Summary
Här beskriver vi 3 vuxna zebrafiskar skada modeller och deras kombinerade användning med immunosuppressiva läkemedelsbehandling. Vi ge vägledning om avbildning av regenererande vävnader och på att upptäcka ben mineralisering däri.
Abstract
Zebrafiskar kan regenerera olika organ, inklusive bihang (fenor) efter amputation. Detta innebär förnyelse av ben, som regrows inom ungefär två veckor efter skada. Zebrafisk är dessutom kunna läka ben snabbt efter trepanation av skallen och reparera frakturer som enkelt kan införas i zebrafiskar beniga fin strålar. Dessa skador analyser representerar genomförbart experimentella paradigm att testa effekten av administrerade läkemedel för att snabbt bilda ben. Här, beskriver vi användningen av dessa 3 skada modeller och deras kombinerad användning med systemisk glukokortikoid behandling, vilket utövar ben hämmande och immunsuppressiva effekter. Vi ger ett arbetsflöde om hur du förbereder för immunsuppressiv behandling i vuxen zebrafiskar, illustrerar hur du utför fin amputation, trepanation av calvarial ben, och fin frakturer, och beskriva hur användningen av glukokortikoider påverkar båda ben bildar osteoblaster och celler av monocyt/makrofag härstamning som en del av den medfödda immuniteten i benvävnad.
Introduction
Zebrafiskar representerar en kraftfull djurmodell att studera ryggradsdjur utveckling och sjukdom. Detta är på grund av att de är små djur som häckar mycket väl och att deras arvsmassa är fullt sekvenserade och mottagliga för manipulation1. Andra fördelar inkluderar alternativet att utföra fortsatt levande imaging i olika skeden, inklusive in-vivo imaging vuxen zebrafiskar2och förmågan att utföra hög genomströmning drog skärmar i zebrafiskar larver3. Dessutom Sebrafisken besitter en hög regenerativ kapacitet i olika organ och vävnader inklusive ben, och därmed fungera som ett användbart system att studera skelett sjukdom och reparera4,5.
Glukokortikoidinducerad osteoporos (GIO) är en sjukdom som är resultatet av långvarig behandling med glukokortikoider, till exempel i samband med autoimmun sjukdomsbehandling såsom astma eller reumatoid artrit. GIO utvecklar i cirka 30% av patienter behandlade med glukokortikoid och representerar ett stort hälsoproblem fråga6. Det är därför viktigt att undersöka effekterna av immunsuppression på benvävnad i detalj. Under de senaste åren har en mängd zebrafiskar modeller behandlar patogenesen av GIO utvecklats. Glukokortikoid-medierad benförlust har inducerats i zebrafiskar larver, exempelvis som ledde till identifiering av motverkande föreningar ökar benmassan hos en drog skärm7. Dessutom glukokortikoidinducerad ben hämmande effekter har varit härmade i zebrafiskar skalor både in vitro- och in-vivo8,9. Dessa analyser är mycket övertygande metoder, särskilt när det gäller identifiering av romanen immunhämmande och ben anabola läkemedel. Dock de endast delvis ta hänsyn till endoskeleton och har inte utförts i en regenerativ sammanhang. Således, de tillåter inte utredningen av glukokortikoid-medierade effekter under snabba lägen för vuxen, regenerativ benbildning.
Här presenterar vi ett protokoll som gör det möjligt för forskare att studera glukokortikoid-medierad effekter på vuxen zebrafiskar ben som genomgår regenerering. Skada modeller inkluderar partiell amputation av den zebrafiskar stjärtfenan, trepanation av skallen, samt skapandet av fin stråle frakturer (figur 1A-1 C), och kombineras med glukokortikoid exponering via inkubation (figur 1E ). Vi har nyligen använt en del av detta protokoll för att beskriva konsekvenserna av exponering för prednisolon, en av de förskrivna Kortikosteroid läkemedel, på vuxna zebrafiskar regenererande fin och skalle ben10. I zebrafiskar leder prednisolon administration till minskad osteoblast spridning, ofullständig osteoblast differentiering och snabb induktion av apoptos i monocyt/makrofag härstamning10. I detta protokoll, också beskriver vi hur frakturer kan införas i enda beniga fin stråle segment11, eftersom denna strategi kan vara användbar när man studerar glukokortikoid-medierad effekter på ben occuring under frakturreparation. De metoder som presenteras här kommer att bidra till ytterligare adress underliggande glukokortikoid verkningsmekanismer i snabbt regenererande ben och kan även användas i andra inställningar för systemisk drug administration i samband med zebrafiskar vävnadsregeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här godkändes av den Landesdirektion Dresden (tillåta nummer: AZ 24D-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).
