Summary
Aqui, descrevemos 3 modelos de lesão de zebrafish adultos e seu uso combinado com tratamento de drogas imunossupressoras. Nós fornecemos orientação nas imagens de regenerar tecidos e na detecção de mineralização óssea nele.
Abstract
Zebrafish são capazes de regenerar vários órgãos, incluindo os apêndices (aletas) após amputação. Isso envolve a regeneração do osso, que regrows dentro de aproximadamente duas semanas após a lesão. Além disso, zebrafish são capazes de curar ossos rapidamente após a trepanação do crânio e reparar fraturas que podem ser facilmente introduzidas em raios de barbatana ósseas zebrafish. Estes ensaios de lesões representam paradigmas experimentais viáveis para testar o efeito de drogas administradas em rapidamente formando o osso. Aqui, descrevemos o uso destes modelos 3 lesões e seu uso combinado com tratamento glicocorticoide sistêmico, que exerce efeitos inibitórios e imunossupressoras de osso. Nós fornecemos um fluxo de trabalho sobre como se preparar para tratamento imunossupressor no zebrafish adulto, ilustram como realizar amputação de barbatanas, trepanação de raspagem ossos e fraturas de barbatana e descrever como o uso de glicocorticoides afeta ambos osso formando osteoblastos e células da linhagem de monócitos/macrófagos como parte da imunidade inata no tecido ósseo.
Introduction
Zebrafish representam um poderoso modelo animal para estudar a doença e desenvolvimento de vertebrados. Isto é devido ao fato de que eles são pequenos animais que se reproduzem muito bem e que o seu genoma é totalmente sequenciado e passível de manipulação1. Outras vantagens incluem a opção de executar a imagem ao vivo contínua em diferentes fases, incluindo no vivo por imagens do zebrafish adulto2e a capacidade de executar telas de drogas de alto throughput em zebrafish larvas3. Além disso, o zebrafish possuem uma alta capacidade regenerativa em uma variedade de órgãos e tecidos, incluindo o osso e, portanto, servir como um sistema útil para estudar a doença do esqueleto e reparar4,5.
Osteoporose induzida por glicocorticoide (GIO) é uma doença que resulta do tratamento a longo prazo com glicocorticoides, por exemplo, no curso de tratamento de doenças auto-imunes, tais como de asma ou artrite reumatoide. GIO desenvolve-se em cerca de 30% dos pacientes tratados com glicocorticoides e representa uma grande saúde questão6; Portanto, é importante investigar o impacto da imunossupressão no tecido ósseo em grande detalhe. Nos últimos anos desenvolveram-se uma variedade de modelos de zebrafish, lidando com a patogênese da GIO. Perda óssea mediada por glicocorticoide tem sido induzida no zebrafish as larvas, por exemplo, que levou à identificação de compostos antídoto, aumentando a massa óssea em uma droga tela7. Além disso, efeitos inibitórios óssea induzida por glicocorticoides têm sido imitados no zebrafish escalas tanto in vitro e in vivode8,9. Estes ensaios são muito convincentes abordagens, especialmente quando se trata de identificação de novos medicamentos imunossupressores e osso de anabólico. No entanto, eles apenas parcialmente levam em conta o endoesqueleto e não tem sido realizados num contexto regenerativo. Assim, eles não permitem a investigação dos efeitos mediados por glicocorticoide durante rápidas modos de formação do osso adulto, regenerativa.
Aqui, apresentamos um protocolo que permite aos pesquisadores estudar os efeitos mediada por glicocorticoide em ossos de zebrafish adultos submetidos a regeneração. Modelos de lesão incluem amputação parcial de zebrafish barbatana caudal, trepanação do crânio, bem como a criação de fraturas de raio de barbatana (figura 1A-1-C) e são combinados com glicocorticoides exposição através de incubação (Figura 1E ). Recentemente usamos uma parte do presente protocolo para descrever as consequências da exposição a prednisolona, um dos medicamentos comumente prescritos corticosteroides, em adultos do zebrafish regenerando fin e crânio osso10. No zebrafish, administração de prednisolona leva à proliferação osteoblástica diminuída, diferenciação osteoblástica incompleta e rápida indução da apoptose na linhagem monócitos/macrófagos10. Neste protocolo, também descrevemos como fraturas podem ser introduzidas na única barbatana ósseas ray segmentos11, como esta abordagem pode ser útil quando estudando efeitos mediados por glicocorticoide no osso ocorrendo durante o reparo de fratura. Os métodos apresentados aqui ajudarão a mais endereço subjacente mecanismos de ação do glicocorticoide em rápida regeneração óssea e também podem ser empregados em outras configurações de administração de drogas sistêmicas no contexto da regeneração de tecidos do zebrafish.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Landesdirektion Dresden (permitir números: AZ 24D-9168.11-1/2008-1, 24-9168.11-1/2011-52 AZ, AZ 24-9168.11-1/2013-5, 24-9168.11-1/2013-14 AZ, AZ DD24.1-5131/354/87).
