらに、メチレン ブルー (1%) など防腐剤物質は、使用前に水を魚に追加できます。
プレドニゾロン、短期的および長期的な実験では、魚の水の毎日の変更必要があります。8 週間大人ゼブラフィッシュを扱ってきた。このような長い時間のための多数の個人の治療、特定実験 '負荷' につながることができます、慎重に計画する必要があります。オートクレーブ魚水とガラス焼準備の必要量を常に持っているが極めて重要です。これはない (知識) にゼブラフィッシュでテストされています、興味の薬剤のための遅い解放ペレットの注入、ゼブラフィッシュの長期曝露量の貴重な代替を表します。
トランスジェニックゼブラフィッシュの解析
アリザリン赤とカルセイン染色により骨組織の石灰化/石灰化領域を染色する 2 つの方法を紹介します。さらに、再生フィンと頭蓋骨組織体内顕微鏡の助けを借りてイメージする方法を示します。後者の手法はトランスジェニックゼブラフィッシュ番号または選択した細胞、骨芽細胞などの免疫細胞の活動報告がイメージされている場合、非常に便利。たとえば、負傷者を犠牲にして赤いアリザリン染色を実行するゼブラフィッシュのプレドニゾロン投与の前にフィンを再生成または trepanated 頭蓋骨修復を受けている存在、数、骨形成、骨芽細胞の活動を写真を撮られることができます。遺伝子改変レポーター ライン Tg (osterix: nGFP)22。同様に、表皮組織に蛍光体を表現する遺伝子導入魚で一日の内で発生すると、表皮の傷口閉鎖を視覚化できます。また、損傷 (または扱われるプレドニゾロン個人に彼らの不在) のサイトで免疫細胞の蓄積は必要な光源とフィルターを装備した顕微鏡を簡単に監視できます。
合計では、ここで提示されたプロトコルはフィンまたは頭蓋骨の骨再生を受けているゼブラフィッシュの全身投与後の免疫抑制剤と他の薬の効果を研究に使用できます。これはジオの発症機序を記述して正常な骨再生のメカニズムを調査する役に立つでしょう。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この調査は、グラントのドレスデン中心部再生療法 (「ゼブラフィッシュ モデルとしてステロイド性骨量減少メカニズムを解明する」)、またドイツ研究振興協会 (Transregio 67, プロジェクトの助成金サポートされました。387653785) FK に。彼らの指導と骨ひれ光線の研究と骨折の trepanation の実行支援を 1 月 Kaslin と Avinash Chekuru に非常に感謝しております。実験では、設計、実行と KG と FK によって解析されました。FK は、原稿を書いていた。また、カトリン ・ ランバート、ニコール Cudak、クノップとブランド ラボ テクニカル サポートや議論のための他のメンバーに感謝したいと思います。感謝は、マリカ Fischer および優秀な魚のケアのための Jitka Michling とアンリエット ・ クノップとジョシュ ・ カリー、原稿の校正のためにまた行きます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3 mm x 13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
- Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Paul, S., Crump, J. G. Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish. Bonekey Reports. 5, 853 (2016).
- Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases. Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).
- den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis. Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- de Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).
- Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale. International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).
- Geurtzen, K., et al. Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues. Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).
- Geurtzen, K., et al. Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull. Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hirasawa, T., Kuratani, S. Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development. Zoological Letters. 1, 2 (2015).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Knopf, F., et al. Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin. Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Oppedal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Spoorendonk, K. M., et al. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- Gioia, R., et al. The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta. Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).
- Fiedler, I. A. K., et al. Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
- Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).
- Hayes, A. J., et al. Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis. PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).
- Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).
- de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).