1. beredning av material och lösningar
Obs: Prednisolon, liksom andra glukokortikoider, leder till immunsuppression. Således, försiktighetsåtgärder vidtas för att förhindra infektion i behandlade djur under experimentet. Till detta avsluta, autoklav glas porslin och 'fisk vatten' (dvs vattnet som används till bakre vuxen Sebrafisken) innan experimentet.
- Beräkna antalet zebrafiskar som ska användas i försöket. Glöm inte att inkludera de individer som fungerar som kontroller.
- Autoklav 600 mL glasbägare som är täckt med aluminiumfolie med autoklav tejp. Zebrafiskar kommer att behandlas individuellt, således 1 glasbägare krävs per zebrafiskar.
- Beräkna mängden fiskevatten som behövs för experimentet. 300 mL krävs per person och dag. Ta hänsyn till längden på experimentet (t.ex. 1 vecka/7 dagar).
- Fyll glasflaskor med fiskevatten, nära dem och autoklavera flaskorna med autoklav tejp. Helst använder 2 L flaskor, men andra flaskor som 1 L eller 5 L kan användas också.
Obs: Om experiment är långa (t.ex. 4 veckor/28 dagar) och av glasflaskor är begränsad, se till att förbereda flaskor minst flera dagar i taget och upprepa processen (1.3 och 1.4) hela experimentet. - Förbereda en prednisolon stamlösning av sterila-filtrerad 100 mM prednisolon i dimetylsulfoxid (DMSO). Frysa beståndet i 1 mL eller 2 mL mikrocentrifug rör alikvoter.
FÖRSIKTIGHET: Alltid bära skyddskläder när du arbetar med prednisolon (skyddshandskar, skyddsglasögon, laboratorierock). - Den första dagen av experimentet, förbereda inkubation lösningar med prednisolon och DMSO, respektive. I detta syfte Tina det erforderliga beloppet på 100 mM prednisolon stamlösning och tillsätt prednisolon Ånghärdad fisk vatten vid en slutlig koncentration på 50 µM.
- För behandlingarna som kontroll, lägga till motsvarande volym av DMSO Ånghärdad fiskevatten. Som ett exempel, för att producera 2 L prednisolon innehållande fiskevatten, tillsätt 1 mL 100 mM prednisolon lager till 2 L fiskevatten. I en annan 2 L flaska fiskevatten, tillsätt 1 mL DMSO, på motsvarande sätt.
- Arbeta på en lämplig plats som är utsett att utföra läkemedelsbehandlingar, helst i ett rum på 27 ° C.
2. generering av skador i zebrafiskar fenor
Obs: För att skada ben hos zebrafiskar fenor, utföra resektion av fenan (amputation, vanligtvis i stjärtfenan) eller fraktur enskilda beniga fin strålar (fraktur modell). I detta syfte att bedöva vuxen zebrafiskar först.
- Amputation
- För att bedöva vuxen zebrafiskar, förbereda en 100 mm diameter petriskål som innehåller 0,02% MS-222 (etyl-3-aminobensoat methanesulfonate) i fiskevatten (detta vatten inte behöver vara Ånghärdad).
- Överföra en zebrafiskar i taget till MS-222 innehållande petriskål med en fisk netto och inkubera det tills den ligger på sin sida utan rörelse och svarar inte för att röra. Testa det senare genom att trycka på analfenan med trubbig pincett.
- Vänta tills nivå 4 i anestesi nås som är den lämpliga nivån för fin resektion12. I detta skede, opercular rörelse är minskade, muskeltonus förloras och fisken flytta inte på touch12.
- Ta trubbig pincett och överför de bedövat zebrafiskar försiktigt i inversed locket av 100 mm petriskål. Placera zebrafiskar på dess laterala sidan. Kontrollera den zebrafiskar som alltid ligga i samma riktning, till exempel på sin rätt kropp sida. Med en skalpell eller ett rakblad, resect 50% av fenan (figur 1A, 2A).
