Summary
여기, 우리 3 성인 zebrafish 부상 모델 및 면역 억제 약물 치료와 결합 된 그들의 사용을 설명합니다. 우리는 거기에 뼈 강화 작용을 감지 및 조직 재생의 이미징에 지침을 제공 합니다.
Abstract
Zebrafish 절단 후 부속 (핀)를 포함 하 여 다양 한 장기를 다시 생성할 수 있습니다. 이 부상 후 약 2 주 이내 regrows 뼈의 재생을 포함 한다. 또한, zebrafish trepanation는 두개골의 후 뼈를 빠르게 치유 하 고 복구 zebrafish 뼈 탄 미 익 광선에 쉽게 도입 될 수 있는 골절 수 있습니다. 이러한 상해 분석 빠르게 뼈 형성에 관리 약물의 효과 테스트 가능한 실험 패러다임을 나타냅니다. 여기, 우리는 이러한 3 부상 모델의 사용과 뼈 억제 하 고 면역 억제 효과 미치는 조직의 glucocorticoid 치료와 함께 그들의 결합된 사용 설명. 우리 성인 zebrafish에 면역 억제 치료에 대 한 준비, 지 느 러 미 절단, calvarial 뼈와 지 느 러 미 골절의 trepanation 수행 하는 방법을 설명 하 고 스테로이드 제제의 사용에 미치는 두 뼈 형성을 설명 하는 방법에 대 한 워크플로우를 제공 osteoblasts 그리고 뼈 조직에 있는 타고 난 면제의 일부로 monocyte/대 식 세포 계보의 세포.
Introduction
Zebrafish는 척추 개발 및 질병 연구에 강력한 동물 모델을 나타냅니다. 그들은 매우 잘 번 식 하는 작은 동물 및 그들의 게놈은 완전히 시퀀스이 고 조작1의무가 있다는 사실 때문입니다. 다른 장점은 지속적인된 라이브 이미징 vivo에서 화상 진 찰 성인 zebrafish2, 및 높은 처리량 약 스크린 zebrafish 애벌레3에서 수행할 수 있는 능력을 포함 한 여러 단계에서 수행 하는 옵션을 포함 합니다. 또한, zebrafish 장기와 조직, 뼈 등의 다양 한에서 높은 재생 능력을 보유 하 고 따라서 골격 질환을 연구 하 고 수리4,5유용한 시스템 역할.
Glucocorticoid 골다공증 (GIO) 예 천식이 나 류 마티스 관절염과 같은 자가 면역 질환 치료 과정에서 스테로이드 제제와 장기 치료에서 결과 질병 이다. GIO는 glucocorticoid 치료 환자의 약 30%에서 개발 하 고 주요 건강 문제6;를 나타냅니다. 따라서, 그것은 훌륭한 세부 사항에서 뼈 조직에 면역 억제에 미치는 영향을 조사 하는 것이 중요입니다. 최근 몇 년 동안에서 다양 한 GIO의 병 인을 다루는 zebrafish 모델 개발 되었습니다. Glucocorticoid 중재 뼈 손실 zebrafish 애벌레, 예를 들어 마약 화면7뼈 질량을 증가 하는 counteractive 화합물의 식별에 지도에서 유발 되었습니다. 또한, 뼈 glucocorticoid 유발 억제 효과에 유사 되었습니다가지고 zebrafish 비늘 생체 외에서 그리고 vivo에서8,9. 이 분석 실험은 매우 설득력 있는 접근, 그것에 관해서 특히 소설 면역과 뼈 근육 약물의 식별. 그러나, 그들은 부분적으로 endoskeleton 고려 하 고 재생 컨텍스트에서 수행 되지. 따라서, 그들은 성인, 재생 뼈 형성의 빠른 모드 동안 glucocorticoid 중재 효과의 조사를 허용 하지 않습니다.
여기, 선물이 성인 zebrafish 뼈 재생을 겪고 glucocorticoid 중재 효과 공부 하는 연구자를 사용 하는 프로토콜. 부상 모델은 zebrafish 꼬리 지 느 러 미, 지 느 러 미 레이 골절 (그림 1A-1 C)의 창조 뿐만 아니라, 두개골의 trepanation의 부분 절단을 포함 하 고 glucocorticoid 노출을 통해 인큐베이션 (그림 1E와 결합 ). 최근 성인 zebrafish 지 느 러 미와 두개골 뼈10회생에 prednisolone, 일반적으로 된 코르 티 코 스테로이드 약물 중 하나에 노출의 결과 설명 하기 위해이 프로토콜의 일부를 사용 했습니다. Zebrafish에 prednisolone 관리 감소 osteoblast 확산, 불완전 osteoblast 차별화 및 monocyte/대 식 세포 계보10apoptosis의 급속 한 유도 이끌어 낸다. 이 프로토콜에서 우리 또한 설명 어떻게 골절 한 뼈 핀 레이 세그먼트11, 도입 하실 수 있습니다이 방법은 골절 복구 중 발생 하는 뼈에 glucocorticoid 중재 효과 공부를 할 때 유용할 수 있습니다. 여기에 제시 된 방법을 빠르게 뼈 재생에 glucocorticoid 행동의 메커니즘을 기본 추가 주소에 도움이 될 것입니다 그리고 zebrafish 조직 재생의 맥락에서 체계적 약국의 다른 설정에도 사용할 수 있습니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 방법 Landesdirektion 드레스덴에 의해 승인 (허가 번호: AZ 24 D-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).
