Summary
Her beskriver vi 3 voksne zebrafisk skade modeller og deres kombinerede anvendelse med immunosuppressiv behandling. Vi vejlede om billeddannelse af regenererende væv og afsløre knoglemineralisering deri.
Abstract
Zebrafisk kan regenerere forskellige organer, herunder vedhæng (finner) efter amputation. Dette indebærer regeneration af knogle, som regrows inden for omkring to uger efter skaden. Desuden zebrafisk er stand til at helbrede ben hurtigt efter trepanation af kraniet, og reparere frakturer, der nemt kan indføres i zebrafisk knoklet fin stråler. Disse skade assays repræsenterer muligt eksperimentelle paradigmer at teste effekten af administreret medicin på hurtigt danner knogle. Her, beskriver vi brugen af disse 3 skade modeller og deres kombinerede anvendelse med systemisk glukokortikoid behandling, som udøver knogle hæmmende og immunosuppressive effekter. Vi leverer en arbejdsproces til at forberede immunosuppressiv behandling i voksen zebrafisk, illustrerer, hvordan du udføre fin amputation, trepanation af calvarial knogler, og fin frakturer, og beskrive, hvordan brugen af glukokortikoider påvirker begge knogler danner osteoblaster og celler af monocyt/makrofag afstamning som del af medfødt immunitet i knoglevæv.
Introduction
Zebrafisk repræsenterer en kraftfuld dyremodel til at studere hvirveldyr udvikling og sygdom. Dette er at de er små dyr, som yngler meget godt og at deres genom er fuldt sekventeret og imødekommenhed over for manipulation1. Andre fordele omfatter muligheden for at udføre fortsatte live imaging på forskellige stadier, herunder i vivo billeddannelse af voksen zebrafisk2, og evnen til at udføre høj overførselshastighed drug skærme i zebrafisk larver3. Desuden zebrafisk besidder en høj regenerative kapacitet i en række organer og væv, herunder knogler, og dermed tjene som et nyttigt system til at studere skelet sygdomme og reparere4,5.
Glukokortikoid-induceret osteoporose (GIO) er en sygdom, der skyldes langvarig behandling med glukokortikoider, for eksempel i forbindelse med autoimmune sygdom behandling såsom astma eller leddegigt. GIO udvikler sig i ca. 30% af glukokortikoid-behandlede patienter og repræsenterer en større sundhed spørgsmål6; Det er derfor vigtigt at undersøge virkningen af immunosuppression på knoglevæv i stor detalje. I de seneste år er blevet udviklet en række forskellige zebrafisk modeller beskæftiger sig med patogenesen af GIO. Glukokortikoid-medieret knogletab er blevet induceret i zebrafisk larver, for eksempel, som førte til identifikation af modsatrettede forbindelser øge knoglemasse i et stof skærmen7. Derudover glukokortikoid induceret knogle hæmmende effekter har været efterlignede i zebrafisk skalerer både in vitro- og i vivo8,9. Disse analyser er meget overbevisende tilgange, især når det kommer til identifikation af roman immunosuppressive og knogle anabolske stoffer. Men de kun delvist tages hensyn til endoskeleton og ikke er blevet udført i forbindelse med regenerativ. Således, de ikke tillader undersøgelse af glukokortikoid-medierede virkninger under hurtige former for voksne, regenerativ knogledannelse.
Vi præsenterer her, en protokol, der gør det muligt for forskere at studere glukokortikoid-medierede virkninger på voksen zebrafisk knogler gennemgår regenerering. Skade modeller omfatter delvis amputation af zebrafisk halefinnen, trepanation af kraniet, samt oprettelsen af fin ray frakturer (figur 1A-1 C), og kombineres med glukokortikoid eksponering via inkubation (figur 1E ). Vi har for nylig brugt en del af denne protokol til at beskrive konsekvenserne af eksponering for Prednisolon, et af almindeligt ordineret kortikosteroid lægemidler, på voksen zebrafisk regenererende fin og kraniet ben10. I zebrafisk fører Prednisolon administration til nedsat osteoblastdannelse spredning, ufuldstændige osteoblastdannelse differentiering og hurtig induktion af apoptose i monocyt/makrofag lineage10. I denne protokol beskrive vi også hvordan frakturer kan indføres i enkelt knoklet fin ray segmenter11, da denne tilgang kan være nyttig, når man studerer glukokortikoid-medierede virkninger på knogle forekommende under fraktur reparation. De metoder, der præsenteres her vil bidrage til yderligere adresse underliggende glukokortikoid virkningsmekanismer i hurtigt regenererende knogle og kan også være ansat i andre indstillinger af systemisk drug administration inden for rammerne af zebrafisk væv revitalisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der beskrives her blev godkendt af Landesdirektion Dresden (tillade numre: AZ 24D-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).