Obs: Hastigheten på zebrafiskar fin regenerering beror på mängden opererande fin vävnad, dvs mer fin vävnad är resected, ju snabbare fenan regenererar13. Således, för att minimera variationer i fin regenerering se till att alltid resect fenan på samma nivå i alla zebrafiskar. - Överföra den skadade zebrafiskar till en Ånghärdad glasbägare innehållande 300 mL prednisolon eller DMSO som innehåller Ånghärdad fiskevatten. Täck glasbägaren med aluminiumfolie att undvika flykten av zebrafiskar.
- Upprepa steg 2.1.2 till 2.1.3 tills önskat antal zebrafiskar för experimentet nås.
- För att bedöva vuxen zebrafiskar, förbereda en 100 mm diameter petriskål som innehåller 0,02% MS-222 (etyl-3-aminobensoat methanesulfonate) i fiskevatten (detta vatten inte behöver vara Ånghärdad).
- Fin fraktur
- Förbereda en agaros-belagd 100 mm petriskål genom upphettning av en 2% agaros lösning i fiskevatten eller E3 (embryo media 3, 50 mM natriumklorid, 0.17 mM kaliumklorid, 0,33 mM kalciumklorid, magnesiumsulfat 0,33 mM). Häll försiktigt ungefär 10 – 15 mL lösning i en petriskål. Botten av skålen bör vara helt täckt. Låt Agarens stelna.
- Bedöva zebrafiskar som beskrivs i avsnitt 2.1.
- Ta trubbig pincett och överföra de bedövat zebrafiskar noggrant till agaros-belagd 100 mm petriskål. Placera zebrafiskar på dess laterala sidan. Under mikroskopet dissektion, spred sig i stjärtfenan helt för att kunna identifiera distinkta beniga fin strålar och fin stråle segment. Kontrollera den zebrafiskar som alltid ligga i samma riktning, till exempel på sin rätt kropp sida.
- Införa en fraktur i mitten av en benig fin stråle segment (figur 1B) med en injektionsnål (0.3 mm x 13 mm). Detta gör pressas nålen något på segmentet tills en spricka visas (pilen i figur 2B). Medan lätt tryck leder till fraktur av endast en av de två motsatta hemirays starkare leder tryck till fraktur av båda hemiray segment.
- Inte inför alltför många frakturer i fenor, eftersom detta kommer att kraftigt försämra stabiliteten i fenan. Som ett förslag, gäller frakturer endast i 3 till 5 fin strålar.
- Alltid producera frakturer i motsvarande segment över olika fin strålar och zebrafiskar, till exempel i ryggfenan strålar 3, 7 (eller 8) och ventrala fin ray 3. Proximala-distala är frakturer idealisk vid 3 segment proximalt fin strålar bifurkation punkt 11.
- Överföra den skadade zebrafiskar till en Ånghärdad glasbägare innehållande 300 mL prednisolon eller DMSO som innehåller Ånghärdad fiskevatten. Täck glasbägaren med aluminiumfolie att undvika flykten av zebrafiskar.
- Upprepa steg 2.2.2 till 2.2.5 tills önskat antal zebrafiskar för experimentet nås.
3. generation av Calvarial skallskador (Trepanation)
Obs: Calvariae i zebrafisk är homologa till calvarial ben hos däggdjur. Således representerar dessa exoskeletal ben14 en vävnad av särskilt intresse när man studerar patogenesen av GIO. Så att du skadar skallen, utförs trepanation genom att borra ett hål i Os frontale eller Os parietale (figur 1 c, 2 C) med hjälp av en microdrill11.
- Bedöva zebrafiskar enligt avsnitt 2.1.
- Håll den sövda zebrafiskar upprätt med pincett, på så att calvarial ben är väl synliga under en dissektion Mikroskop från ovan (figur 1 c).
- Leta upp den roterande microdrill på mitten av pannbenet (Os frontale) och tryck på benet. Producerade hålet är storleken på microdrill burr (500 µm, figur 2 c, figur 3B).
Obs: Tänk på att inte flytta microdrill sidled medan producerar skadan. Också stoppa omedelbart när motståndet av benet plötsligt sjunker. Borra inte något ytterligare, annars hjärnan blir skadade 15. - Överföra den skadade zebrafiskar till bur fylld med fiskevatten tills det fullt återhämtar sig från anestesi. Titta på det noga.