1입니다. 재료 및 솔루션의 준비
참고: Prednisolone, 다른 스테로이드 제제와 같은 이끌어 낸다 면역 억제. 따라서, 실험 기간 동안 치료 동물에 감염을 방지 하기 위해 예방 조치를가지고 한다. 하이 엔드, 압력솥 유리 도자기 '물 물고기' (즉, 성인 zebrafish 후면에 사용 되는 물) 실험을 시작 하기 전에.
- 실험에 사용 될 zebrafish의 수를 계산 합니다. 개인 컨트롤 역할을 포함 해야 합니다.
- 압력솥 600 mL 유리 커 고압 테이프와 알루미늄 호 일로 덮여 있다. Zebrafish는 개별적으로 처리 됩니다, 그리고 따라서 1 유리 비 커 zebrafish 당 필요 합니다.
- 물고기 물 실험에 필요한 금액을 계산 합니다. 300 mL는 개인과 일 당 필요 합니다. 실험의 길이 고려 (예를 들어, 1 주/7 일).
- 생선 물으로 병을 채우기, 그들 및 고압 오토 클레이 브 테이프와 병. 이상적으로, 2 리터 병을 사용 하지만 1 L 또는 L 5 같은 다른 병 에서도 사용할 수 있습니다.
참고: 실험은 긴 경우 (예를 들어, 4 주/28 일)와 유리 병의 양이 제한, 최소 한 번에 몇 일에 대 한 병을 준비 하 고 실험을 통해 (1.3 1.4) 과정을 반복. - Dimethylsulfoxide (DMSO)에 살 균 필터링 100mm prednisolone의 prednisolone 재고 솔루션을 준비 합니다. 1 mL 또는 2 mL microcentrifuge 튜브 aliquots 재고를 고정 합니다.
주의: 항상 때 의류 착용 보호 협력 prednisolone (보호 장갑, 안전 고글, 실험실 외 투). - 실험의 첫 날, 각각 prednisolone와 DMSO, 부 화 솔루션을 준비 합니다. 이 위해, 100 mM prednisolone 재고 솔루션의 필요한 금액을 녹여 고 50 µ M의 최종 농도에 압력가 물고기 물에 prednisolone을 추가 합니다.
- 대 한 제어 치료 압력가 물고기 물에 DMSO의 해당 볼륨을 추가 합니다. 예를 들어, 2 L prednisolone 포함 물고기 물 생산, 추가 100 mM prednisolone 재고의 1 mL 2 L 물고기 물. 생선 물 2 L 병, 추가 1 mL DMSO, 대응 하 게.
- 27 ° c.에서 이상적으로 약물 치료를 수행 하도록 지정 하는 적절 한 장소에서 작업
2입니다. 제 브라 지 느 러 미에 상해의 세대
참고: zebrafish 지 느 러 미에 뼈 손상, 지 느 러 미 (꼬리 지 느 러 미에 보통 절단)의 절제를 수행 하거나 개별 뼈 탄 미 익 광선 (골절 모델) 골절 합니다. 이 위해 먼저 성인 zebrafish를 anaesthetize.
- 절단
- 100mm 직경 0.02%를 포함 하는 배양 접시 준비 성인 zebrafish, anaesthetize를 물고기 물 (이 물 필요가 없습니다 압력가 마로 소독 될)에서 MS-222 (에틸-3-aminobenzoate methanesulfonate).
- 물고기 그물을 사용 하 여 MS-222 포함 된 배양 접시를 한 번에 하나의 zebrafish를 전송 하 고 운동 없이 그것의 측면에 터치에 응답 하지 않는 때까지 그것을 품 어. 무딘 집게와 항문 지 느 러 미를 만져 후자 테스트 합니다.
- 마 취의 수준 4는 지 느 러 미 절제12에 대 한 적절 한 수준에 도달할 때까지 기다립니다. 이 단계에서 opercular 운동의 속도 감소 하 고 근육 손실 됩니다 물고기 터치12시 이동 하지 않습니다.
- 무뚝뚝한 겸 자 하 고 신중 하 게 100 mm 페 트리 접시의 뚜껑을 쏘아 anaesthetized zebrafish 전송. 그것의 옆에 제 브라를 놓습니다. 예를 들어 자신의 오른쪽 몸 측면에 동일한 방향에 항상 거짓말 zebrafish 있는지 확인 합니다. 메스 또는 면도칼 블레이드, 지 느 러 미 (그림 1A, 2A)의 50%를 resect.