1. forberedelse af materialer og løsninger
Bemærk: Prednisolon, ligesom andre glukokortikoider, fører til immunosuppression. Således skal der træffes forholdsregler til at forhindre infektion i behandlede dyr under eksperimentet. Herom, autoklave glas ware og 'fish vand' (dvs. det vand, der bruges til bageste voksen zebrafisk) før du starter eksperimentet.
- Beregne antallet af zebrafisk anvendes i forsøget. Sørg for at medtage de personer, der tjener som kontrol.
- Autoklave 600 mL glas bægre, der er dækket med aluminiumsfolie med autoklave tape. Zebrafisk vil blive behandlet individuelt, således 1 glas bægerglas kræves pr. zebrafisk.
- Beregne mængden af fiskevand der er nødvendig for eksperimentet. 300 mL er påkrævet per person per dag. Tage hensyn til varigheden af forsøget (f.eks. 1 uge-7 dage).
- Fyld glasflasker med fiskevand, lukker dem og autoklave flasker med autoklave tape. Ideelt set, bruge 2 L flasker, men andre flasker som 1 L og 5 L kan bruges som godt.
Bemærk: Hvis eksperimenter er lang (f.eks. 4 uger/28 dage) og glasflasker er begrænset, så sørg for at forberede mindst flere dage ad gangen flasker og gentage processen (1,3 til 1,4) hele eksperimentet. - Forberede en Prednisolon stamopløsning af steril-filtreret 100 mM Prednisolon i dimethylsulfoxide (DMSO). Fryse bestanden i 1 mL eller 2 mL microcentrifuge tube delprøver.
Forsigtig: Altid bære beskyttende tøj når arbejder med Prednisolon (beskyttende handsker, beskyttelsesbriller, laboratoriekittel). - På den første dag i forsøget, forberede inkubation løsninger med Prednisolon og DMSO, henholdsvis. Med henblik herpå, tø det krævede beløb på 100 mM Prednisolon stamopløsning og tilføje Prednisolon til autoklaveres fiskevand i en endelig koncentration på 50 µM.
- For kontrol behandlinger, skal du tilføje de tilsvarende volumen af DMSO til autoklaveres fiskevand. Som et eksempel, for at producere 2 L Prednisolon indeholdende fiskevand, tilsættes 1 mL 100 mM Prednisolon materiel til 2 L fiskevand. I en anden 2 L flaske fiskevand, der tilsættes 1 mL DMSO, tilsvarende.
- Arbejde i et passende sted, der er udpeget til at udføre lægemiddelsbehandlinger, ideelt i et rum på 27 ° C.
2. generation af skader i zebrafisk finner
Bemærk: For at såre knogle i zebrafisk finner, udføre resektion af fin (amputation, normalt i halefinnen) eller fraktur individuelle knoklet fin stråler (fraktur model). Herpå anaesthetize voksen zebrafisk først.
- Amputation
- For at anaesthetize voksen zebrafisk, forberede en 100 mm diameter petriskål 0,02 vægtprocent MS-222 (Ethyl-3-aminobenzoat methanesulfonate) i fiskevand (dette vand ikke behøver at være autoklaveres).
- Overføre en zebrafisk ad gangen til MS-222 indeholdende petriskål ved hjælp af en fisk netto og inkuberes det indtil det ligger på sin side uden bevægelse og reagerer ikke for at røre. Test den sidstnævnte ved at røre gatfinnen med stumpe pincet.
- Vent indtil niveau 4 af anæstesi er nået, som er det relevante niveau for fin resektion12. På dette stadium, opercular bevægelse er faldt, muskeltonus er tabt og fisk bevæger sig ikke på touch12.
- Tage stumpe pincet og overføre det bedøvet zebrafisk omhyggeligt til inversed låget af 100 mm petriskål. Sted zebrafisk på sin laterale side. Sørg for zebrafisk altid ligge i samme retning, for eksempel på deres rigtige kroppen side. Med en skalpel eller et barberblad, resect 50% af fin (figur 1A, 2A).