1. preparação de materiais e soluções
Nota: Prednisolona, como outros glicocorticoides, leva à imunossupressão. Assim, as precauções devem ser tomadas para prevenir a infecção em animais tratados durante o experimento. Para esse efeito, mercadorias de vidro de autoclave e 'peixe água' (ou seja, a água que é usada para traseira zebrafish adulto) antes de iniciar o experimento.
- Calcule o número de zebrafish para ser usado no experimento. Não se esqueça de incluir os indivíduos que servem como controles.
- Provetas de vidro autoclave a 600 mL que são cobertas com folha de alumínio com fita de autoclave. Zebrafish será tratado individualmente, assim 1 copo copo é exigido por zebrafish.
- Calcule a quantidade de peixes de água necessária para o experimento. 300 mL são necessários por pessoa e dia. Levar em consideração o comprimento da experiência (por exemplo, 1 semana/7 dias).
- Encha os frascos de vidro com água de peixe, feche-os e autoclave as garrafas com fita de autoclave. Idealmente, use garrafas de 2 L, mas outros frascos de 1 L ou 5 L podem ser usados também.
Nota: Se as experiências são longas (por exemplo, 4 semanas/28 dias) e a quantidade de garrafas de vidro é limitada, certifique-se de preparar garrafas para um mínimo de vários dias de cada vez e repita o processo (1.3 para 1.4) durante todo o experimento. - Prepare uma solução stock de prednisolona de prednisolona 100mm estéril filtrada em dimetilsulfóxido (DMSO). Congele o estoque em 1 mL ou alíquotas de tubo 2 mL microcentrifuge.
Cuidado: Sempre desgaste protetor roupa quando trabalhando com prednisolona (luvas, óculos de segurança, jaleco). - No primeiro dia do experimento, prepare soluções de incubação com prednisolona e DMSO, respectivamente. Para este fim, descongele a quantidade necessária de solução-mãe de prednisolona 100mm e adicionar prednisolona a água esterilizada peixe em uma concentração final de 50 µM.
- Para os tratamentos de controle, adicione o volume correspondente de DMSO a água esterilizada peixe. Por exemplo, para produzir água de peixe contendo 2L prednisolona, adicione 1 mL de estoque de prednisolona 100 mM para 2 L de água de peixes. Em outra garrafa de 2 L de água do peixe, adicione 1ml DMSO, correspondentemente.
- Trabalhar em local apropriado que é designado para realizar tratamentos com drogas, idealmente em um quarto a 27 ° C.
2. geração de lesões em barbatanas de Zebrafish
Nota: Para ferir o osso no zebrafish barbatanas, realizar a ressecção da nadadeira (amputação, geralmente na barbatana caudal) ou fratura raios individual de barbatana ósseas (modelo de fratura). Para este fim anestesiar zebrafish adulto primeiro.
- Amputação
- Para anestesiar zebrafish adulto, prepare-se um diâmetro de 100 mm placa de Petri contendo 0,02% MS-222 (Metanossulfonato de-3-aminobenzoato de etilo) em água de peixe (a água não precisa ser esterilizada).
- Transferir um zebrafish cada vez para o prato de Petri contendo MS-222 por meio de uma rede de pesca e incube-lo até que ele encontra-se em seu lado sem movimento e não responder ao toque. Teste o último tocando a nadadeira anal com fórceps rombudo.
- Espere até o nível 4 de anestesia é alcançado o que é o nível apropriado para ressecção de barbatana12. Nesta fase, a taxa de movimento odontódios é diminuída, tônus muscular é perdido e o peixe não se move em cima do toque12.