참고: zebrafish 지 느 러 미 재생 속도 절제 지 느 러 미 조직의 금액에 따라, 즉, 더 많은 지 느 러 미 조직 절제는, 빨리는 지 느 러 미13재생성. 따라서, 최소화 하기 위해 지 느 러 미 재생에 변이 항상 모든 zebrafish의 동일한 수준에 지 느 러 미를 resect 있는지 확인 합니다. - 부상된 zebrafish prednisolone 또는 압력가 물고기 물 포함 된 DMSO의 300 mL를 포함 하는 압력가 유리 비 커에 전송. 커버 알루미늄 호 일로 제 브라의 탈출 방지를 유리 비 커.
- 2.1.2 2.1.3 단계를 반복 하 여 실험에 대 한 제 브라의 필요한 수에 도달.
- 100mm 직경 0.02%를 포함 하는 배양 접시 준비 성인 zebrafish, anaesthetize를 물고기 물 (이 물 필요가 없습니다 압력가 마로 소독 될)에서 MS-222 (에틸-3-aminobenzoate methanesulfonate).
- 지 느 러 미 분쇄
- 물고기 물 또는 e 3에서 2 %agarose 용액을가 열 하는 agarose 코팅 100 mm 페 트리 접시를 준비 (배아 미디어 3, 50 m m 염화 나트륨, 염화 칼륨 0.17 m m, 0.33 m m 칼슘 염화 물, 0.33 m m 마그네슘 황산 염). 신중 하 게 페 트리 접시에 솔루션의 대략 10-15 mL를 붓으십시오. 접시의 바닥을 완전히 처리 되어야 합니다. Agarose를 공고히 하자.
- 섹션 2.1에에서 설명 된 대로 제 브라를 anaesthetize.
- 무뚝뚝한 겸 자 고 anaesthetized zebrafish agarose 코팅 100 mm 페 트리 접시를 신중 하 게 전송. 그것의 옆에 제 브라를 놓습니다. 해 부 현미경 아래 완전히 별개 뼈 핀 광선을 식별 하 고 지 느 러 미 레이 세그먼트 수를 꼬리 지 느 러 미를 확산. 예를 들어 자신의 오른쪽 몸 측면에 동일한 방향에 항상 거짓말 zebrafish 있는지 확인 합니다.
- 주사 바늘 (0.3 x 13 mm) 뼈 핀 레이 세그먼트 (그림 1B)의 중심에 골절을 소개 합니다. 이렇게 하려면, 바늘은 밀어 약간 세그먼트에 균열 ( 그림2b에서 화살표)가 나타날 때까지. 부드러운 압력 강한 두 반대 hemirays 중 하나만의 골절로 연결 하는 동안 압력 두 hemiray 세그먼트의 골절 이어질 것입니다.
- 이후이 크게는 지 느 러 미의 안정성에 악영향을 줄 것 이다 너무 많은 지 느 러 미, 골절을 소개 하지 않습니다. 제안, 골절 3 ~ 5 탄 미 익 광선에만 적용 됩니다.
- 항상 다른 지 느 러 미와 제 브라, 느 3, 7 (또는 8)와 복 부 탄 미 익 광선 3에서 예를 통해 골절 해당 세그먼트를 생성 합니다. 골절의 근 위 원심 수준 3 세그먼트 탄 미 익 광선의 분기 지점 11인접에 이상적입니다.
- 부상된 zebrafish prednisolone 또는 압력가 물고기 물 포함 된 DMSO의 300 mL를 포함 하는 압력가 유리 비 커에 전송. 커버 알루미늄 호 일로 제 브라의 탈출 방지를 유리 비 커.
- Zebrafish는 실험에 대 한 필요한 수에 도달 될 때까지 단계 2.2.2 2.2.5을 반복 합니다.
3. Calvarial 두개골 상해 (Trepanation)의 생성
참고: 제 브라에서 calvariae는 포유류에서 calvarial 뼈에 동종. 따라서, 이러한 exoskeletal 뼈14 GIO의 pathogenesis 공부를 할 때 특별 한 관심의 조직을 나타냅니다. 두개골을 다치게 하 trepanation microdrill11의 도움으로 Os 프 론 탈 레 와 Os parietale (그림 1C, 2c) 구멍을 시추에 의해 수행 됩니다.
- 섹션 2.1에 따라 제 브라 anaesthetize
- 마 취 제 브라 직 립 집게와 잡습니다 calvarial 뼈 (그림 1C) 위에서 해 부 현미경 아래에서 잘 볼 수 있습니다.
- 정면 뼈 (Os 프 론 탈 레)의 중앙에 회전 microdrill를 찾아서 뼈를 터치 합니다. 생산된 구멍 microdrill 버 (500 µ m, 그림 2C, 그림 3B)의 크기입니다.
참고:는 microdrill 생산 부상 하면서 옆으로 이동 하지 해야 합니다. 또한 뼈의 저항 갑자기 떨어질 때 즉시 중지 합니다. 더 어떤 드릴 하지 마십시오, 그렇지 않으면 두뇌 손상 된 15됩니다. - 그것은 마 취에서 완전히 복구 될 때까지 물고기 물으로 채워진 케이지를 부상된 zebrafish를 전송 합니다. 신중 하 게 조심.