Bemærk: Hastigheden af zebrafisk fin regenerering afhænger af mængden af resektion fin tissue, dvs, den mere fin væv er resektion, jo hurtigere fin regenererer13. Således, for at minimere variationer i fin regenerering Sørg for at altid resect fin på samme niveau i alle zebrafisk. - Overføre den tilskadekomne zebrafisk til en autoklaveres glas bægerglas som indeholder 300 mL af prednisolon eller DMSO indeholdende autoklaveres fiskevand. Bægerglasset glas dækkes med alufolie at undgå udslip af zebrafisk.
- Gentag trin 2.1.2 til 2.1.3, indtil det nødvendige antal zebrafisk for eksperimentet er nået.
- For at anaesthetize voksen zebrafisk, forberede en 100 mm diameter petriskål 0,02 vægtprocent MS-222 (Ethyl-3-aminobenzoat methanesulfonate) i fiskevand (dette vand ikke behøver at være autoklaveres).
- Fin fraktur
- Forberede en Agarosen-belagt 100 mm petriskål ved at opvarme en 2% Agarosen løsning i fiskevand eller E3 (embryo media 3, 50 mM natriumchlorid, 0,17 mM kaliumchlorid, calciumchlorid 0,33 mM, 0,33 mM magnesium sulfat). Omhyggeligt Hæld ca 10-15 mL af opløsningen i petriskålen. Bunden af skålen bør være fuldstændig dækket. Lad Agarosen størkne.
- Anaesthetize zebrafisk, som beskrevet i punkt 2.1.
- Tage stumpe pincet og overføre det bedøvet zebrafisk omhyggeligt til Agarosen-belagt 100 mm petriskål. Sted zebrafisk på sin laterale side. Mikroskopet dissektion sprede halefinnen helt for at være i stand til at identificere forskellige knoklet fin stråler og fin ray segmenter. Sørg for zebrafisk altid ligge i samme retning, for eksempel på deres rigtige kroppen side.
- Med en indsprøjtning nål (0,3 mm x 13 mm) indføre en fraktur i midten af en knoklet fin ray segment (figur 1B). For at gøre dette, er nålen skubbet lidt ind på segmentet, indtil en knæk vises (pil i figur 2B). Mens blide tryk fører til fraktur af kun én af de to modsatrettede hemirays stærkere vil pres føre til fraktur af begge hemiray segmenter.
- Ikke indføre for mange frakturer i finner, da dette vil høj grad forringe stabiliteten af fin. Som et forslag, anvende frakturer kun i 3 til 5 fin stråler.
- Altid producere frakturer i tilsvarende segmenter på tværs af forskellige fin stråler og zebrafisk, for eksempel i rygfinnen stråler 3, 7 (eller 8), og ventrale fin ray 3. Proksimalt-distalt er for fraktur ideelle på 3 segmenter proksimalt for fin stråler bifurcation punkt 11.
- Overføre den tilskadekomne zebrafisk til en autoklaveres glas bægerglas som indeholder 300 mL af prednisolon eller DMSO indeholdende autoklaveres fiskevand. Bægerglasset glas dækkes med alufolie at undgå udslip af zebrafisk.
- Gentag trin 2.2.2 til 2.2.5, indtil det nødvendige antal zebrafisk for eksperimentet er nået.
3. generation af Calvarial kranium skader (Trepanation)
NOTE: Calvariae i zebrafisk er homologe til calvarial knogler i pattedyr. Således, disse exoskeletal knogler14 repræsenterer et væv af særlig interesse, når man studerer patogenesen af GIO. For at såre kraniet, udføres trepanation ved at bore et hul i Os frontale og/eller Os parietale (figur 1 c, 2 C) ved hjælp af en microdrill11.
- Anaesthetize zebrafisk ifølge punkt 2.1.
- Holde den bedøvede zebrafisk oprejst med pincet, så de calvarial knogler er godt synlige under en dissektion mikroskop fra oven (figur 1 c).
- Find de roterende microdrill på midten af frontal knoglen (Os frontale) og røre knoglen. Producerede hullet er på størrelse med microdrill burr (500 µm, figur 2 c, figur 3B).
Bemærk: Sørg for at ikke flytte microdrill sideværts mens der producerer skaden. Også stoppe straks når modstanden i knoglen pludselig falder. Bore ikke nogen yderligere, ellers hjernen bliver beskadiget 15. - Overføre den tilskadekomne zebrafisk til et bur fyldt med fiskevand indtil den fuldt genindvinder fra anæstesi. Se det omhyggeligt.