- Leve fórceps rombudo e transferir o zebrafish anestesiado com cuidado a tampa invertidos a 100 mm placa de Petri. Coloque o zebrafish na parte lateral. Certifique-se do zebrafish sempre mentem na mesma orientação, por exemplo, no seu lado direito do corpo. Com um bisturi ou uma lâmina de barbear, ressecar 50% da nadadeira (figura 1A, 2A).
Nota: A velocidade de regeneração de barbatana zebrafish depende da quantidade de tecido ressecado barbatana, ou seja, o tecido mais de barbatana é ressecado, quanto mais rápido a barbatana regenera13. Assim, para minimizar as variações na regeneração de barbatana certifique-se de sempre ressecar a barbatana do mesmo nível no zebrafish todos. - Transferi o zebrafish ferido para um copo de vidro esterilizado contendo 300 mL de prednisolona ou DMSO contendo água esterilizada peixe. Cobrir o copo de vidro com papel de alumínio para evitar a fuga do zebrafish.
- Repita as etapas 2.1.2 para 2.1.3 até que seja atingido o número necessário de zebrafish para o experimento.
- Para anestesiar zebrafish adulto, prepare-se um diâmetro de 100 mm placa de Petri contendo 0,02% MS-222 (Metanossulfonato de-3-aminobenzoato de etilo) em água de peixe (a água não precisa ser esterilizada).
- Fratura de barbatana
- Prepare uma agarose-revestido 100 mm placa de Petri aquecendo uma solução de agarose 2% em água de peixe ou E3 (embriões 3, 50mm de cloreto de sódio, cloreto de potássio de 0,17 mM, 0,33 mM de cloreto de cálcio, sulfato de magnésio 0,33 mM). Com cuidado, despeje aproximadamente 10 a 15 mL da solução de Petri. O fundo do prato deve ser completamente coberto. Deixe o agarose solidificar.
- Anestesiar o zebrafish conforme descrito na seção 2.1.
- Leve a fórceps rombudo e transferir o zebrafish anestesiado com cuidado para a agarose-revestido 100 mm placa de Petri. Coloque o zebrafish na parte lateral. Sob o microscópio de dissecação, espalhe a barbatana caudal completamente para ser capaz de identificar os raios da barbatana ósseas distintas e fin ray segmentos. Certifique-se do zebrafish sempre mentem na mesma orientação, por exemplo, no seu lado direito do corpo.
- Com uma agulha de injeção (0,3 x 13 mm) apresente uma fratura no centro de um segmento de ray barbatana ósseas (figura 1B). Para fazer isso, a agulha é colocada ligeiramente o segmento até que uma rachadura apareça (seta na Figura 2B). Enquanto uma pressão suave leva à fratura de apenas um dos hemirays opostos dois mais fortes pressão levará à fratura de ambos os segmentos hemiray.
- Não introduza muitas fraturas em barbatanas, pois isto prejudicará grandemente a estabilidade da nadadeira. Como sugestão, aplica fraturas apenas em 3 a 5 raios de barbatana.
- Sempre produzir fraturas em segmentos correspondentes através de raios diferentes barbatana e zebrafish, por exemplo em raios da barbatana dorsal 3, 7 (ou 8) e ventral fin ray 3. O nível proximal-distal da fratura é ideal em 3 segmentos proximais dos raios da barbatana bifurcação ponto 11.
- Transferi o zebrafish ferido para um copo de vidro esterilizado contendo 300 mL de prednisolona ou DMSO contendo água esterilizada peixe. Cobrir o copo de vidro com papel de alumínio para evitar a fuga do zebrafish.
- Repita os passos 2.2.2 para 2.2.5 até que seja atingido o número necessário de zebrafish para o experimento.
3. geração de lesões crânio raspagem (trepanação)
Nota: A Calvárias no zebrafish são homólogas aos ossos raspagem em mamíferos. Assim, estes ossos exoskeletal14 representam um tecido de especial interesse quando estudar a patogênese da GIO. Para ferir o crânio, trepanação é executada por um furação do frontale so e/ou sistema operacional parietale (Figura 1, C 2) com a ajuda de um microdrill11.
- Anestesiar o zebrafish de acordo com a seção 2.1.
- Segure o zebrafish anestesiado na posição vertical com a pinça, para que os ossos de raspagem são bem visíveis sob um microscópio de dissecação da acima (Figura 1).
- Localize o microdrill rotativa no centro do osso frontal (sistema operacional frontale) e tocar o osso. O buraco produzido é do tamanho da rebarba do microdrill (500 µm, Figura 2, Figura 3B).