- 물고기 물 플러스 prednisolone 또는 DMSO 포함 된 유리 비 커에 부상된 zebrafish를 전송 합니다.
4입니다. 외피 동안 Zebrafish의 치료
참고: prednisolone/DMSO의 응용 프로그램, 동안 포함 하는 물고기 물 약 매일, 변경할 수 고 zebrafish 정기적으로 먹이로 해야.
- 물 변화
- 생선 물 교환, 100 mM prednisolone 주식을 녹여 준비 하 50 µ M prednisolone 압력가 물고기의 필요한 양을 치료 기간의 매일 신선한 물. 따라 물고기 물 제어 zebrafish에 대 한 포함 된 DMSO를 준비 합니다.
- 유리 비 커의 인큐베이션 솔루션에서 단일 지 내게 zebrafish를 포함 하 고 적절 한 용기, 예를 들어 임시 주택 감 금 소에는 제 브라를 포함 하는 솔루션을 전송.
참고: 항상 사용 prednisolone과 DMSO에 대 한 별도 임시 컨테이너 처리 zebrafish, 각각, DMSO 제어 zebrafish prednisolone와 반대로 노출 하지 않는 다는 것을 확인 하. - 신선한 약물 물고기 물 (300 mL)에 포함 된 유리 비 커를 리필.
- 중간 컨테이너에서 물고기 그물을 사용 하 여 신선한 부 화 솔루션에 포함 된 유리 비 커는 제 브라를 전송. 다시는 제 브라의 탈출을 방지 하려면 호 일 넣어.
- 실험의 시간 2 주를 초과 하는 경우 유리 비 커를 교환 합니다.
- 수 유
- (최대 2 일)에 대 한 짧은 치료 기간 동안 zebrafish가 급지되지 않습니다. 더 이상 실험 동안 zebrafish 피드. 부 화 솔루션의 오염을 피하기 위해 특별 한 주의 분리 했습니다. 따라서, Artemia ssp. 보다는 오히려 찌 질 음식, 그리고 매초 마다 하루에만 피드.
참고: Artemia 젊은 zebrafish, 피드를 정기적으로 사용 하 고 제 브라 haltering 단위에서 사용할 수 있어야 합니다.- 2 h 대략 그들의 유리 비 커에 Artemia ssp 와 제 브라 먹이 물고기 물이 교환 되기 전에. 이렇게 하려면 플라스틱 피 펫을 사용 하 고 해치 Artemia 솔루션의 0.5 ~ 1 mL 당 유리 비 커 피드.
- 2 시간까지 기다립니다 고 신선한 약물을 포함 하는 섹션 4.1에 따라 물고기 물 부 화 솔루션을 교환 한다.
- (최대 2 일)에 대 한 짧은 치료 기간 동안 zebrafish가 급지되지 않습니다. 더 이상 실험 동안 zebrafish 피드. 부 화 솔루션의 오염을 피하기 위해 특별 한 주의 분리 했습니다. 따라서, Artemia ssp. 보다는 오히려 찌 질 음식, 그리고 매초 마다 하루에만 피드.
5입니다. 샘플의 분석
참고: prednisolone에 DMSO를 포함 하는 물고기 물 부상된 zebrafish의 부 화, 후 각각, 뼈 강화 작용/석 회화 분석 (5.1 5.3) 수행 또는 해 부 현미경 (5.4) zebrafish의 라이브 이미징 수행 10,,1116. 지 느 러 미 재생 길이 확인 하 고 유전자 변형 zebrafish에 리포터 유전자 발현의 차이 감지할 라이브 이미징 사용 합니다.
-
관심의 조직의 고정
- 지 느 러 미 및 두개골의 고정을 위한 PBS에 4 %paraformaldehyde (PFA)를 준비 하 고 저장을 위한-20 ° C에서 동결. 사용 신선한 준비 4% PFA PBS 또는 녹여 사용 하기 전에 필요한 금액에. 또는, 2% PFA PBS에 사용 될 수 있다.
주의: PFA 독성 이며 증기 두건에서 신중 하 게 처리 해야 합니다. 보호복을 착용 하십시오. - 지 느 러 미의 고정을 위한 작은 페 트리 접시를 준비 (예를 들어, 30 m m) 찬 4% PFA PBS에서 접시의 바닥은 완전히 덮여 있는지 확인 하십시오. 두개골의 고정을 위한 뚜껑을 가진 작은 유리 제 단지 또는 찬 4% 튜브 준비 PFA PBS에.
주의: 핸들 PFA 독성 연기 후드만 솔루션에 포함 된. 보호복을 착용 하십시오. - 수확의 조직.
- 지 느 러 미 조직이 나 골절 핀 anaesthetize 섹션 2.1에 따라 zebrafish 재생성 수확 또는 섹션 5.1.5 따라 zebrafish를 안락사.
- 페 트리 접시의 뚜껑을 anaesthetized zebrafish를 전송. 메스 또는 면도칼 블레이드를 사용 하 여 지 느 러 미 재생성을 수확. 그 루터 기 조직 재생성 수확된 조직의 처리를 촉진 하기 위하여 지 느 러 미에 포함 되었는지 확인 합니다.
