Summary
在这里, 我们描述了3成人斑马鱼损伤模型及其与免疫抑制药物治疗的联合使用。我们为再生组织的成像和在其中检测骨矿化提供指导。
Abstract
斑马鱼能够在截肢后再生各种器官, 包括附属物 (鳍)。这涉及到骨头的再生, 这重生在受伤后大约两周内。此外, 斑马鱼能够在颅骨钻孔引流后迅速愈合骨骼, 修复可以很容易地引入斑马鱼骨鳍射线的骨折。这些损伤分析是测试药物对快速形成骨的作用的可行实验范式。在这里, 我们描述了这3损伤模型的使用和他们联合使用与系统性糖皮质激素治疗, 这会发挥骨抑制和免疫抑制作用。我们提供了如何准备成人斑马鱼免疫抑制剂治疗的工作流程, 说明了如何执行翅片截肢、颅骨骨钻孔引流和翅片骨折, 并描述了糖皮质激素的使用如何影响骨形成成骨细胞和单细胞/巨细胞谱系作为先天免疫的一部分在骨组织。
Introduction
斑马鱼是研究脊椎动物发育和疾病的强大动物模型。这是由于他们是小动物, 繁殖得非常好, 并且他们的基因组是完全排序和服从操作1。其他优势包括在不同阶段执行持续实时成像的选项, 包括成人斑马鱼2的活体成像, 以及在斑马鱼幼虫3中执行高通量药物筛查的能力。此外, 斑马鱼在包括骨骼在内的各种器官和组织中具有很高的再生能力, 因而成为研究骨骼疾病和修复4、5的有用系统。
糖皮质激素引起的骨质疏松症是一种由糖皮质激素长期治疗导致的疾病, 例如哮喘或类风湿性关节炎等自身免疫疾病治疗过程。在大约30% 的糖皮质激素治疗患者中发展, 并代表一个主要的健康问题6;因此, 深入研究免疫抑制对骨组织的影响是非常重要的。近年来, 开发了各种斑马鱼模型来处理其发病机制。糖皮质激素介导的骨丢失已被诱导在斑马鱼幼虫, 例如, 导致反作用化合物的鉴定增加在药物屏幕7的骨量。此外, 在斑马鱼鳞片的体外和体内8,9, 糖皮质激素诱导的骨抑制作用被模仿。这些检测是非常令人信服的方法, 特别是当它涉及到识别新的免疫抑制剂和骨合成代谢药物。然而, 他们只是部分考虑到内骨骼, 并没有在再生环境中执行。因此, 他们不允许调查糖皮质激素介导的作用在成人, 再生骨形成的快速模式。
在这里, 我们提出了一个协议, 使研究人员能够研究糖皮质激素介导的对成人斑马鱼骨骼再生的影响。损伤模型包括斑马鱼尾鳍的部分截肢, 头骨的钻孔引流, 以及翅片射线骨折的创建 (图 1A-1C), 并结合糖皮质激素暴露通过孵化 (图1E).我们最近使用了本协议的一部分来描述暴露于泼尼松 (通常规定的皮质类固醇药物之一) 对成人斑马鱼再生鳍和颅骨骨10的后果。在斑马鱼中, 泼尼松在单核细胞/巨噬细胞谱系10中导致成骨细胞增殖减少、成骨细胞分化不完全和细胞凋亡快速诱导。在本议定书中, 我们还描述了如何将骨折引入单个骨翅片11, 因为这种方法在研究骨折修复过程中的糖皮质激素介导的影响时可能很有用。这里介绍的方法将有助于进一步解决在快速再生的骨骼中的糖皮质激素作用的基本机制, 也可能被用于在斑马鱼组织再生的背景下系统药物管理的其他设置。
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Protocol
此处描述的所有方法均由德累斯顿 Landesdirektion 批准 (允许编号: az 24 d-9168.11-1/2008-1, az 24-9168.11-1/2011-52, az 24-9168.11-1/2013-5, az 24-9168.11-1/2013-14, az DD24.1-5131/354/87)。
1. 材料和解决方案的准备