- Överföra den skadade zebrafiskar till en fiskevatten plus prednisolon eller DMSO innehållande glasbägare.
4. behandling av zebrafisk under inkuberingen
Obs: Under tillämpningen av prednisolon/DMSO, läkemedlet innehållande fiskevatten behöver ändras dagligen och zebrafiskar behöver matas regelbundet.
- Vatten förändringar
- Att utbyta vattnets fisk, Tina 100 mM prednisolon lager och förbereda den nödvändiga mängden 50 µM prednisolon i Ånghärdad fisk vatten färsk varje dag av behandlingsperioden. Förbereda DMSO innehållande fiskevatten för den kontroll zebrafiskar med detta.
- Ta en glasbägare som innehåller en enda inhysta zebrafiskar i dess inkubation lösning och överför lösningen inklusive zebrafiskar i lämplig behållare, till exempel en temporal bostäder bur.
Obs: Använd separata interimistiska behållare för prednisolon och DMSO behandlas alltid zebrafiskar, respektive, för att kontrollera DMSO kontroll zebrafiskar inte blir exponerade till prednisolon och vice versa. - Fyll glasbägaren med färska läkemedel innehållande fiskevatten (300 mL).
- Överföra zebrafiskar från interimistiska behållaren till den glasbägare innehållande färska inkubation lösning med en fisk netto. Sätta tillbaka folien för att undvika flykten av zebrafiskar.
- Om tiden för experimentet överstiger 2 veckor, utbyta glasbägare.
- Utfodring
- Mata inte zebrafiskar under korta behandlingar (för upp till 2 dagar). Under längre experiment, mata zebrafiskar. Var särskilt försiktig att undvika föroreningar av inkubering lösningen. Således, foder med Artemia ssp. snarare än med flake mat och bara varannan dag.
Obs: Artemia används regelbundet mata unga zebrafiskar, och bör vara tillgängliga i enheten zebrafiskar haltering.- Ungefär 2 h innan fisk vattnet byts, mata zebrafiskar med Artemia ssp i deras glasbägare. Att göra det, Använd en plast pipetten och matning 0,5 till 1 mL kläckt Artemia lösning per glasbägare.
- Vänta i 2 h och utbyta inkubation lösningen med färska läkemedel innehållande fiskevatten enligt avsnitt 4.1.
- Mata inte zebrafiskar under korta behandlingar (för upp till 2 dagar). Under längre experiment, mata zebrafiskar. Var särskilt försiktig att undvika föroreningar av inkubering lösningen. Således, foder med Artemia ssp. snarare än med flake mat och bara varannan dag.
5. analyser av prover
Obs: Efter inkubation av skadade zebrafiskar i prednisolon och DMSO som innehåller fiskevatten, respektive, antingen fullgöra ben mineralisering/förkalkning analyser (5,1 till 5,3) eller utföra live avbildning av zebrafisk under mikroskopet dissektion (5,4) 10,11,16. Använda live imaging att bestämma fin regenererar längd och att upptäcka skillnader i reporter genuttryck i transgena zebrafiskar.
-
Fixering av vävnader av intresse
- För fixering av fenor eller skallar förbereda 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS och frysa vid-20 ° C för lagring. Använd nyberedda 4% PFA i PBS eller Tina det erforderliga beloppet före användning. Alternativt 2% PFA i PBS kan användas.
FÖRSIKTIGHET: PFA är giftig och bör hanteras noggrant under ett dragskåp. Använd skyddskläder. - För fixering av fenor förbereda en liten petriskål (t.ex. 30 mm) med kall 4% PFA i PBS och kontrollera att botten av skålen är helt täckt. För fixering av skallar, förbereda en liten glasburk med lock eller en tub med kall 4% PFA i PBS.
FÖRSIKTIGHET: Handtag PFA innehållande lösningar endast under dragskåp eftersom det är giftigt. Använd skyddskläder. - Skörda vävnaden av intresse.
- För att skörda regenererande fin vävnad eller fenor med frakturer bedöva zebrafiskar enligt avsnitt 2.1 eller avliva zebrafiskar enligt avsnitt 5.1.5.