- 지 느 러 미에 평평 하 게 하룻밤 4 ° C에서 배양 접시를 포함 하는 PFA 수정. 평면 고정 고정 중 지 느 러 미 조직의 컬링 방지 합니다.
- 해결 하려면 평면, 그 루터 기의 등 이나 복 부 가장자리에 1 개의 좋은 집게 핀 조직 잡아 하 고 고정 솔루션에 몰두. 두 번째 좋은 집게와 그 루터 기의 반대 가장자리를 약간 우울 접시의 바닥에 조직.
- 10 ~ 20를 발표 하기 전에 s. 지 느 러 미 조직이 더 이상 컬 하지 해야. 않으면, 반복 합니다.
- 부상된 두개골 조직 수확 하려면 zebrafish를 안락사. 100mm 직경 0.1%를 포함 하는 페 트리 접시를 준비 물고기 물에서 MS-222. 낚시 그물을 사용 하 여 MS-222 포함 된 배양 접시를 한 번에 하나의 zebrafish 전송. 마 취 (골 수 축소)의 레벨 6에 도달 하면 표본12의 죽음을 보장 하기 위해서 적어도 10 분 기다립니다.
- 머리 플러스는 시체의 나머지 부분에서 조금 트렁크 조직을 잘라 메스를 사용 하 여. 유리 용기 나 플라스틱 튜브 준비 4 %PFA 솔루션에서 수확된 조직 담가. 부드러운 락 4 ° C에서 24 h에 대 한 수정.
- 샘플 고정 후 장기 저장을 PBS (RT 3 x 20 분)와 함께 그들을 씻어 및 메탄올-치료 증가 메탄올 시리즈 (1 x 30%, 1 x 50%, 1 x 70%, 20 분에 대 한 PBS에 2 x 100% 메탄올).
- -20 ° c.에 100% 메탄올에서 그들을 저장합니다 그렇지 않으면, 직접 진행 뼈 얼룩 또는 다른 분석 PBS로 세척 후.
- 지 느 러 미 및 두개골의 고정을 위한 PBS에 4 %paraformaldehyde (PFA)를 준비 하 고 저장을 위한-20 ° C에서 동결. 사용 신선한 준비 4% PFA PBS 또는 녹여 사용 하기 전에 필요한 금액에. 또는, 2% PFA PBS에 사용 될 수 있다.
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뼈 얼룩 기법 (알리자린 레드 얼룩) 나
참고:이 얼룩 반 Eeden 외. 199617 및 수정 워커 & Kimmel 200718 에 따라 수행 됩니다.- 알리자린 레드 성인 지 느 러 미 또는 두개골에 얼룩을 수행 하려면 수확 하 고 5.1 섹션에 설명 된 대로 조직 수정.
- 샘플-20 ° C에서의 메탄올에 저장, 역 메탄올 시리즈 (70%, 50%와 30 %PBS, 각 1 x 20 분)를 수행 하 여 샘플을 rehydrate 하 고 PBS 가진 두 번 20 분을 씻어. 이온을 제거 된 물으로 최소 5 분에 대 한 샘플 워시.
- 알리자린 레드 두개골에 얼룩, 30%에서 50 mg/mL의 트립 신으로 샘플을 치료 포화 나2B4O7 실 온에서 하룻밤. 이 시간 동안 록 샘플입니다. 30%에서 린스 샘플 포화 나2B4O7 솔루션. 2 시간 5 분 대 한 이온된 수와 함께 샘플을 씻으십시오. 이 단계는 지 느 러 미 조직에 대 한 수행 되지 않습니다.
- 알리자린 레드 솔루션 (부품 b: 0.5% 붉은 알리자린 S 분말, 이온된 수에 10% 글리세롤)를 추가 하 고 1, 2, 4 h 또는 하룻밤 후 얼룩에 대 한 실시간 검사에서 부 화 하는 동안 샘플을 바위.
- 취소 샘플 감소 1% 칼륨 수산화: 글리세롤 시리즈 (3:1 하룻밤, 하룻밤 사이 1:1, 1:3 하룻밤) 그들을 치료.
- 0.1% 수산화 칼륨의 1:1 솔루션에는 샘플을 저장: 80% 글리세롤 이미징에 대 한 80% 글리세롤과 그들을 탑재.
참고: 결합 Alcian 블루/알리자린 레드 Alcian와 치료 샘플 블루 솔루션 (부품 a: 최종 0.02 %Alcian 블루, 50 mM MgCl2, 70% 에탄올) 재 (단원 5.2.2) 감소 에탄올 시리즈와 실시간 치료 지 느 러 미에 2 h 후 얼룩 얼룩 50 mM MgCl2 (70%, 50%, 30%, 각 1 x 15 분) 및 세척에 최소 1 시간 (3 x 20 분)에 대 한 그들 저온. 알리자린 레드 얼룩 (5.2 단원)으로 진행 합니다.