注: 泼尼松, 像其他糖皮质激素, 导致免疫抑制。因此, 必须采取预防措施, 以防止在实验过程中被处理的动物感染。为此, 在开始实验之前, 热压罐玻璃器皿和 "鱼水" (即用于后成人斑马鱼的水)。
- 计算在实验中使用的斑马鱼的数量。一定要包括作为控制的个人。
- 热压罐600毫升玻璃烧杯, 用高压灭菌胶带覆盖铝箔。斑马鱼将单独处理, 因此每只斑马鱼需要1玻璃烧杯。
- 计算实验所需的鱼水量。每人每天需要300毫升。考虑实验的长度 (例如, 1 week/7 天)。
- 用水灌满玻璃瓶, 关闭它们, 用高压灭菌胶带将瓶子热压。理想情况下, 使用 2 l 瓶, 但其他瓶子, 如 1 l 或 5 l 可以使用, 以及。
注意: 如果实验时间长 (例如, 4 weeks/28 天) 和玻璃瓶数量有限, 请确保在整个实验中至少准备好几天的瓶子, 并重复该过程 (1.3 到 1.4)。 - 准备在砜 (DMSO) 无菌过滤100毫米泼尼松的泼尼松股票溶液。冻结在1毫升或2毫升微量离心管等份的股票。
注意: 使用泼尼松 (防护手套、安全护目镜、实验室大衣) 时, 务必佩戴防护服。 - 在实验的第一天, 分别制备泼尼松和 DMSO 的孵化液。为此, 解冻所需量的100毫米泼尼松股票溶液, 并加入泼尼松到蒸压的鱼水在最后浓度为50µM。
- 对于控制处理, 将相应体积的 DMSO 添加到蒸压鱼水中。例如, 要生产 2 l 含水泼尼松, 加入1毫升100毫米泼尼松的股票到 2 L 鱼水。在另一个 2 L 瓶的鱼水中, 加入1毫升 DMSO, 相应地。
- 在指定进行药物治疗的适当地点工作, 理想情况下在27摄氏度的房间内。
2. 斑马鱼鳍损伤的产生
注意: 要伤害斑马鱼鳍骨, 执行翅片切除 (截肢, 通常在尾鳍) 或骨折单个骨鳍射线 (骨折模型)。为此, 麻醉成人斑马鱼首先。
- 截肢
- 麻醉成人斑马鱼, 准备一个100毫米直径培养皿包含 0.02% MS-222 (Ethyl-3-aminobenzoate 甲基磺酸) 在鱼水 (这水不需要蒸压)。
- 使用鱼网将一只斑马鱼一次转移到含有培养皿的 MS-222, 并孵育它, 直到它躺在它的一侧而没有运动, 并且不响应触摸。用钝钳接触肛门翅片, 测试后者。
- 等到麻醉达到4级, 这是适当水平的翅片切除12。在这个阶段, 鳃盖运动的速度减少, 肌肉的音调丢失和鱼不移动后触摸12。
- 服用钝钳, 并将麻醉斑马鱼小心地转移到100毫米培养皿的倒置盖子上。将斑马鱼放在侧边上。确保斑马鱼始终处于相同的方向, 例如在其右侧身体一侧。用手术刀或剃刀刀片, 切除50% 的鳍 (图 1A, 2A)。
注: 斑马鱼鳍再生的速度取决于切除翅片组织的数量,即切除的翅片组织越多, 鳍的再生速度就越快13。因此, 为了尽量减少鳍再生的变化, 一定要在所有斑马鱼的同一水平上始终切除鳍。 - 将受伤的斑马鱼转移到含有300毫升泼尼松或含有蒸压鱼水的 DMSO 的蒸压玻璃烧杯中。用铝箔盖住玻璃烧杯, 避免斑马鱼逃脱。
- 重复步骤2.1.2 到 2.1.3, 直到达到实验所需的斑马鱼数量。
- 麻醉成人斑马鱼, 准备一个100毫米直径培养皿包含 0.02% MS-222 (Ethyl-3-aminobenzoate 甲基磺酸) 在鱼水 (这水不需要蒸压)。
- 翅片断裂
- 通过在鱼水或 E3 中加热2% 琼脂糖溶液 (胚胎培养基3、50 mm 氯化钠、0.17 mm 氯化钾、0.33 mm 氯化钙、0.33 mm 硫酸镁), 制备琼脂糖涂层的 100 mm 培养皿。小心地将10–15毫升的溶液倒入培养皿中。盘子的底部应该完全覆盖。让琼脂糖凝固。