Nota: Certifique-se de não mover o microdrill lateralmente ao produzir a lesão. Também pare imediatamente quando a resistência do osso de repente cai. Não faça qualquer um mais, caso contrário, o cérebro será danificado 15. - Transferi o zebrafish lesionado para uma gaiola cheia de água de peixe até que ele se recupere totalmente da anestesia. Vê-lo com cuidado.
- Transferi o zebrafish lesionado para uma água de peixes além de prednisolona ou copo de vidro contendo DMSO.
4. tratamento de Zebrafish durante a incubação
Nota: Durante a aplicação de prednisolona/DMSO, o medicamento contendo peixes água precisa ser mudada diariamente, e zebrafish precisam de ser alimentados regularmente.
- Mudanças de água
- Para trocar a água de peixes, descongelar o estoque de prednisolona 100mm e preparar a quantidade necessária de 50 prednisolona µM em peixes autoclavados água fresca todos os dias do período de tratamento. Prepare o DMSO contendo água do peixe para o controle do zebrafish conformemente.
- Tomar um copo de vidro contendo um único zebrafish alojado em sua solução de incubação e transferir a solução, incluindo o zebrafish em um recipiente apropriado, por exemplo, uma gaiola de habitação temporal.
Nota: Sempre usar recipientes separados de intercalar para prednisolona e DMSO trataram zebrafish, respectivamente, para certificar-se de DMSO controle zebrafish não ficam expostas a prednisolona e vice-versa. - Encha o copo de vidro com droga fresca contendo água de peixe (300 mL).
- Transferi o zebrafish do recipiente provisório para o copo de vidro contendo solução de incubação fresco usando uma rede de pesca. Colocar de volta o papel alumínio para evitar a fuga do zebrafish.
- Se o tempo da experiência superior a 2 semanas, troca os copos de vidro.
- Alimentação
- Não alimente zebrafish durante tratamentos curtos (para até 2 dias). Durante experimentos mais, alimente zebrafish. Tome especial cuidado para evitar a poluição da solução de incubação. Assim, alimentação com Artemia SSP. em vez de com comida floco e somente em cada segundo dia.
Nota: Artemia são regularmente usados para alimentar o jovem zebrafish e deve estar disponível na unidade haltering zebrafish.- Cerca de 2 h antes da água do peixe é trocada, alimentar o zebrafish com Artemia ssp seus copos de vidro. Para fazer isso, use uma pipeta plástica e avanço de 0,5 a 1 mL de solução de Artemia eclodida por copo de vidro.
- Esperar por 2h e trocar a solução de incubação com drogas fresca contendo água de peixes, de acordo com a seção 4.1.
- Não alimente zebrafish durante tratamentos curtos (para até 2 dias). Durante experimentos mais, alimente zebrafish. Tome especial cuidado para evitar a poluição da solução de incubação. Assim, alimentação com Artemia SSP. em vez de com comida floco e somente em cada segundo dia.
5. as análises de amostras
Nota: Após a incubação de zebrafish ferido em prednisolona e DMSO contendo água de peixe, respectivamente, ou realizar análises de mineralização/calcificação do osso (5.1 para 5.3) ou realizar imagens ao vivo de zebrafish sob o microscópio de dissecação (5.4) 10,11,16. Uso de imagens ao vivo para determinar o comprimento regenere barbatana e para detectar diferenças na expressão do gene repórter no zebrafish transgênico.
-
Fixação de tecidos de interesse
- Para a fixação das aletas e/ou crânios preparar paraformaldeído 4% (PFA) em PBS e congelar a-20 ° C para armazenamento. Utilizar recentemente preparadas 4% PFA em PBS ou descongele a quantidade necessária antes da utilização. Como alternativa, 2% PFA em PBS pode ser usado.
Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado sob uma coifa. Utilizar vestuário de protecção. - Para a fixação das barbatanas, preparar um pequeno prato de Petri (por exemplo, 30 mm) com frio 4% PFA em PBS e certifique-se de que o fundo do prato é totalmente coberto. Para a fixação de crânios, preparar um pequeno frasco de vidro com tampa ou um tubo com frio 4% PFA em PBS.
Cuidado: Punho PFA contendo soluções somente sob a coifa como é tóxico. Utilizar vestuário de protecção. - Colheita no tecido de interesse.
