Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

CD4 yalıtım+ T-hücreleri ve T foliküler Yardımcısı (cTfh) hücre alt kümeleri üzerinden periferik kan kullanarak 6-renk Akış Sitometresi Analizi, dolaşan

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58431
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Leicester Cancer Research Centre and Ernest and Helen Scott Haematology Research Institute, University of Leicester, 2MRC Toxicology Unit, University of Leicester

Summary

Burada, yalıtım ve CD4 karakterizasyonu için bir protokol+ T hücre alt kümeleri insan periferik kandan açıklanmıştır. Saf CD4+ T-hücreleri tarafından akış sitometresi T foliküler yardımcı hücresi alt kümeleri oranlarını belirlemek için analiz.

Abstract

Anormal T foliküler yardımcı (Tfh) hücre faaliyet otoimmün koşullarda tespit ve B hücreli non-Hodgkin Lenfoma lenf nodu microenvironment analiz zaman onların varlığı klinik sonuçlar ile ilişkilidir. Foliküler T yardımcı hücreleri (cTfh), dolaşımdaki bellek kartı yuvası Tfh hücrelerinin kan dolaşan alt kümeleri hastalığında da tedirgin ve bu nedenle potansiyel yeni akıllı biyolojik temsil eder. Çünkü nispeten non-invaziv ve basit seri izleme sağlar periferik kan tabanlı test avantajlıdır. CD4 izole bir yöntem bu makalede+ T-hücreleri insan kanı ve daha fazla analiz tarafından cTfh hücreleri ve çeşitli alt grupları oranlarını numaralandırmak için akış sitometresi (cTfhPD-1-/ + / Merhaba, cTfh1, 2, 17 ve cTfh1/17). Şu alt kümeleri düzeyini, normal konular ve hastalar arasında lenfoma ile karşılaştırıldı. Yöntem rutin olarak toplanan hasta malzemeden güvenilir sonuçlar elde etmek için sağlam olduğunu ortaya koymuştur. Biz analiz için tarif tekniği kolayca cep sıralama ve RT-PCR gibi aşağı akım uygulamaları için adapte edilebilir.

Introduction

Foliküler T yardımcı hücreleri (Tfh) olan bir CD4+ başlangıçta lenfoid doku1' karakterize edildi T-hücre alt. Bu hücreler PD-1 ve CXCR5 yüzey reseptörlerinin ifade, IL-21 ve Il-4 salgılar ve transkripsiyon faktörü, BCL-62,3nükleer ifade gösterir. Onların adından da anlaşılacağı gibi germinal merkezleri bulunur ve yüksek afinite antikor üretim1için gereklidir.

Dysregulated Tfh yanıt-e doğru hastalık patogenezinde, burada autoreactive B hücreleri4genişlemesi teşvik en önemlisi otoimmün hastalık karıştığı olmuştur. Onlar da sağlam5,6 ve lenfoid kanserleri7tümör microenvironment bir rol oynamaktadır. Tersine, insan immün yetmezlik sendromları8indüklenebilir T-hücre costimulator (ICOS) sonucu gibi yüzey proteinleri Tfh için gerekli genetik kusurların işlev. CD4+ CXCR5+ insan periferik kan hücrelerinde foliküler T yardımcı hücreleri (cTfh) dolaşan denir ve bellek kartı yuvası Tfh hücre dokuları9olduğuna inanılmaktadır. Burada anlatılan yöntemin amacı CD4 takip cTfh alt kümeleri analizidir+ hücre izolasyon periferik kan örneklerinden.