- 麻醉斑马鱼如第2.1 节所述。
- 采取钝钳和麻醉斑马鱼仔细转移到琼脂糖涂层100毫米培养皿。将斑马鱼放在侧边上。在解剖显微镜下, 完全传播尾鳍, 以能够识别不同的骨翅片和翅片射线段。确保斑马鱼始终处于相同的方向, 例如在其右侧身体一侧。
- 注射针 (0.3 毫米 x 13 毫米) 在骨翅片的中心部分引入骨折 (图 1B)。要做到这一点, 针被轻轻地推到线段上, 直到出现裂纹 (图 2B中的箭头)。而温和的压力只会导致两个对立的 hemirays 的断裂, 而更强的压力将导致两个 hemiray 段断裂。
- 不要在鳍中引入太多的裂缝, 因为这会极大地损害鳍的稳定性。作为建议, 只适用于3至5鳍射线的骨折。
- 在不同翅片和斑马鱼的相应段中, 总是产生骨折, 例如在背鳍射线3、7 (或 8) 和腹板翅片3。近端远端骨折是理想的3段接近鳍射线的分岔点11。
- 将受伤的斑马鱼转移到含有300毫升泼尼松或含有蒸压鱼水的 DMSO 的蒸压玻璃烧杯中。用铝箔盖住玻璃烧杯, 避免斑马鱼逃脱。
- 重复步骤2.2.2 到 2.2.5, 直到达到实验所需的斑马鱼数量。
3. 颅骨颅骨损伤的产生 (钻孔引流)
注意: 斑马鱼中的 calvariae 与哺乳动物中的颅骨骨同源。因此, 这些同机器人骨14代表一个特殊的兴趣组织, 当研究的发病机制。为了伤害头骨, 钻孔引流通过在 microdrill11的帮助下钻入os 前锋和/或os parietale (图 1C、2C) 中的一个孔来执行。
- 根据第2.1 节麻醉斑马鱼。
- 用镊子握住麻醉斑马鱼直立, 使颅骨骨骼在上面的解剖显微镜下可见 (图 1C)。
- 找到前额骨中心的旋转 microdrill (Os 前锋) 并触摸骨骼。所产生的孔是 microdrill 毛刺的大小 (500 µm,图 2C, 图 3B)。
注意: 在产生伤害时, 一定不要横向移动 microdrill。当骨头的阻力突然下降时, 也立即停止。不要再钻了, 否则大脑会损坏15。 - 将受伤的斑马鱼转移到充满鱼水的笼子里, 直到它完全从麻醉中恢复。小心点
- 将受伤的斑马鱼转移到鱼水加上泼尼松或含有玻璃烧杯的 DMSO。
4. 斑马鱼孵化期间的治疗
注: 在泼尼松/DMSO 的应用中, 含鱼水的药物需要每天更换, 斑马鱼需要定期喂食。
- 水的变化
- 为了交换鱼水, 解冻100毫米泼尼松的股票, 并准备所需的量50µM 泼尼松在蒸压鱼水新鲜的每一天的治疗期。为控制斑马鱼准备含有鱼类水的 DMSO。
- 在其孵化解决方案中, 用一个装有单套斑马鱼的玻璃烧杯将斑马鱼的溶液转移到适当的容器中, 例如一个临时外壳笼。
注意: 始终使用单独的临时容器泼尼松和 dmso 处理斑马鱼, 以确保 DMSO 控制斑马鱼不会接触到泼尼松, 反之亦然。 - 用含有鱼水的新鲜药物 (300 毫升) 重新填充玻璃烧杯。
- 使用鱼网将斑马鱼从临时容器转移到含有新鲜孵化溶液的玻璃烧杯中。放回箔, 避免斑马鱼逃脱。
- 如果实验时间超过2周, 交换玻璃烧杯。
- 喂养
- 在短期治疗 (长达2天) 不喂斑马鱼。在较长的实验中, 饲料斑马鱼。请特别小心, 以避免孵化解决方案的污染。因此, 饲料与卤虫 ssp , 而不是与薄片食品, 只有在每一天。
注意: 卤虫经常用于喂养年轻的斑马鱼, 并应在斑马鱼 haltering 单位提供。- 在鱼水交换前大约2小时, 在玻璃烧杯中用卤虫饲料喂斑马鱼。要做到这一点, 使用一个塑料移液器和饲料0.5 到1毫升孵化的卤虫溶液每玻璃烧杯。
- 等待2小时, 并根据第4.1 节交换含有新鲜药物的孵化液。