-
뼈 얼룩 기법 II (calcein 얼룩)
참고: 지 느 러 미 골절 및 두개골 상해에 칼슘 증 착을 감지 하 활 어는 인 큐베이 팅 솔루션을 포함 하는 calcein에.- 이온된 수 (pH 7.5)에 0.2 %calcein 필요한 금액을 준비 합니다. PH가 중립 다는 것을 확인 하십시오. 1 M NaOH를 사용 하 여 pH를 조정.
- 알루미늄 호 일로 덮여 유리 비 커에 20 분에 대 한 calcein 솔루션의 100 mL에 동시에 3 제 브라까지 품 어.
- Zebrafish는 물고기 물으로 비 커를 전송 합니다. 짧게 물고기 물으로 새로운 비 커에 그들을 전송 하기 전에 수영 하자. 씻어 20 분에 대 한이 새로운 비 커에서 수영 하자. (섹션 5.4 참조) 사진을 찍을.
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Zebrafish의 이미징 라이브
- 이 접근을 사용 하 여는 제 브라를 희생 하지 않고 지 느 러 미 또는 실험을 통해 두개골 등 뼈 조직 재생의 이미지. 섹션 2.1에 따라 제 브라 anaesthetize
- 지 느 러 미 생성의 이미지를 수집 하는 agarose 코팅 페 트리 접시 (참조 섹션 2.2.1 및 그림 1B)에 anaesthetized zebrafish 전송.
- 두개골 뼈 재생의 이미지를 수집 하는 제 브라 (그림 1D) 스폰지에 똑바로 배치 하거나는 zebrafish의 트렁크를 준비 된는 agarose 코팅 접시에.
- 원하는 배율 및 stereomicroscopic 설정을 사용 하 여 해상도에서 이미지를 취득 합니다.
- 신선한와 함께 컨테이너 또는 마약 물고기 물을 포함 하는 제 브라를 반환 합니다.
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Representative Results
여기에 제시 된 프로토콜 zebrafish 지 느 러 미와 두개골10,,1116의 재생 과정에서 급속 한 골 형성을 유도 하기 위해 반복적으로 사용 되었습니다. 함께 제시 방법의 prednisolone 관리, 뼈 재생 동안 prednisolone의 효과 대 한 연구를 추구 수 있습니다. 예를 들어 뼈 형성과 재생성에서 강화에 대 한 연구를 수행할 수 있습니다. Prednisolone, 다른 스테로이드 제제19,20, 지 느 러 미 재생, 뼈 형성, 알리자린 붉은 꼬리 지 느 러 미 조직 (그림 3A) 고정에 얼룩에 의해 검출 등의 전반적인 억제 리드. 마찬가지로, prednisolone 알리자린 레드 (그림 3B) 또는 vivo에서 얼룩이 지는 calcein에 의해 설명 될 수 있는 (calvarial) 두개골 상해 폐쇄에 지연 효과가 있다. 또한, prednisolone monocyte/대 식 세포 계보에 있는 apoptosis를 실행 하 여 지 느 러 미와 두개골 조직에 깊은 항 염증 효과를 발휘 한다. 예를 들어, 유전자 변형 mpeg1안티-mcherry 항 체를 사용 하 여 숫자 immunohistochemistry 냉동된 조직에 의해 검출 될 수 있다 감소 된 macrophage 섹션: mCherry zebrafish (그림 3C)10,21 . 마찬가지로, 수, 유통, 확산 및 다른 종류의 세포의 모두는 및 (예를 들어, 척추) endoskeleton apoptosis immunohistochemistry의 도움으로 분석할 수 있습니다.