- Overføre den tilskadekomne zebrafisk til en fiskevand plus prednisolon eller DMSO indeholdende glas bægerglas.
4. behandling af zebrafisk under inkubation
Bemærk: Under anvendelse af Prednisolon/DMSO, det stof, som indeholder fiskevand savn at blive forandrede dagligt, og zebrafisk skal fodres regelmæssigt.
- Vandskift
- At udveksle fiskevand, tø 100 mM Prednisolon lager og forberede den nødvendige mængde af 50 µM Prednisolon i autoklaveres fisk vand friske hver dag i behandlingsperioden. Forberede DMSO, som indeholder fiskevand til kontrol zebrafisk i overensstemmelse hermed.
- Tage et glas bægerglas indeholdende en enkelt opstaldet zebrafisk i sin inkubation løsning og overføre den løsning, herunder zebrafisk i en passende beholder, for eksempel en tidsmæssig boliger bur.
Bemærk: Altid bruge separate midlertidige beholdere til prednisolon og DMSO behandlet zebrafisk, henholdsvis, for at sikre DMSO kontrol zebrafisk ikke får eksponeret til prednisolon og vice versa. - Refill glas bægerglas med friske stof indeholdende fiskevand (300 mL).
- Overføre zebrafisk fra de mellemliggende beholder til glas bægerglas indeholdende frisk inkubation løsning ved hjælp af en fisk netto. Sætte tilbage folie for at undgå udslip af zebrafisk.
- Hvis tidspunktet for eksperimentet overstiger 2 uger, udveksle glas bægerglas.
- Fodring
- Under korte behandlinger (for op til 2 dage) må ikke fodre zebrafisk. Under længere eksperimenter, feed zebrafisk. Tag særlig omhu for at undgå forurening af inkubation løsning. Således fodre med Artemia ssp. snarere end med flagefoder og kun på hver anden dag.
Bemærk: Artemia bruges regelmæssigt til at fodre unge zebrafisk, og bør være tilgængelige i zebrafisk haltering enhed.- Ca 2 timer før fiskevand er udvekslet, feed zebrafisk med Artemia ssp i deres glas bægerglas. At gøre det, bruge en plastik pipette og feed 0,5 til 1 mL af skraveret Artemia pr. glas bægerglas.
- Vente for 2 h og udveksle inkubation løsning med friske stof indeholdende fiskevand efter punkt 4.1.
- Under korte behandlinger (for op til 2 dage) må ikke fodre zebrafisk. Under længere eksperimenter, feed zebrafisk. Tag særlig omhu for at undgå forurening af inkubation løsning. Således fodre med Artemia ssp. snarere end med flagefoder og kun på hver anden dag.
5. analyser af prøver
Bemærk: Efter inkubation af tilskadekomne zebrafisk i Prednisolon og DMSO, som indeholder fiskevand, henholdsvis, enten udføre knogle mineralisering/forkalkning analyser (5.1 til 5.3) eller udføre live imaging af zebrafisk mikroskopet dissektion (5.4) 10,11,16. Bruge live imaging til at bestemme fin regenerere længde og til at opdage forskelle i reporter gen expression i transgene zebrafisk.
-
Fiksering af væv af interesse
- Til fiksation af finner og/eller kranier forberede 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS og fryse ved-20 ° C til opbevaring. Der benyttes frisk fremstillede 4% PFA i PBS eller tø den nødvendige mængde før brug. Alternativt, 2% PFA i PBS kan bruges.
Forsigtig: PFA er giftigt og skal håndteres forsigtigt under et stinkskab. Bær beskyttende tøj. - Til fiksation af finner forberede en lille petriskål (f.eks. 30 mm) med kold 4% PFA i PBS, og sørg for, at bunden af skålen er fuldt dækket. Til fiksation af kranier, forberede en lille glaskrukke med låg eller en tube med kold 4% PFA i PBS.
Forsigtig: Håndtag PFA indeholdende løsninger kun under stinkskab, da det er giftigt. Bær beskyttende tøj. - Høste væv af interesse.
- For at høste regenererende fin væv eller finner med frakturer anaesthetize zebrafisk ifølge afsnit 2.1 eller aflive zebrafisk efter punkt 5.1.5.