- 在短期治疗 (长达2天) 不喂斑马鱼。在较长的实验中, 饲料斑马鱼。请特别小心, 以避免孵化解决方案的污染。因此, 饲料与卤虫 ssp , 而不是与薄片食品, 只有在每一天。
5. 样品分析
注: 在泼尼松和含有鱼水的 DMSO 中孵化受伤的斑马鱼后, 分别进行骨矿化/钙化分析 (5.1 至 5.3) 或在解剖显微镜下进行斑马鱼活体成像 (5.4)10,11,16。使用实时成像确定翅片再生长度, 并检测转基因斑马鱼中报告基因表达的差异。
-
组织的固定的利益
- 用于固定鳍和/或头骨准备4% 多聚甲醛 (PFA) 在 PBS 和冻结在-20 °c 储存。在 PBS 中使用新鲜制备的 4% PFA, 或在使用前解冻所需的用量。或者, 可以使用 PBS 中的 2% PFA。
注意: PFA 是有毒的, 应小心处理在一个烟雾罩。穿防护服。 - 用于固定翅片准备一个小的培养皿 (例如, 30 毫米) 与冷 4% PFA 在 PBS 和确保盘子的底部完全覆盖。为颅骨的固定, 准备一个小玻璃罐与盖子或管与冷 4% PFA 在 PBS。
注意: 仅在烟雾罩下处理含 PFA 溶液, 因为它是有毒的。穿防护服。 - 收获感兴趣的组织。
- 根据第2.1 节或根据5.1.5 节安乐死斑马鱼的麻醉, 收获再生鳍组织或翅片与斑马鱼的断裂。
- 将麻醉斑马鱼转移到培养皿的盖子上。通过使用手术刀或剃刀刀片, 收获鳍再生。确保将残肢组织包括在再生鳍中, 以方便处理所采集的组织。
- 固定翅片扁平在 PFA 包含培养皿在4摄氏度过夜。扁平固定可避免在固定过程中翅片组织卷曲。
- 要修复扁平, 在树桩的背缘或腹侧边缘用一个细钳子抓住鳍组织, 并将其浸入固定溶液中。用第二个细钳子抓住树桩的另一边, 稍微将纸巾压到盘子底部。
- 在发布前保留10至二十年代。鳍组织不应该卷曲了。如果有, 重复。
- 安乐死斑马鱼为了收割受伤的头骨组织。准备一个100毫米直径培养皿包含 0.1% MS-222 在鱼水中。使用渔网将一个斑马鱼一次转移到含有培养皿的 MS-222。当6级麻醉 (髓质塌陷) 到达等待至少10分钟, 以确保标本死亡12。
- 用手术刀砍掉头部再加上身体其他部位的小躯干组织。将收获的组织浸入玻璃罐或塑料管中准备好的 4% PFA 溶液中。修正24小时在4摄氏度与柔和摇摆。
- 要在固定后长期储存样品, 请用 pbs (3 x 20 分钟 RT) 和甲醇在增加的甲醇系列 (1x 30%, 1x 50%, 1x 70%, 2x 100% 甲醇在 PBS 中, 每20分钟) 进行洗涤。
- 储存在100% 甲醇在-20 摄氏度。否则, 使用 PBS 洗涤后, 直接进行骨染色或其他分析。
- 用于固定鳍和/或头骨准备4% 多聚甲醛 (PFA) 在 PBS 和冻结在-20 °c 储存。在 PBS 中使用新鲜制备的 4% PFA, 或在使用前解冻所需的用量。或者, 可以使用 PBS 中的 2% PFA。
-
骨染色技术 I (茜素红染色)
注意: 此染色是根据 van Eeden et 等199617和沃克 & Kimmel 200718与修改执行。- 在成人鳍或头骨上执行茜素红色染色, 收获和修复组织如5.1 节所述。
- 如果样品在-20 摄氏度的甲醇中储存, 则通过在 pbs 中做一个逆甲醇系列 (70%、50% 和 30%, 每 1x20 min), 用 pbs 洗涤两次20分钟。用去离子水清洗样品至少5分钟。
- 要做在头骨的茜素红色染色, 治疗样品与50毫克/毫升胰蛋白酶在30% 饱和 Na2B4O7在室温过夜。这段时间的岩石样本。在30% 饱和 Na2B4O7溶液中冲洗样品。用去离子水洗涤样品2次, 每次5分钟。此步骤不执行翅片组织。