그림 1 : 절차 zebrafish 실시. 메스의 도움으로 anaesthetized zebrafish에 꼬리 핀 (절단)의 (A) 절제술 빨간색 파선 절단 수준을 나타냅니다. (B) 핀 레이 stereomicroscope에서 주사 바늘으로 실시 anaesthetized zebrafish 골절. 물고기는 agarose 코팅 페 트리 접시에는 절차 동안 누워 있다. Agarose 코팅 접시도 재생 또는 골절 복구 하는 동안 제 브라 지 느 러 미의 이미지를 수집 하는 데 사용 됩니다. Calvariae (두개골 상해)의 (C) Trepanation는 stereomicroscope에서 microdrill의 도움으로 anaestetized 제 브라에서 수행합니다. (D) 두개골 뼈 부상 후 회생의 수집 이미지. Anaesthetized zebrafish 스폰지에 똑바로 배치 되 고 이미지는 stereomicroscope의 도움으로 인수. 0.02%를 포함 하는 물고기 물으로 페 트리 접시 가득 MS-222. (E) prednisolone 또는 물고기 물 포함 된 DMSO zebrafish의 부 화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 0 h 게시물 부상 hpi에서 상해의 미세한 라이브 뷰). (A) Amputated 꼬리 지 느 러 미. 눈금 막대 = 200 µ m. (B) Fractured 지 느 러 미 레이. 골절은 빨간색 화살표로 표시 됩니다. 눈금 막대 = 100 µ m. (C) Trepanated 두개골. 상해 사이트는 흰색 화살촉으로 표시 됩니다. 눈금 막대 = 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 성인 zebrafish에 prednisolone 치료의 대표적인 결과. (A) 알리자린 레드 스테인드 핀 14 일 게시물 절단 (dpa)와 치료 (dt)의 일에서 재생성. Prednisolone 치료 지 느 러 미는 짧은 (표시 되지 않음), 그리고 긍정적인 뼈 매트릭스 감지 알리자린 레드의 더 작은 도메인을 다시 생성 합니다. 눈금 막대 500 µ m. (B) 알리자린 레드 스테인드 두개골 7 일 게시물 부상 (dpi)와 dt =. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림은 권한을10으로 수정 되었습니다. (C) Cryosection 손상 되지 않은 두개골의 보기 및 뇌 조직 치료 (prednisolone)와 치료 (DMSO) 안내 (mpeg1: mCherry) Tg x (osterix: nGFP) 유전자 변형 기자 물고기, 대 식 세포 (타고 난 면역 세포) 빨간색으로 표시 됩니다 21 과 뼈 형성 osteoblasts 녹색22에서 표시 됩니다. 대 식 세포의 수는 크게 치료 prednisolone zebrafish에 삭제합니다. Immunohistochemistry는 Geurtzen 외 에 설명 된 대로 수행한 합니다. 10. 핵 블루 (DAPI)에 표시 됩니다. 눈금 막대 = 20 µ m. BF: 밝은 분야, epid: 표 피, bn: 뼈. 이 그림은 권한을10으로 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Zebrafish는 많은 관계에서 골격 연구에 유용한 입증 했다. 선택 된 돌연변이 모방 골 imperfecta 등 관절염23,,2425,26,27, 인간 질병의 측면 그리고 애벌레 뿐만 아니라 저울에 사용 되 고 있습니다. 작은 분자 스크린7,,2829뼈 근육 강화 화합물을 식별 합니다. Zebrafish 임상 연습에 적용 되는 약물의 치료는 또한 적합 예 뼈 조직에에서 상 상속 역효과 공부 합니다. 이러한 맥락에서 급속 하 게 뼈를 회생의 존재 약물 유도 뼈 결함의 기본 메커니즘을 조사 유리 하다. 여기, 선물이 glucocorticoid prednisolone, 뼈 조직에 불리 한 효과 함께 일반적으로 사용 되 항 염증 제 약물과 약물 치료 성인 뼈 재생 정권과 결합 하는 프로토콜. 이 프로토콜 면역 유도 및 억제 효과, zebrafish의 재생 조직에 뼈를 성공적으로 사용 되 고 prednisolone과 척추 등 성인 조직에 다른 약물의 영향에 대 한 연구에도 적용할 수 있습니다. 면역 억제 약물 치료 zebrafish 겪고 지 느 러 미 또는 두개골에서 수행 될 때 다음 계정으로 취해야 한다.
상해 분석 실험의 재현성
지 느 러 미 재생 중 재생 속도 (즉, 지 느 러 미 조직, 뼈, 시간 단위 당 포함의 regrowth) 지 느 러 미 조직 절제13되는 금액에 아주 많이 따라 달라 집니다. 지 느 러 미 재생의 원치 않는 변화를 방지 하기 위해 반드시 항상 지 느 러 미 조직 모든 표본에서의 상응 하는 금액을 resect.
뼈 다 귀 지 느 러 미 레이 골절의 실행 약간 선택한 뼈 핀 레이 세그먼트의 중심에는 주사 바늘을 추진 하 여 수행 됩니다. 2 hemirays 반대 뼈 탄 미 익 광선에 의하여 이루어져 있다, 사용 압력만 하나 또는 두 hemirays 골절 여부를 결정 합니다. 우리 모두 hemirays의 골절 핀 레이, 결과적으로 다음과 같은 일 동안 분리 수 있습니다 불안정 하 경향이 있기 때문에 하나의 hemiray, 골절을 낮은 압력을 적용 하는 선호 한다.
Microdrilling에 의해 두개골의 calvarial 상해는 신중 하 게 수행 되어야 한다. (즉, 소 뇌) 자세 및 locomotory 뇌 손상 한다면 표본15의 엉뚱한 수영 하 여 적자 명백한 될 것입니다. 소 뇌 부상 Zebrafish 약물 치료에 불리 한 반응을 표시 되 고 뼈 재생을 공부에 사용할 수 없습니다.
약물 치료에 관한 고려 사항
성인 zebrafish에 일관 된 면역 반대로 재생 효과 만들어 우리 물고기 물에서 50 µ M prednisolone의 복용량을 사용 합니다. 우리는 애벌레와 성인 zebrafish에 초기 복용량 응답 실험 중이 복용량을 발견. 따라서, 복용량 응답 실험을 적용할 수 있는 다른 면역 에이전트의 필요한 복용량을 식별 하는 밖으로 실행 되어야 한다. 성인을 위한 좋습니다 지 느 러 미 재생 정권 초기 실험 결합으로 지 느 러 미 재생 길이 조직 변경에 대 한 매우 민감하고 쉽게 감지 판독.