- A colheita se regenerando tecido barbatana ou barbatanas com fraturas anestesiar o zebrafish de acordo com a seção 2.1 ou eutanásia o zebrafish de acordo com a secção 5.1.5.
- Transferi o zebrafish anestesiado para a tampa de uma caixa de Petri. Usando um bisturi ou lâmina de barbear, colha a regenerar de barbatana. Certifique-se de incluir tecido do tronco em regeneração barbatanas para facilitar a manipulação do tecido colhido.
- Corrigi as barbatanas flat no PFA contendo placa de Petri a 4 ° C durante a noite. Fixação plana evita ondulando acima do tecido barbatana durante a fixação.
- Para corrigir plana, pegue o tecido da aleta com uma pinça bem na borda dorsal ou ventral do coto e mergulhá-lo na solução de fixação. Agarre a borda oposta do coto com uma segunda pinça fina e pressione ligeiramente o tecido para o fundo do prato.
- Segure por 10 a 20 s antes de liberar. O tecido de barbatana não deve enrolar mais. Se isso acontecer, repita.
- Eutanásia em zebrafish para colher tecido crânio lesionado. Preparar um diâmetro de 100 mm placa de Petri contendo 0,1% MS-222, em água de peixe. Transferi um zebrafish cada vez para o prato de Petri contendo MS-222 por meio de uma rede de pesca. Quando é atingido o nível 6 de anestesia (colapso medular) espera pelo menos 10 min para garantir a morte do espécime12.
- Usar um bisturi corta fora a cabeça mais um pouco tecido do porta-malas do resto do corpo. Mergulhe o tecido colhido na solução preparada PFA 4% na jarra de vidro ou tubo plástico. Correção para 24 h a 4 ° C, com balanço suave.
- Para armazenar as amostras a longo prazo após a fixação, lave-os com PBS (3 x 20 min RT) e metanol-deleite em uma série crescente de metanol (1 x 30%, 1 x 50%, 1 x 70%, 2 x 100% metanol em PBS por 20 min cada).
- Armazená-los em metanol 100% a-20 ° C. Caso contrário, diretamente proceda com osso manchar ou outras análises após a lavagem com PBS.
- Para a fixação das aletas e/ou crânios preparar paraformaldeído 4% (PFA) em PBS e congelar a-20 ° C para armazenamento. Utilizar recentemente preparadas 4% PFA em PBS ou descongele a quantidade necessária antes da utilização. Como alternativa, 2% PFA em PBS pode ser usado.
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Técnicas de coloração de osso eu (coloração de vermelho de alizarina)
Nota: Esta coloração é realizada de acordo com van Eeden et al . 199617 e Walker & Kimmel 200718 com modificações.- Para realizar a coloração de vermelho de alizarina sobre adultas barbatanas ou crânios, colheita e reparar o tecido, conforme descrito nas seções 5.1.
- Se as amostras foram armazenadas em metanol a-20 ° C, reidratar amostras, fazendo uma série de metanol inversa (70%, 50% e 30% em PBS, cada 1 x 20 min) e lavar duas vezes 20 min com PBS. Lave as amostras por 5 min mínimo com água desionizada.
- Para fazer a coloração de vermelho de alizarina em crânios, tratar as amostras com tripsina 50 mg/mL em 30% saturado Na2B4O7 , à temperatura ambiente durante a noite. Amostras de rocha durante este tempo. Amostras de enxágue em 30% Na2B4O7 solução saturada. Lave as amostras com água desionizada, 2 vezes por 5 min cada. Esta etapa não é executada pelo tecido de barbatana.
- Adicionar solução de vermelho de alizarina (parte b: 0,5% vermelho de alizarina S pó, 10% de glicerol em água desionizada) e as amostras de rock durante a incubação a RT. Check para coloração após 1, 2, 4 h ou durante a noite.
- Para limpar as amostras tratá-los com uma série de glicerol: hidróxido de potássio 1% decrescente (3:1 durante a noite, 1:1 durante a noite, a noite de 1:3).
- Armazenar as amostras em solução de hidróxido de potássio 0,1% 1:1:80 % de glicerol e montá-los com 80% de glicerol para a imagem latente.