- 添加茜素红溶液 (B 部分: 0.5% 茜素红 S 粉, 10% 在去离子水中的甘油), 在 RT 孵育期间摇动样品. 检查1、2、4 h 或过夜后的染色。
- 要清除样品, 请将其减少1% 氢氧化钾: 甘油系列 (3:1 隔夜, 1:1 过夜, 1:3 过夜)。
- 将样品储存在0.1% 氢氧化钾的1:1 溶液中: 80% 甘油, 并安装80% 甘油进行成像。
注: 对于联合阿辛蓝/茜素红色染色处理样品与阿辛蓝色染色溶液 (a 部分: 最终0.02% 阿辛蓝色, 50 毫米氯化镁2, 70% 乙醇) 在 RT 后补液 (部分 5.2.2) 为 2 h. 用递减乙醇系列治疗翅片在50毫米氯化镁2 (70%, 50%, 30%, 每 1x 15 分钟) 和洗涤他们至少 1h (3x 20 分钟) 在去离子水。继续与茜素红色染色 (第5.2 节)。
-
骨染色技术 II (calcein 染色)
注意: 为了检测翅片骨折和颅骨损伤中的钙沉积, 活鱼在含有 calcein 的溶液中孵育。- 在去离子水 (pH 7.5) 中准备所需量的 0.2% calcein。确保 pH 值为中性。使用 1 M 氢氧化钠调节 pH 值。
- 在覆盖铝箔的玻璃烧杯中, 在100毫升的 calcein 溶液中同时孵育3只斑马鱼20分钟。
- 用鱼水把斑马鱼转移到烧杯里。让他们在用鱼水把它们转移到新烧杯之前先游泳。让他们在这个新烧杯里游泳20分钟洗。拍照 (参见第5.4 节)。
-
斑马鱼的活体成像
- 使用这种方法获得再生骨组织的图像, 如在鳍或头骨在整个实验中不牺牲斑马鱼。根据第2.1 节麻醉斑马鱼。
- 要获取鳍状再生的图像, 将麻醉斑马鱼转移到琼脂糖涂层的培养皿上 (参见第2.2.1 和图 1B)。
- 要获得再生颅骨的图像, 请将斑马鱼直立放置在海绵中 (图 1D), 或将其放置在已准备好保存斑马鱼树干的琼脂糖包衣皿中。
- 使用 stereomicroscopic 设置在所需的放大倍率和分辨率下获取图像。
- 将斑马鱼送回含有新鲜或含鱼水的容器中。
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Representative Results
本协议在斑马鱼鳍和颅骨10、11、16的再生过程中反复使用, 以诱导快速骨形成。结合泼尼松的方法, 研究了泼尼松在骨再生中的作用。例如, 可以对再生过程中的骨形成和成矿作用进行研究。泼尼松, 作为其他糖皮质激素19,20, 导致全面抑制鳍再生, 包括骨形成, 在固定的尾鳍组织的茜素红色染色检测 (图 3A)。同样, 泼尼松对 (颅骨) 颅骨损伤闭合有延缓作用, 这可以用茜素红 (图 3B) 或体内calcein 染色来说明。此外, 泼尼松在翅片和颅骨组织中具有深刻的抗炎作用, 在单核细胞/巨噬细胞谱系中触发凋亡。减少巨噬细胞数可通过免疫组化检测冷冻组织切片,例如,在转基因mpeg1中使用抗 mcherry 抗体: mcherry 斑马鱼 (图 3C)10,21.同样, 内骨骼 (如椎骨) 的其他细胞类型的数量、分布、增殖和凋亡都可以通过免疫组化的帮助进行分析。