- Overføre de bedøvet zebrafisk til låget på en petriskål. Ved hjælp af en skalpel eller barberblad, høste fin regenerere. Sørg for at medtage stump væv i regenererende finner for at lette håndteringen af de høstede væv.
- Fix finner lejlighed i PFA indeholdende petriskål ved 4 ° C natten over. Flad fiksering undgår curling op af fin væv under fiksering.
- For at fastsætte flad, grab fin væv med et fint pincet på den dorsale eller ventrale kant af stumpen og fordybe den i opløsningen fiksering. Grab den modsatte kant af stumpen med en anden fint pincet og lidt trykkes væv på bunden af skålen.
- Hold for 10 til 20 s før frigivelsen. Fin væv bør ikke krølle op længere. Hvis det sker, skal du gentage.
- Aflive zebrafisk for at høste sårede kraniet væv. Forberede en 100 mm diameter petriskål 0,1 vægtprocent MS-222 i fiskevand. Overføre en zebrafisk ad gangen til MS-222 indeholdende petriskål ved hjælp af et fiskenet. Når niveau 6 af anæstesi (medullær kollaps) nås vente mindst 10 min. for at forsikre død af modellen12.
- Ved hjælp af en skalpel skæres ud i hovedet plus en lille kuffert væv fra resten af kroppen. Fordybe den høstede væv i den forberedte 4% PFA løsning i glas eller plastik rør. Rettelse i 24 timer ved 4 ° C med blid vuggende.
- For at gemme prøver langsigtede efter fiksering, vask dem med PBS (3 x 20 min. ved RT) og methanol-oplevelse i en stigende methanol serie (1 x 30%, 1 x 50%, 1 x 70%, 2 x 100% methanol i PBS for 20 min).
- Gemme dem i 100% methanol ved-20 ° C. Ellers, direkte fortsætte med knogle farvning eller andre analyser efter vask med PBS.
- Til fiksation af finner og/eller kranier forberede 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS og fryse ved-20 ° C til opbevaring. Der benyttes frisk fremstillede 4% PFA i PBS eller tø den nødvendige mængde før brug. Alternativt, 2% PFA i PBS kan bruges.
-
Knogle farvning teknikker jeg (alizarin rød farvning)
Bemærk: Denne farvning er udført efter van Eeden et al. 199617 og Walker & Kimmel 200718 med ændringer.- For at udføre alizarin rød farvning på voksen finner eller kranier, høst og lave væv, som beskrevet i afsnit 5.1.
- Hvis prøverne blev opbevaret i methanol ved-20 ° C, rehydrere prøver ved at gøre en invers methanol serie (70%, 50% og 30% i PBS, hver 1 x 20 min) og vaskes to gange 20 min med PBS. Vask prøver for 5 min mindste med deioniseret vand.
- At gøre alizarin rød farvning i kranier, behandle prøver med 50 mg/mL trypsin i 30% mættet Na2B4O7 ved rumtemperatur natten over. Rock prøver i løbet af denne tid. Skyl prøver i 30% mættet Na2B4O7 løsning. Vask prøver med deioniseret vand 2 gange for 5 min. Dette trin udføres ikke for fin væv.
- Tilføje alizarin rød løsning (del B: 0,5% alizarin rød S pulver, 10% glycerol i ionbyttet vand) og rock prøverne under inkubation ved RT. Check for farvning efter 1, 2, 4 timer eller natten over.
- At rydde prøver behandle dem med en faldende 1% kalium hydroxid: glycerol serie (3:1 overnatning, 1:1 overnatning, 1:3 overnatninger).
- Opbevare prøverne i en 1:1 opløsning af 0,1% kaliumhydroxid: 80% glycerol og montere dem med 80% glycerol til billedbehandling.
Bemærk: For kombinerede Alcian blå/alizarin rød farvning godbid prøver med Alcian blå farvning løsning (del A: endelige 0,02% Alcian blå, 50 mM MgCl2, 70% ethanol) efter rehydrering (punkt 5.2.2) i 2 timer ved RT. godbid finner med en faldende ethanol serie i 50 mM MgCl2 (70%, 50%, 30%, hver 1 x 15 min) og vask deioniseret dem for et minimum af 1 h (3 x 20 min) i vand. Fortsætte med alizarin rød farvning (afsnit 5.2).