Nota: Para combinado Alcian blue/alizarina vermelha manchando amostras de deleite com Alcian azul coloração solução (parte a: 0.02% final Alcian azul, 50 mM MgCl2, 70% de etanol) após reidratação (seção 5.2.2) por 2 h em RT. Treat aletas com uma série de etanol decrescente em 50 mM MgCl2 (70%, 50%, 30%, cada 1 x 15 min) e lave-os durante um período mínimo de 1 h (3 x 20 min) em água desionizada. Proceda com vermelho de alizarina, coloração (seção 5.2).
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Técnicas de coloração II (calceína coloração) do osso
Nota: Para detectar a deposição de cálcio na barbatana fraturas e lesões de crânio, peixes vivos são incubados em calceína contendo a solução.- Prepare a quantidade necessária de calceína 0,2% em água desionizada (pH 7,5). Certifique-se que o pH é neutro. Use 1 M de NaOH para ajustar o pH.
- Incube até 3 zebrafish simultaneamente em 100 mL de solução de calceína por 20 min em um copo de vidro coberto com papel alumínio.
- Transferi o zebrafish para um copo com água de peixe. Deixá-los nadar brevemente antes de transferi-los para um novo copo com água de peixe. Deixá-los nadar neste copo de novo por 20 min lavar. Tire fotos (ver secção 5.4).
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Viver a imagem latente de zebrafish
- Use essa abordagem para adquirir imagens de regenerar o tecido ósseo, tais como na barbatana ou crânio durante todo o experimento sem sacrificar o zebrafish. Anestesiar o zebrafish de acordo com a seção 2.1.
- Para adquirir imagens de barbatana regenera, transferi o zebrafish anestesiado para um prato de Petri revestida de agarose (veja a seção 2.2.1 e figura 1B).
- Para adquirir imagens de regenerar ossos do crânio, endireite o zebrafish em uma esponja (Figura 1) ou coloque em um prato de agarose-revestido que foi preparado para segurar o porta-malas do zebrafish.
- Adquira imagens na ampliação desejada e resolução usando uma configuração de stereomicroscopic.
- Retorne o zebrafish para um recipiente com fresco ou drogas que contenham água de peixe.
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Representative Results
O protocolo apresentado aqui tem sido usado repetidamente para induzir a formação de osso rápida durante a regeneração do zebrafish fin e crânio10,11,16. Em combinação com o método apresentado da administração de prednisolona, estudos sobre os efeitos do prednisolona durante a regeneração óssea podem ser perseguidos. Por exemplo, estudos sobre a formação óssea e mineralização na regenerar podem ser executados. Prednisolona, como outros glicocorticoides19,20, leva a inibição total de regeneração de barbatana, incluindo a formação óssea, detectadas por alizarina vermelha de coloração sobre fixa tecido barbatana caudal (Figura 3A). Da mesma forma, prednisolona tem um efeito atraso no fechamento da lesão crânio (raspagem), que pode ser ilustrado pelo vermelho de alizarina (Figura 3B) ou na vivo calceína coloração. Além disso, prednisolona exerce um profundo efeito anti-inflamatório no tecido tanto fin e crânio, provocando apoptose na linhagem de monócitos/macrófagos. Macrófago reduzido números podem ser detectados por imuno-histoquímica no tecido congelado das seções, por exemplo, usando um anticorpo anti-mcherry em transgênicos mpeg1: mCherry zebrafish (Figura 3)10,21 . Da mesma forma, o número, distribuição, proliferação e apoptose de outros tipos de células de interesse tanto no exo - e o endoesqueleto (por exemplo, vértebras) pode ser analisados com a ajuda de imuno-histoquímica.