- Överföra de bedövat zebrafiskar till locket på en petriskål. Med hjälp av en skalpell eller rakblad, skörda den fin regenerera. Se till att inkludera stubbe vävnad i regenererande fenor för att underlätta hantering av skördade vävnad.
- Fixa fenor plant i den PFA som innehåller petriskål vid 4 ° C över natten. Platta fixering undviker curling av fin vävnad under fixering.
- För att fixa platta, greppa fin vävnad med en fin pincett på dorsala eller ventrala kanten av stubben och fördjupa det i fixering lösningen. Ta den motsatta kanten av stubben med en andra fina pincett och något tryck i vävnaden på botten av skålen.
- Håll i 10 till 20 s innan du släpper. Fin vävnad bör inte krypa upp längre. Om den gör det, upprepa.
- Euthanize zebrafiskar för att skörda skadade skalle vävnad. Förbereda en 100 mm diameter petriskål som innehåller 0,1% MS-222 i fiskevatten. Överföra en zebrafiskar i taget till MS-222 innehållande petriskål med hjälp av ett fiske som är netto. När nivå 6 av anestesi (medullär kollaps) nås väntar minst 10 minuter för att försäkra om döden av preparatet12.
- Med en skalpell avskurna huvudet plus en liten stam vävnad från resten av kroppen. Fördjupa den skördade vävnaden i beredda 4% PFA lösningen i glasburk eller plaströr. Fix för 24 h vid 4 ° C med mild gunga.
- För att lagra prover långsiktiga efter fixering, tvätta dem med PBS (3 x 20 min på RT) och metanol-behandla i en ökande metanol-serien (1 x 30%, 1 x 50%, 1 x 70%, 2 x 100% metanol i PBS för 20 min varje).
- Lagra dem i 100% metanol vid-20 ° C. Annars direkt fortsätta med ben färgning eller andra analyser efter tvätt med PBS.
- För fixering av fenor eller skallar förbereda 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS och frysa vid-20 ° C för lagring. Använd nyberedda 4% PFA i PBS eller Tina det erforderliga beloppet före användning. Alternativt 2% PFA i PBS kan användas.
-
Ben färgningsteknik jag (alizarin röda färgning)
Obs: Denna färgning utförs enligt van Eeden et al. 199617 och Walker & Kimmel 200718 med ändringar.- För att utföra alizarin röda färgning på vuxen fenor eller skallar, skörda och fixa vävnad som beskrivs i avsnitt 5.1.
- Om prover lagrades i metanol vid-20 ° C, rehydrera prover genom att göra en omvänd metanol serie (70%, 50% och 30% i PBS, varje 1 x 20 min) och tvätta två gånger 20 min med PBS. Tvätta prover för 5 min minsta med avjoniserat vatten.
- Att göra alizarin röda färgning i skallar, behandla prover med 50 mg/mL trypsin i 30% mättade Na2B4O7 i rumstemperatur över natten. Stenprover under denna tid. Skölj prover i 30% mättade Na2B4O7 lösning. Tvätta prover med avjoniserat vatten 2 gånger för 5 min varje. Detta steg utförs inte för fin vävnad.
- Lägg till alizarin röd lösning (del B: 0,5% alizarin Röd S pulver, 10% glycerol i avjoniserat vatten) och rock proverna under inkubation vid RT. Check för färgning efter 1, 2, 4 h eller över natten.
- Att rensa prover behandla dem med en minskande 1% Kalium hydroxid: glycerol serie (3:1 övernattning, 1:1 övernattning, 1:3 övernattningar).
- Lagra proverna i en 1:1 lösning av 0,1% kaliumhydroxid: 80% glycerol och montera dem med 80% glycerol för avbildning.
Obs: För kombinerad Alcian blue/alizarin röda färgning behandla prover med Alcian blå färgning lösning (del A: slutliga 0,02% Alcian blå, 50 mM MgCl2, 70% etanol) efter rehydrering (avsnitt 5.2.2) för 2 h på RT. behandla fenor med en minskande etanol-serie i 50 mM MgCl2 (70%, 50%, 30%, varje 1 x 15 min) och tvätta avjoniserat dem i minst 1 h (3 x 20 min) i vatten. Fortsätt med alizarin red färgning (avsnitt 5.2).