-
Knogle farvning teknikker II (calcein farvning)
Bemærk: For at opdage calcium deposition i fin frakturer og kraniet skader, levende fisk inkuberes i calcein indeholdende løsning.- Forbered den nødvendige mængde af 0,2% calcein i ionbyttet vand (pH 7,5). Sørg for, at pH er neutral. Brug 1 M NaOH til at justere pH.
- Inkuber op til 3 zebrafisk samtidig i 100 mL af calcein løsning i 20 min. i et glas bægerglas dækket med aluminiumsfolie.
- Overføre zebrafisk til et bægerglas med fiskevand. Lad dem svømme kort før du overfører dem til en ny bægerglas med fiskevand. Lad dem svømme i denne nye bægerglas i 20 min. til at vaske. Tage billeder (Se afsnit 5.4).
-
Live imaging af zebrafisk
- Brug denne fremgangsmåde til at erhverve billeder af regenererende knoglevæv som i fin eller kraniet gennem hele eksperimentet uden at ofre zebrafisk. Anaesthetize zebrafisk ifølge punkt 2.1.
- For at erhverve billeder af fin regenererer, overføre det bedøvet zebrafisk på en Agarosen-belagt petriskål (Se afsnit 2.2.1 og figur 1B).
- For at erhverve billeder af regenererende kranieknogler, placere zebrafisk oprejst i en svamp (fig. 1 d) eller placere den i et Agarosen-belagte fad, der er udarbejdet til at holde stammen af zebrafisk.
- Erhverve billeder på den ønskede forstørrelse og opløsning ved hjælp af en stereomicroscopic opsætning.
- Returnere zebrafisk en beholder med friske eller lægemiddel indeholdende fiskevand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen præsenteres her er blevet brugt gentagne gange til at fremkalde hurtige knogledannelse under regenerering af zebrafisk fin og kraniet10,11,16. I kombination med metoden præsenteres af Prednisolon administration, kan undersøgelser på prednisolons effekter i knogler regenerering forfølges. Eksempelvis kan gennemføres undersøgelser af knogledannelse og mineralisering i at regenerere. Prednisolon, fører som andre glukokortikoider19,20, til overordnede hæmning af fin regenerering, herunder knogledannelse, som registreres af alizarin rød farvning på fast halefinnen væv (figur 3A). Tilsvarende, Prednisolon har opsættende virkning på (calvarial) kraniet skade lukning, som kan illustreres ved alizarin rød (figur 3B) eller i vivo calcein farvning. Derudover udøver Prednisolon en dyb anti-inflammatorisk effekt i både fin og kraniet væv, ved at udløse apoptose i monocyt/makrofag afstamning. Reduceret makrofag numre kan påvises ved Immunohistokemi på frossen væv dele, fx ved hjælp af en anti-mcherry antistoffer i transgene mpeg1: mCherry zebrafisk (figur 3 c)10,21 . Tilsvarende kan antal, fordeling, spredning og apoptose i andre celletyper interesse både i exo- og endoskeleton (fx ryghvirvler) analyseres ved hjælp af Immunhistokemi.
Figur 1 : Procedurer, der er foretaget i zebrafisk. (A) resektion af halefinnen (amputation) i bedøvet zebrafisk ved hjælp af en skalpel. Den røde stiplede linje angiver amputation. (B) Fin stråle fraktur i bedøvet zebrafisk udføres med en injektion nål under stereomikroskopet. Fisken er æglæggende på en Agarosen-belagt petriskål i proceduren. Agarosen-belagt petriskåle bruges også til at erhverve billeder af zebrafisk finner under regenerering eller fraktur reparation. (C) Trepanation i calvariae (kraniet skade) udført i anaestetized zebrafisk ved hjælp af en microdrill under stereomikroskopet. (D) billed tilegnelse af regenererende kraniet knogle efter skade. De bedøvet zebrafisk placeres oprejst i en svamp og billeder er opnået ved hjælp af et stereomikroskop. Petriskålen er fyldt med fiskevand indeholdende 0,02% MS-222. (E) inkubation af zebrafisk i prednisolon eller DMSO, som indeholder fiskevand. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Mikroskopiske levende opfattelse af skader på 0 h post skade hpi). (A) Amputated halefinnen. Skalalinjen = 200 µm. (B) Fractured fin ray. Fraktur er angivet med den røde pil. Skalalinjen = 100 µm. (C) Trepanated kranium. Skaden site er angivet af den hvide pilespids. Skalalinjen = 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Repræsentative resultater af Prednisolon behandling i voksen zebrafisk. (A) Alizarin rød farvede fin regenererer på 14 dage post amputation (dpa) og dages behandling (dt). Prednisolon behandlede fin regenererer er kortere (ikke vist), og en mindre domæne alizarin rød positive knoglematrix er opdaget. Skalalinjen = 500 µm. (B) Alizarin rød farvet kranier på 7 dage post skade (dpi) og dt. Skalalinjen = 100 µm. Dette tal er blevet ændret med tilladelse10. (C) Cryosection Se uskadt kraniet og hjernen væv af behandlede (prednisolon) og ubehandlet (DMSO) Tg (mpeg1: mCherry) x Tg (osterix: nGFP) transgene reporter fisk, hvor makrofager (medfødte immun celler) er mærket med rødt 21 og knogledannende osteoblaster er mærket i grøn22. Antallet af makrofager falder betydeligt i Prednisolon behandlet zebrafisk. Immunhistokemi blev udført som beskrevet i Geurtzen et al. 10. kerner er mærket med blåt (DAPI). Skalalinjen = 20 µm. BF: lysfelt, epid: epidermis, bn: knogle. Dette tal er blevet ændret med tilladelse10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafisk har vist sig nyttig i skelet forskning i mange henseender. Valgte mutanter efterligner aspekter af menneskelig sygdom såsom osteogenesis imperfecta eller slidgigt23,24,25,26,27, og larverne samt skalaer der bruges til identificere knogle anabole stoffer i lille molekyle skærme7,28,29. Behandlinger af zebrafisk med lægemidler, der anvendes i klinisk praksis er desuden velegnet til at studere formodede bivirkninger, for eksempel i knoglevæv. I denne sammenhæng er tilstedeværelsen af hurtigt regenererende knogle fordelagtigt at undersøge de underliggende mekanismer af medicin-induceret knogle mangler. Vi præsenterer her, en protokol, hvor behandling med glukokortikoid Prednisolon, et almindeligt anvendte anti-inflammatorisk lægemiddel med bivirkninger i knoglevæv, er kombineret med voksen knogle regenerering regimer. Denne protokol har med succes blevet brugt til at fremkalde immunosuppressive og knogle hæmmende virkning på regenererende væv af zebrafisk, og kan også tilpasses for undersøgelser om virkningen af Prednisolon og andre stoffer i voksent væv såsom rygsøjlen. Følgende oplysninger bør tages hensyn når immunosuppressive lægemiddelsbehandlinger udføres i zebrafisk undergår fin eller kranium regenerering.
Reproducerbarhed af skade assays
Under fin regenerering afhænger regenerering hastighed (dvs. genvækst af fin væv, herunder knogle, pr. tidsenhed) meget af mængden af fin væv, der er ved at blive resektion13. For at undgå uønskede variation af fin regenerering, Sørg for at altid resect tilsvarende mængder af fin væv i alle prøver.
Udførelse af benede fin ray frakturer er udført af lidt skubber en injektion nål på midten af en valgte knoklet fin ray segment. Som knoklet fin stråler består af 2 imod hemirays, bestemmer mængden af pres bruges om kun én eller begge hemirays er brækket. Vi foretrækker at anvende lavtryk til fraktur kun én hemiray, fordi fraktur af begge hemirays tendens til at destabilisere den fin stråle, som følgelig kan frigøre i løbet af de følgende dage.
Calvarial kvæstelser af kraniet af microdrilling bør udføres forsigtigt. Hvis skaden er sket til hjernen (dvs., lillehjernen) postural og bevægelsesadfærd bliver underskud tilsyneladende ved uregelmæssig svømning modellen15. Zebrafisk med cerebellare skade kan vise bivirkninger til narkotikabehandling og bør ikke bruges til at studere knogle regenerering.
Overvejelser vedrørende narkotika behandlinger
For at producere en konsekvent immunosuppressive og anti-regenererende virkning i voksen zebrafisk ansætter vi en dosis på 50 µM Prednisolon i fiskevand. Vi identificeret denne dosis under første dosis-respons forsøgene i larve og voksen zebrafisk. Således bør dosis-respons forsøgene foretages til at identificere den nødvendige dosis af andre immunosuppressive agenter, der kan anvendes. For voksne, anbefaler vi at kombinere disse indledende forsøg med fin regenerering regime, som fin regenerere længde er en meget følsom og let at opdage udlæsning til væv ændringer.