Figura 1 : Procedimentos realizados no zebrafish. (A) ressecção da barbatana caudal (amputação) no zebrafish anestesiado com a ajuda de um bisturi. A linha tracejada vermelha indica o nível de amputação. (B) Fin ray fratura no zebrafish anestesiado, realizado com uma agulha de injeção sob o microscópio. O peixe está deitada em um prato de Petri de agarose-revestido durante o procedimento. Pratos de Petri de agarose-revestidos também são usados para adquirir imagens de zebrafish barbatanas durante a regeneração ou reparação de fratura. (C) trepanação da Calvárias (lesão do crânio), realizada no zebrafish anaestetized com a ajuda de um microdrill sob o microscópio estereoscópico. (D) aquisição de regenerar o osso do crânio após lesão de imagem. O zebrafish anestesiado é colocado na posição vertical em uma esponja e imagens são adquiridas com a ajuda de um microscópio. O prato de Petri é preenchido com água de peixe contendo 0,02% MS-222. (E) incubação de zebrafish em prednisolona ou DMSO contendo água de peixe. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Visualização ao vivo microscópica das lesões às 0 h pós lesão hpi). (A) Amputated barbatana caudal. Barra de escala = 200 µm. (B) fraturado fin ray. A fratura é indicada pela seta vermelha. Barra de escala = 100 µm. (C) Trepanated crânio. O local da lesão é indicado pela seta branca. Barra de escala = 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Resultados representativos do tratamento prednisolona no zebrafish adulto. (A) alizarina vermelha barbatana manchada regenera em 14 dias pós amputação (dpa) e dias de tratamento (dt). Prednisolona tratada barbatana regenera são mais curto (não mostrado) e um menor domínio de vermelho de alizarina a matriz óssea positiva é detectada. Barra de escala = 500 µm. (B) manchada de vermelho de alizarina caveiras em 7 dias pós lesão (dpi) e dt. Barra de escala = 100 µm. Esta figura foi modificada com a permissão de10. (C) Cryosection ver ileso crânio e cérebro tecido de (Prednisolona) tratada e não tratado (DMSO) Tg (mpeg1: mCherry) x Tg (osterix: nGFP) peixe transgénicos repórter, em que os macrófagos (células do sistema imunológico inatos) são rotulados em vermelho 21 e osso formando osteoblastos são rotulados em verde22. O número de macrófagos cai significativamente no zebrafish prednisolona Tratado. Imuno-histoquímica foi realizada conforme descrito em Geurtzen et al 10. núcleos são rotulados em azul (DAPI). Barra de escala = 20 µm. BF: campo claro, epid: epiderme, bn: osso. Esta figura foi modificada com a permissão de10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Zebrafish provaram ser úteis em pesquisa esquelética em muitos aspectos. Selecionado mutantes imitam aspectos das doenças humanas, tais como osteogênese imperfeita ou osteoartrite23,24,25,26,27, e as larvas, bem como escalas estão sendo usadas para Identifica compostos anabólicos de osso na molécula pequenas telas7,28,29. Tratamentos de zebrafish com drogas que são aplicadas na prática clínica além disso são ideais para estudar putativos efeitos adversos, por exemplo no tecido ósseo. Neste contexto, a presença de rápida regeneração óssea é vantajosa para investigar os mecanismos subjacentes de deficiências óssea induzida por medicação. Aqui, apresentamos um protocolo em que o tratamento medicamentoso com a prednisolona glicocorticoide, uma droga anti-inflamatórios comumente usada com efeitos adversos no tecido ósseo, é combinado com regimes de regeneração óssea adulta. Este protocolo com sucesso tem sido usado para induzir imunossupressores e efeitos inibitórios nos tecidos regenerativos de zebrafish do osso e também pode ser adaptado para estudos sobre o impacto de prednisolona e outras drogas em tecidos adultos, como a coluna vertebral. Os seguintes detalhes devem ser considerados quando tratamentos com drogas imunossupressoras são realizados no zebrafish submetidos à barbatana ou regeneração do crânio.
Reprodutibilidade dos ensaios de lesão
Durante a regeneração de barbatana, velocidade de regeneração (i.e., a regeneração do tecido de barbatana, incluindo o osso, por unidade de tempo) depende muito da quantidade de tecido de barbatana que está sendo ressecadas13. Para evitar a indesejada variabilidade da regeneração de barbatana, certifique-se de sempre fazer a ressecção quantidades equivalentes de tecido de barbatana em todas as amostras.
Execução de barbatana ósseas ray fraturas é realizada pressionando ligeiramente uma agulha de injeção para o centro de um segmento de raio escolhido barbatana ósseas. Como raios da barbatana ósseas consistem de 2 hemirays de oposição, a quantidade de pressão utilizada determina se hemirays apenas um ou dois são fraturados. Preferimos aplicar baixa pressão à fratura apenas um hemiray, porque a fratura de ambos os hemirays tende a desestabilizar o raio da barbatana, que como resultado pode destacar-se durante os dias seguintes.
Lesões de raspagem do crânio por microperfuração devem ser realizadas com cautela. Se o dano é feito para o cérebro (ou seja, o cerebelo) postural e locomotora défices vão se tornar aparentes por natação errática do espécime15. Zebrafish com lesão cerebelar pode apresentar reações adversas ao tratamento medicamentoso e não deve ser usado para estudar a regeneração óssea.