-
Ben färgningsteknik II (calcein färgning)
Obs: För att upptäcka kalcium nedfall i fin frakturer och skallskador, levande fisk inkuberas i calcein innehållande lösning.- Förbereda den nödvändiga mängden 0,2% calcein avjoniserat vatten (pH 7,5). Kontrollera pH är neutralt. Använda 1 M NaOH för att justera pH.
- Inkubera i upp till 3 zebrafiskar samtidigt i 100 mL calcein lösning för 20 min i en glasbägare täckt med aluminiumfolie.
- Överföra zebrafiskar till en bägare med fiskevatten. Låt dem simma kort innan du överför dem till en ny bägare med fiskevatten. Låt dem simma i denna nya bägare för 20 min att tvätta. Ta bilder (se avsnitt 5.4).
-
Live avbildning av zebrafisk
- Använd metoden för att förvärva bilder av regenererande benvävnad som i fin eller skallen hela experimentet utan att offra zebrafiskar. Bedöva zebrafiskar enligt avsnitt 2.1.
- För att förvärva bilder av fin regenererar, överföra de bedövat zebrafiskar på en agaros-belagd petriskål (se avsnitt 2.2.1 och figur 1B).
- Skaffa bilder av regenererande skalle ben, placera zebrafiskar upprätt i en svamp (figur 1 d) eller placera den i en agaros-belagd maträtt som har förberetts för att hålla stammen på zebrafiskar.
- Skaffa bilder på önskad förstoring och upplösning med en stereomicroscopic setup.
- Tillbaka zebrafiskar till en behållare med färska eller läkemedel innehållande fiskevatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det protokoll som presenteras här har använts flera gånger att inducera snabba benbildning i samband med förnyelse av zebrafisk fin och skalle10,11,16. I kombination med den presenterade metoden av prednisolon administration, kan studier på prednisolons effekter under ben regenerering bedrivas. Exempelvis kan studier av benbildning och mineralisering i regenerera utföras. Prednisolon, leder som andra glukokortikoider19,20, till total hämning av fin regenerering, inklusive benbildning, som upptäckts av alizarin röda färgning på fast stjärtfenan vävnad (figur 3A). Likaså har prednisolon en fördröjande effekt på (calvarial) skull skada förslutning, vilket kan illustreras av alizarin red (figur 3B) eller i vivo calcein färgning. Dessutom utövar prednisolon en djupgående antiinflammatorisk effekt i både fin och skalle vävnad, genom att utlösa apoptos i monocyt/makrofag härstamning. Minskad makrofag nummer kan upptäckas av immunohistokemi på fryst vävnad avsnitt, t.ex. genom att använda en anti-mcherry antikropp i transgena mpeg1: mCherry zebrafiskar (figur 3 c)10,21 . Likaså kan antalet, distribution, spridning och apoptos av andra celltyper sevärdheter både i den exo- och endoskeleton (t.ex. kotorna) analyseras med hjälp av immunohistokemi.
Figur 1 : Förfaranden som utförs i zebrafiskar. (A) resektion av stjärtfenan (amputation) i bedövat zebrafiskar med hjälp av en skalpell. Den röda streckade linjen visar den amputation. (B) Fin stråle fraktur i bedövat zebrafiskar utförs med en injektionsnål under stereomikroskopet. Fisken lägger på en agaros-belagd petriskål under förfarandet. Agaros-belagd petriskålar används också att förvärva bilder av zebrafisk fenor under regenerering eller reparation. (C) Trepanation av calvariae (skallbasen skada) utförs i anaestetized zebrafiskar med hjälp av en microdrill under stereomikroskopet. (D) bild förvärv av regenererande skallbenet efter skada. De bedövat zebrafiskar placeras upprätt i en svamp och bilder förvärvas med hjälp av ett stereomikroskop. Petriskål är fylld med fiskevatten som innehåller 0,02% MS-222. (E) inkubering av zebrafisk i prednisolon eller DMSO som innehåller fiskevatten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Mikroskopiska live-vyn av skador vid 0 h post skada hpi). (A) amputera stjärtfenan. Skalstapeln = 200 µm. (B) Fractured fin stråle. Frakturen indikeras av den röda pilen. Skalstapeln = 100 µm. (C) Trepanated skalle. Skadan webbplats indikeras med vita pilspetsen. Skalstapeln = 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Representativa resultat av