Immunosuppressiv behandling disponerer behandlede prøver at mikrobielle infektioner. Derfor, enkelt boliger i autoklaveres bægre indeholdende autoklaveres fiskevand er vigtigt. Selv om disse betingelser er mere besværlig at udføre ikke og sterile, hjælper de til at minimere infektion i behandlede zebrafisk. Vi ikke forbehandle ('sterilisere') Artemia æg. Men dette kan være en supplerende foranstaltning til at forhindre infektion i zebrafisk, hvis nødvendigt. Derudover kan antiseptisk stoffer såsom methylenblaat (1%) tilføjes for at fiske vand før brug.
Eksperimenter med Prednisolon, både kort- og langsigtede, kræve daglige ændringer af fiskevand. Vi har behandlet voksen zebrafisk for op til 8 uger. Behandling af et stort antal enkeltpersoner for så lang tid kan føre til en vis eksperimentelle "byrde", og bør planlægges omhyggeligt. Det er afgørende for altid at have de nødvendige mængder af autoklaveres fisk vand og glas ware klar. Selv om dette ikke er blevet testet i zebrafisk (til vores viden), kan implantation af langsom frigivelse pellets for narkotika af interesse repræsentere et værdifuldt alternativ til lang sigt stof eksponering i zebrafisk.
Analyser i transgene zebrafisk
Vi præsenterer her, 2 metoder til at pletten for mineralisering/forkalkning af knogle væv af alizarin rød og calcein farvning. Derudover viser vi hvordan du billede regenererende fin og kraniet væv i vivo ved hjælp af et stereomikroskop. Den sidstnævnte teknik er meget nyttigt, hvis transgene zebrafisk rapportering antallet eller aktivitet af markerede celler, såsom osteoblaster eller immunceller, er at blive afbildet. For eksempel, før du ofrer såret og Prednisolon-behandlede zebrafisk at udføre alizarin rød farvning, fin regenererer eller trepanated kranier reparation kan være fotograferet for at lede efter tilstedeværelse, antal og aktivitet af knogledannende osteoblaster i linjen transgene reporter Tg (osterix: nGFP)22. Ligeledes kan epidermal sår lukning, som sker inden for en dag, visualiseres i transgene fisk, der giver udtryk for en fluorophore i epidermal væv. Ophobning af immunceller i stedet for skade (eller deres fravær i Prednisolon behandlet personer) kan også, let overvåges med et stereomikroskop udstyret med de nødvendige lyskilde og filtre.
I sum, kan protokollen præsenteres her bruges til at studere virkningerne af immunosuppressive stoffer og andre stoffer efter systemisk indgift i zebrafisk, der befinder sig i knoglen regenerering enten i fin eller kranium. Dette vil være nyttigt at afgrænse patogenesen af GIO og undersøge de underliggende vellykket knogle regenerering mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling af den Center i Regenerative behandlinger Dresden ("zebrafisk som en model til at udrede mekanismerne af glukokortikoid induceret knogletab") og desuden et tilskud af Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, projekt 387653785) til FK. Vi er meget taknemmelige for Jan Kaslin og Avinash Chekuru deres vejledning og bistand på udfører trepanation calvariae og frakturer i knoklet fin stråler. Eksperimenter blev konstrueret, udført og analyseret af KG og FK. FK skrev manuskriptet. Vi vil også gerne takke Katrin Lambert, Nicole Cudak, og andre medlemmer af de Knopf og mærke labs for teknisk bistand og diskussion. Vores tak går også til Marika Fischer og Jitka Michling for fremragende fisk pleje og Henriette Knopf og Josh Currie for korrekturlæsning håndskriftet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3 mm x 13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
- Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Paul, S., Crump, J. G. Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish. Bonekey Reports. 5, 853 (2016).
- Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases. Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).
- den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis. Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- de Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).
- Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale. International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).
- Geurtzen, K., et al. Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues. Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).
- Geurtzen, K., et al. Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull. Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hirasawa, T., Kuratani, S. Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development. Zoological Letters. 1, 2 (2015).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Knopf, F., et al. Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin. Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Oppedal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Spoorendonk, K. M., et al. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- Gioia, R., et al. The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta. Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).
- Fiedler, I. A. K., et al. Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
- Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).
- Hayes, A. J., et al. Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis. PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).
- Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).
- de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).