图 1: 在斑马鱼中进行的程序.(A) 用手术刀切除麻醉斑马鱼的尾鳍 (截肢)。红色虚线表示截肢级别。(B) 麻醉斑马鱼在体视显微镜下用注射针进行翅片射线断裂。这条鱼在手术过程中躺在琼脂糖涂层的培养皿上。琼脂糖涂层培养皿也用于获取斑马鱼鳍在再生或骨折修复过程中的图像。(C) 在体视显微镜下 microdrill 的帮助下, 在 anaestetized 斑马鱼中进行 calvariae (颅骨损伤) 的钻孔引流。(D) 损伤后再生颅骨的影像采集。麻醉斑马鱼直立放置在海绵中, 图像在体视显微镜的帮助下获得。培养皿中充满了含有 0.02% MS-222 的鱼水。(E) 在含有鱼水的泼尼松或 DMSO 中孵化斑马鱼。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 0 小时损伤后的显微实时观察).(A) 截尾翅片。刻度条 = 200 µm (B) 断裂翅片射线。该断裂由红色箭头表示。刻度条 = 100 µm (C) Trepanated 头骨。受伤部位由白色箭头表示。比例尺 = 500 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 对成人斑马鱼进行泼尼松治疗的代表性结果.(A) 茜素红色染色鳍在截肢 (dpa) 和治疗天数 (dt) 后14天再生。泼尼松处理翅片再生较短 (未显示), 并检测到茜素红阳性骨基质的较小域。比例尺 = 500 µm (B) 茜素红色染色头骨7天后受伤 (dpi) 和 dt。缩放栏 = 100 µm。此图已使用权限10进行了修改。(C) 经治疗的 (泼尼松) 和未经处理的 (DMSO) tg (mpeg1: mCherry) x tg (osterix: nGFP) 转基因报告鱼的未受伤颅骨和脑组织的适于视图, 其中巨噬细胞 (先天免疫细胞) 标记为红色21和骨形成成骨细胞被标记为绿色22。在泼尼松治疗斑马鱼的巨噬细胞数量显著下降。免疫组化是按照 Geurtzen等的描述进行的。10. 原子核以蓝色 (DAPI) 标记。比例栏 = 20 µm: 明亮的田野, epid: 表皮, bn: 骨头。此图已使用权限10进行了修改。请点击这里查看这个数字的更大版本.
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Discussion
斑马鱼在骨骼研究中被证明是有用的在许多方面。所选突变体模仿人类疾病的某些方面, 如成骨不全症或骨关节炎23、24、25、26、27和幼虫以及鳞片被用来在小分子筛中识别骨合成代谢化合物7,28,29。在临床实践中使用的药物的斑马鱼的治疗, 更适合研究假定的副作用, 例如在骨组织。在这种情况下, 快速再生骨的存在有利于研究药物诱发骨缺损的基本机制。在这里, 我们提出一个协议, 其中药物治疗与糖皮质激素泼尼松, 一种常用的抗炎药物, 在骨组织的不良影响, 结合成人骨再生机制。该协议已成功用于诱导斑马鱼再生组织中的免疫抑制和骨抑制效应, 也可用于研究泼尼松和其他药物在成人组织 (如脊柱) 中的影响。在斑马鱼进行鳍状或颅骨再生时, 应考虑以下细节。
损伤检测的重现性
在翅片再生过程中, 再生速度 (即翅片组织, 包括骨, 每时间单位的再生) 很大程度上取决于被切除13的鳍组织的数量。为了避免翅片再生的不必要的变化, 确保在所有标本中始终切除等量的翅片组织。
通过将注射针略微推入选定骨翅片的中心, 进行骨翅片射线骨折的执行。由于骨鳍射线由2个对立的 hemirays 组成, 所用的压力量决定了只有一个或两个 hemirays 是否断裂。我们更倾向于将低压用于骨折只有一个 hemiray, 因为两个 hemirays 的断裂倾向于破坏鳍射线的稳定, 因此在第二天可能分离。