prednisolon behandling i vuxen zebrafiskar. (A) Alizarin röd färgade fin regenererar på 14 dagar post amputation (dpa) och dagars behandling (dt). Prednisolon behandlade fin regenererar är kortare (visas inte) och en mindre domän för alizarin red positiva benmatrix upptäcks. Skalstapeln = 500 µm. (B) Alizarin red målade dödskallar på 7 dagar post skada (dpi) och dt. Skalstapeln = 100 µm. Denna siffra har modifierats med tillstånd10. (C) Cryosection Visa av oskadd skalle och hjärnvävnad behandlade (prednisolon) och obehandlade (DMSO) Tg (mpeg1: mCherry) x Tg (osterix: nGFP) transgena reporter fisk, där makrofager (innate immuna celler) är märkta i rött 21 och ben bilda osteoblaster märks i grön22. Antalet makrofager sjunker avsevärt i prednisolon behandlas zebrafiskar. Immunohistokemi utfördes enligt beskrivningen i Geurtzen et al. 10. kärnor är märkta i blått (DAPI). Skalstapeln = 20 µm. BF: ljusa fält, epid: epidermis, bn: ben. Denna siffra har modifierats med tillstånd10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafisk har visat sig användbara i skelettet forskning i många avseenden. Valda mutanter härma aspekter av mänskliga sjukdomar såsom osteogenesis imperfecta eller artros23,24,25,26,27, och larver samt skalor som används för att identifiera ben anabola föreningar i liten molekyl skärmar7,28,29. Behandlingar av zebrafisk med droger som används i klinisk praxis är dessutom idealiska för att studera förmodade negativa effekter, till exempel i benvävnad. I detta sammanhang är förekomsten av snabbt regenererande ben fördelaktigt att undersöka de bakomliggande mekanismerna av medicinering-inducerad ben brister. Här presenterar vi ett protokoll där läkemedelsbehandling med glukokortikoid prednisolon, ett vanligt förekommande antiinflammatoriskt läkemedel med biverkningar i benvävnad, kombineras med vuxen ben regenerering regimer. Detta protokoll har framgångsrikt använts för att framkalla immunsuppressiva och ben hämmande effekter i regenerativa vävnader i zebrafiskar och kan även anpassas för studier om effekterna av prednisolon och andra droger i adult vävnad såsom ryggraden. Följande uppgifter bör beaktas när immunsuppressiva läkemedelsbehandlingar utförs i zebrafiskar genomgår fin eller skalle regenerering.
Reproducerbarhet av skada analyser
Under fin regenerering beror regenerering hastighet (dvs återväxt av fin vävnad, inklusive ben, per tidsenhet) mycket på mängden fin vävnad som opererande13. För att undvika oönskade variationer i fin föryngring, se till att alltid resect motsvarande mängder fin vävnad i alla exemplar.
Utförandet av beniga fin stråle frakturer utförs av något driver en injektionsnål på mitten av ett valt beniga fin stråle segment. Som beniga fin strålar består av 2 motsatta hemirays, bestämmer mängden tryck som används om endast en eller båda hemirays är brutna. Vi föredrar att tillämpa lågtryck till fraktur endast en hemiray, eftersom fraktur av båda hemirays tenderar att destabilisera den fin stråle, som därmed kan lossna under de följande dagarna.
Calvarial skador av skallen av microdrilling bör utföras med försiktighet. Om skadan är skedd till hjärnan (dvs lillhjärnan) postural och motoriskt blir underskott uppenbart av oberäkneligt simning av preparatet15. Zebrafiskar med cerebellär skada kan visa biverkningar av läkemedelsbehandling och bör inte användas för att studera ben.
Överväganden om läkemedelsbehandlingar
För att producera en konsekvent immunhämmande och anti regenerativ effekt i vuxen zebrafiskar anställer vi en dos av 50 µM prednisolon i fiskevatten. Vi identifierat denna dos under inledande dos-respons experiment i larver och vuxna zebrafiskar. Dos-respons experiment bör således utföras för att identifiera den erforderliga dosen av andra immunsuppressiva medel som kan användas. För vuxna, rekommenderar vi att kombinera dessa inledande experiment med fin regenerering regimen, som fin regenererar längd är en mycket känslig och lätt att identifiera avläsning för vävnad förändringar.