Considerações sobre tratamentos com drogas
Para produzir um efeito imunossupressor e antiregenerativo consistente no zebrafish adulto, nós empregamos uma dose de 50 prednisolona µM em água de peixe. Identificamos esta dose durante experimentos dose-resposta inicial em larvas e adultos do zebrafish. Assim, devem ser realizadas experiências de dose-resposta para identificar a dose necessária de outros agentes imunossupressores que podiam ser aplicados. Para adultos, recomendamos combinar estas experiências iniciais com o regime de regeneração de barbatana, como barbatana regenere comprimento é uma leitura altamente sensível e fácil de detectar para alterações de tecido.
Tratamento imunossupressor predispõe as amostras tratadas a infecções microbianas. Portanto, corpo único esterilizado copos contendo água esterilizada peixe é importante. Embora estas condições são mais complicadas para realizar e não estéril, eles ajudam a minimizar a infecção no zebrafish Tratado. Nós não pré-tratamento ('esterilizar') ovos de Artemia. No entanto, isso pode ser uma medida adicional para prevenir a infecção em zebrafish, se necessário. Além disso, substâncias anti-sépticas como azul de metileno (1%) podem ser adicionadas a água antes do uso de peixe.
Experimentos com prednisolona, tanto curto e a longo prazo, exigem alterações diárias de água de peixes. Temos tratado zebrafish adulto por até 8 semanas. Tratamento de um grande número de indivíduos por muito tempo pode levar a um determinado experimental 'peso' e deve ser cuidadosamente planejado. É fundamental ter sempre as quantidades necessárias de peixe autoclavado água e vidro ware pronto. Embora isto não foi testado no zebrafish (a nosso conhecimento), implantação de pellets de liberação lenta para drogas de interesse pode representar uma alternativa valiosa para exposição de longo prazo drogas no zebrafish.
Análises no zebrafish transgênico
Aqui, apresentamos 2 métodos para mancha para mineralização/calcificação de tecidos ósseos por vermelho de alizarina e calceína coloração. Além disso, mostramos como imagem regeneradora fin e crânio tecido na vivo com a ajuda de um microscópio. A última técnica é muito útil, se o zebrafish transgênico relatando o número ou a atividade de células selecionadas, como osteoblastos ou células imunes, está sendo fotografada. Por exemplo, antes de sacrificar o ferido e tratados com prednisolona zebrafish para realizar a coloração de vermelho de alizarina, regenera a barbatana ou crânios trepanated sofrendo reparo podem ser fotografados para procurar a presença, o número e a atividade do osso formando osteoblastos em a linha de transgénicos repórter Tg (osterix: nGFP)22. Da mesma forma, fechamento de ferida epidérmica, que ocorre dentro de um dia, pode ser visualizado em peixes transgênicos, que expressam um fluoróforo no tecido epidérmico. Também, acúmulo de células do sistema imunológico no local da lesão (ou sua ausência em indivíduos Tratado de prednisolona) pode ser controlado facilmente com um microscópio estereoscópico equipado com a fonte de luz necessária e filtros.
Em suma, o protocolo aqui apresentado pode ser usado para estudar os efeitos de agentes imunossupressores e outras drogas após administração sistémica no zebrafish que estão em fase de regeneração óssea na barbatana ou crânio. Isso será útil para delinear a patogênese da GIO e investigar os mecanismos subjacentes a regeneração óssea bem sucedida.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado por uma concessão do centro de regenerativa terapias Dresden ("Zebrafish como um modelo para desvendar os mecanismos da perda óssea induzida por glicocorticoide") e, adicionalmente, por uma concessão da Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, projeto 387653785) para FK. Estamos muito gratos a Jan Kaslin e Avinash Chekuru por sua orientação e assistência na realização de trepanação do Calvárias e fraturas nos raios da barbatana ósseas. Experimentos foram projetados, executados e analisados por KG e FK. FK escreveu o manuscrito. Também gostaríamos de agradecer a Katrin Lambert, Nicole Cudak e outros membros dos laboratórios Knopf e marca para assistência técnica e discussão. Nossos agradecimentos também vai Marika Fischer e Jitka Michling para cuidados excelentes peixes e Henriette Knopf e Josh Currie para revisão do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3 mm x 13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
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