颅骨的颅骨损伤应谨慎进行 microdrilling。如果对大脑造成伤害 (即小脑) 姿势和城运会的缺陷将变得明显的标本15的不规则的游泳。有小脑损伤的斑马鱼可能表现出对药物治疗的不良反应, 不应用于研究骨再生。
关于药物治疗的考虑因素
为了在成人斑马鱼中产生一致的免疫抑制和抗再生作用, 我们在鱼水中使用剂量为50µM 泼尼松。在幼虫和成人斑马鱼的初始剂量反应实验中, 我们确定了这一剂量。因此, 应进行剂量反应实验, 以确定可能应用的其他免疫抑制剂的所需剂量。对于成人, 我们建议将这些初始实验与鳍再生机制相结合, 因为鳍再生长度是一种高度灵敏且易于检测的组织改变读数。
免疫抑制治疗可将标本治疗为微生物感染。因此, 在含蒸压水的蒸压烧杯中单壳是很重要的。虽然这些条件是更繁琐的执行和不是无菌的, 他们帮助减少感染在治疗斑马鱼。我们没有预处理 (' 消毒 ') 卤蛋。然而, 这可能是一个额外的措施, 以防止在斑马鱼的感染, 如果必要的话。此外, 在使用前, 可以在鱼水中添加诸如亚甲基蓝 (1%) 等防腐物质。
与泼尼松的试验, 无论是短期的还是长期的, 都需要鱼水的每日变化。我们对成人斑马鱼进行了长达8周的治疗。对大量的个体进行如此长时间的治疗会导致某种实验性的 "负担", 并应仔细计划。始终有必要量的蒸压鱼水和玻璃器皿是至关重要的。虽然这尚未在斑马鱼 (据我们的知识) 测试, 植入的缓释丸的兴趣药物可能是一个有价值的替代长期药物暴露在斑马鱼。
转基因斑马鱼的分析
本文提出了用茜素红和 calcein 染色法对骨组织矿化/钙化进行染色的2种方法。此外, 我们还展示了如何在体视显微镜的帮助下,在体内影像再生鳍和颅骨组织。后者的技术是非常有用的, 如果转基因斑马鱼报告的数量或活动的选定细胞, 如成骨干细胞或免疫细胞, 正在成像。例如, 在牺牲受伤和泼尼松治疗的斑马鱼进行茜素红染色之前, 可以对鳍再生或 trepanated 颅骨进行拍照, 以寻找骨形成成骨细胞的存在、数量和活性。转基因记者行 Tg (osterix: nGFP)22。同样, 在一天内发生的表皮伤口闭合可以在转基因鱼中形象化, 在表皮组织中表达荧光基团。此外, 在损伤部位 (或在泼尼松治疗的个体中不存在) 中的免疫细胞积聚可以很容易地通过配备所需光源和过滤器的体视显微镜进行监测。
总之, 这里提供的协议可以用来研究免疫抑制剂和其他药物在系统管理后, 在鳍或头骨正在进行骨再生的斑马鱼的作用。这将是有用的描述的发病机制, 并研究成功的骨再生的机理。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了德累斯顿再生疗法中心 ("斑马鱼作为一种模型来解开糖皮质激素引起的骨质流失的机制") 的资助, 另外还获得了德意志科技 (Transregio 67, 项目387653785) 至 FK。我们非常感谢1月卡斯林和 Avinash Chekuru 为他们的指导和协助钻孔引流 calvariae 和骨折的骨鳍射线。实验由 KG 和 FK 设计、执行和分析。FK 写了手稿。我们还要感谢卡瑞安兰伯特, 妮可 Cudak, 和其他成员的钮和品牌实验室的技术援助和讨论。我们也感谢玛丽卡费舍尔和依奇塔·福勒·弗兰科娃米希林为优秀的鱼护理和亨利埃特瞪大钮和乔希为校对手稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3 mm x 13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
References
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