Immunsuppressiv behandling predisponerar behandlade prover till mikrobiella infektioner. Samma hölje i Ånghärdad bägare som innehåller Ånghärdad fiskevatten är därför viktig. Även om dessa villkor är mer besvärliga att genomföra och inte är sterila, hjälper de till att minimera infektion i behandlade zebrafiskar. Vi inte förbehandla ('sterilisera') Artemia ägg. Detta kan dock vara en ytterligare åtgärd för att förhindra infektioner hos zebrafiskar, om det behövs. Antiseptiska ämnen såsom metylenblått (1%) kan dessutom läggas till fisk vatten före användning.
Experiment med prednisolon, både kort- och långsiktiga, kräva dagliga förändringar av fiskevatten. Vi har behandlat vuxen zebrafiskar för upp till 8 veckor. Behandling av ett stort antal individer för så lång tid kan leda till en viss experimentell 'börda' och bör planeras noggrant. Det är avgörande att alltid ha de krävda mängderna av Ånghärdad fisk vatten och glas ware redo. Trots detta inte har testats i zebrafisk (såvitt vi vet), kan implantation av långsam frisättning pellets för droger av intresse representera ett värdefullt alternativ för långvarig läkemedelsexponering i zebrafiskar.
Analyser i transgena zebrafiskar
Här presenterar vi 2 metoder att färga för mineralisering/förkalkning av ben vävnader av alizarin red och calcein färgning. Dessutom visar vi hur du bild regenererande fin och skalle vävnad i vivo med hjälp av ett stereomikroskop. Den sistnämnda tekniken är mycket användbar, om transgena zebrafiskar rapportering numret eller aktivitet av markerade celler, såsom osteoblaster eller immuna celler, är att avbildas. Exempelvis innan att offra skadade och behandlades med prednisolon zebrafiskar att utföra alizarin röda färgning, fin regenererar eller trepanated skallar som genomgår reparation kan fotograferas för att leta efter närvaro, antalet och aktiviteten av ben bilda osteoblaster i raden transgena reporter Tg (osterix: nGFP)22. Jämväl, epidermal sårslutning, vilket sker inom en dag, kan visualiseras i transgena fiskar, som uttrycker en fluorophore i epidermal tissue. Dessutom kan ansamling av immunceller på platsen för skadan (eller deras frånvaro i prednisolon behandlade individer) övervakas enkelt med ett stereomikroskop utrustad med nödvändiga ljuskälla och filter.
Sammanfattningsvis kan protokollet presenteras här användas för att studera effekter av immunsuppressiva medel och andra droger efter systemisk administrering hos zebrafiskar som genomgår bone regeneration antingen i fin eller skalle. Detta kommer att vara användbart att avgränsa patogenesen av GIO och att undersöka mekanismerna bakom framgångsrika ben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Här studien har finansierats genom ett bidrag av regenerativ terapier Dresdens centrum (”zebrafiskar som en modell att riva upp mekanismerna av glukokortikoidinducerad benförlust”) och dessutom genom ett bidrag på den Deutsche Forschungsgemeinschafts (Transregio 67, projekt 387653785) till FK. Vi är mycket tacksamma att Jan Kaslin och Avinash Chekuru för deras vägledning och hjälp på utför trepanation av calvariae och frakturer i beniga fin strålar. Experiment designades, utförs och analyseras av KG och FK. FK skrev manuskriptet. Vi vill också tacka Katrin Lambert, Nicole Cudak och andra medlemmar av de Knopf och varumärke labs för tekniskt bistånd och diskussion. Vårt tack går också till Marika Fischer och Jitka Michling för utmärkt fisk vård och Henriette Knopf och Josh Currie för korrekturläsning manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3 mm x 13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
- Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Paul, S., Crump, J. G. Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish. Bonekey Reports. 5, 853 (2016).
- Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases. Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).
- den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis. Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- de Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).
- Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale. International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).
- Geurtzen, K., et al. Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues. Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).
- Geurtzen, K., et al. Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull. Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hirasawa, T., Kuratani, S. Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development. Zoological Letters. 1, 2 (2015).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Knopf, F., et al. Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin. Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Oppedal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Spoorendonk, K. M., et al. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- Gioia, R., et al. The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta. Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).
- Fiedler, I. A. K., et al. Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
- Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).
- Hayes, A. J., et al. Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis. PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).
- Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).
- de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).