면역 치료는 미생물 감염을 치료 표본 경향. 따라서, 단일 압력가 커 압력가 물고기 물 포함가 중요 합니다. 비록 이러한 조건을 수행 하 더 복잡 하 고 살 균 되지 않습니다, 그들은 치료 zebrafish에 감염을 최소화 하기 위해 도움이. 우리 ('소독')을 pretreat 하지 않았다 Artemia 계란. 그러나,이 필요한 경우 zebrafish, 감염을 방지 하기 위해 추가 조치를 수 있습니다. 게다가, 메 틸 렌 블루 (1%) 등의 살 균 물질 사용 하기 전에 물에 물고기를 추가할 수 있습니다.
실험 prednisolone, 모두 단기 및 장기, 물고기 물 매일 변경 해야. 우리는 최대 8 주 동안 성인 zebrafish를 대우 했다. 오랜 시간에 대 한 개인의 많은 수의 치료는 특정 실험 '부담'으로 이어질 수 있습니다 그리고 신중 하 게 계획 해야 합니다. 그것은 항상 압력가 물고기 물과 유리 도자기 준비의 필요한 금액을 가지고입니다. 이 (우리의 지식)에 제 브라에서 테스트 되지 않았습니다, 비록 관심의 마약에 대 한 느린 릴리스 알 약의 주입 zebrafish 장기 약물 노출에 대 한 가치 있는 대안을 나타낼 수 있습니다.
유전자 변형 zebrafish에 분석
여기, 우리는 강화/뼈 조직의 석 회화에 대 한 알리자린 레드와 calcein 얼룩 얼룩 2 방법 제시. 또한, 우리 재생 지 느 러 미와 두개골 조직에서 vivo에 는 stereomicroscope의 도움으로 이미지 하는 방법을 보여 줍니다. 후자의 기법 수 또는 선택 된 셀, osteoblasts 등 면역 세포의 활동을 보고 하는 유전자 변형 zebrafish 몇 군데 되는 경우 매우 유용 하다. 예를 들어 부상 희생 고 알리자린 레드 얼룩 수행 prednisolone 취급 zebrafish, 전에 지 느 러 미를 재생성 또는 수리를 진행 하는 trepanated 두개골, 숫자와 뼈 형성에 osteoblasts의 활동 보고 촬영 수 있습니다. 유전자 변형 기자 선 안내 (osterix: nGFP)22. 마찬가지로, 상피 상처 폐쇄, 하루에 내에서 발생 하는 상피 조직에 fluorophore를 표현 하는 유전자 변형 물고기에 구상 될 수 있다. 또한, 상해 (또는 취급 prednisolone 개인에 그들의 부재)의 사이트에서 면역 세포의 축적 필요한 광원 및 필터 stereomicroscope와 함께 쉽게 모니터링할 수 있습니다.
합계에서는, 지 느 러 미 또는 두개골에 뼈 재생을 겪고 있다 zebrafish 체계적 관리 후 면역 에이전트 및 다른 약물의 효과 공부 하 여기에 제시 된 프로토콜을 사용할 수 있습니다. GIO의 pathogenesis의 윤곽을 그리 다 성공적인 뼈 재생을 기본 메커니즘을 조사 하 고 유용할 것 이다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 센터의 재생 치료 드레스덴의 ("Zebrafish 모델 glucocorticoid 유발 뼈 손실의 메커니즘을 해명 하기") 교부 금에 의해 그리고 또한 도이치 가운데 (Transregio 67, 프로젝트의 교부 금에 의해 지원 되었다 387653785) FK를. 우리는 그들의 지도 원조 뼈 다 귀 탄 미 익 광선에 calvariae 및 골절의 trepanation 수행에 대 한 1 월 Kaslin를 Avinash Chekuru 매우 감사. 실험 설계, 수행 되었고 KG와 FK에 의해 분석. FK 원고를 썼다. 우리 또한 카트린 램버트, 니콜 Cudak와 기술 지원 및 토론을 위한 Knopf와 브랜드 연구소의 다른 회원 들에 게 감사 하 고 싶습니다. 우리의 감사는 또한 Henriette Knopf와 원고를 교정에 대 한 조 쉬 커리 마리카 피셔와 훌륭한 물고기에 대 한 Jitka Michling을 갑니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3 mm x 13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
- Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Paul, S., Crump, J. G. Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish. Bonekey Reports. 5, 853 (2016).
- Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases. Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).
- den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis. Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- de Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).
- Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale. International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).
- Geurtzen, K., et al. Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues. Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).
- Geurtzen, K., et al. Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull. Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hirasawa, T., Kuratani, S. Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development. Zoological Letters. 1, 2 (2015).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Knopf, F., et al. Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin. Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Oppedal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Spoorendonk, K. M., et al. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- Gioia, R., et al. The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta. Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).
- Fiedler, I. A. K., et al. Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
- Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).
- Hayes, A. J., et al. Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis. PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).
- Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).
- de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).