Birkaç cTfh alt kümelerini tanımlanan ve B-hücre yardım hangi ile sağladıkları verimlilik bir alt başka bir9' a,10,11,12farklıdır. Şu alt kümeleri göreli oranlarını en belirgin otoimmün hastalık hangi orada olduğunu hemen hemen her zaman daha işlevsel PD-1 göreceli artış çeşitli hastalıklar, değiştirilmiş+/ Merhaba ve/veya cTfh2 veya cTfh17 alt kümeleri ile karşılaştırıldığında daha az fonksiyonel PD-1- ve/veya cTfh1 alt kümeleri12. Sık sık bu değişiklikleri kapsamını ilişkilendirmek bir potansiyel rolünü, cTfh alt dağıtım hastalığında Tfh içinde faaliyet yansıtabilir prognostik bir biyomarker olarak belirten hastalık aktivite ve antikor titreleri dahil olmak üzere klinik parametrelerle lenfoid doku9,12,13,14. Ayrıca, katılımcıların kan örnekleri alarak hızlı, güvenli ve kabul edilebilir ve çok hastalık ilerleme veya tedaviye yanıt analizi için izleme seri sağlar.

İzole CD4 kullanımı+ T-hücreleri üzerinde geleneksel periferik kan mononükleer hücre (PBMNC) süspansiyonlar cTfh hücre analizi için önemli bir sayı elde etmek için gereken süreyi azaltarak daha yüksek üretilen iş akış sitometresi deneyler sağlar. Nadir cTfh alt kümeleri akışı kullanarak hücrelerden sıralama (FACS) sıralama hücre aktif hale getirildiğinde bu özellikle yararlıdır. Verimliliği yardımcı olmak için bu süspansiyonlar "örnekleri akış sitometresi deneyde kullanılacak toplu iş oluşturma özelliğinin" etkinleştirmek için cryopreserved. Sınama, CD4+ saflık değil dondurma tarafından düşürüldü.

CTfh hücreleri kendi keşif yöntemi erken dönemlerinde kategorize etmek için kullanılan farklı laboratuvarlar farklı işaretleri burada sunulan iki grup olarak Schmidt vd.12, tarafından önerilen hücre yüzey işaretlerinin birleştirilmiş planı yapar kullanın eşzamanlı kimlik cTfh ve bir tek akış sitometresi içinde dokuz tanınan alt grupları etkinleştirmek için 15 deneme.

Tek hücre yüzey işaretleri kullanılan olarak hücreleri fiksasyon veya permeabilization gerekmez ve böylece aşağı akım fonksiyonel çalışmaları için hayatta kalabilir. Bu hücre FACS ile aynı antikor paneli kullanarak sıralama kolaylaştırılmış olacak. Bu panel için kullanılan akış sitometresi kısıtlamalar izin diğer işaretler, kapsayacak şekilde genişletildi.

Çok renkli akış sitometresi deneyler Analizi 2 boyutlu nokta araziler üzerinde özellikle ne zaman hücre popülasyonlarının net bı kalıcı dağıtım olarak işaret floresans içinde yok perdeleme doğal olarak öznel olması nedeniyle zor olabilir cTfh hücreleri ve alt grupları için durum. Bu nedenle, örneğin alınma olasılığını daha iyi çözünürlük etkinleştirmek için ve stratejileri güvenle geçişi ayarlamak için el eşyaları azaltmak için etkili denetimleri ayarlama zorunludur. Bu nedenle, antikor panel tasarım ve temel akış sitometresi denetimlerinde up, yani, değerinin kullanılması deneme ve FMO denetimleri özetlenen adım 3.4.2 ve 3.4.3,respectively.

Tüm cTfh hücreleri CD4 tanımlanan+ CXCR5+ CD45RA-. Alt kümelerine PD-1-, PD-1+ veya PD-1Merhaba cTfh hücreleri tanımlamak için ifade karakteristik Tfh harekete geçirmek işaretin PD-1 düzeyde sonra belirlenir. O zaman, kemokin reseptörleri CXCR3 ve CCR6 bir arada kullanarak, hangi differentially ifade tarafından geleneksel Th1, 2 ya da 17 hücreleri, cTfh cTfh1, 2-17 gibi CXCR3 bir profil tarafından olarak karakterize edilebilir+ CCR6-, CXCR3- CCR6- ve CXCR3- CCR6+, anılan sıraya göre.

Bizim laboratuvar tarafından kullanılan antikor paneli Tablo 1' de görüntülenir. Kullanıcı lazer ve ışık filtresi yapılandırması için kendi yerel akış sitometresi kullanılabilir hesap için kendi fluorophore seçimi adapte olabilir.

Aşağıdaki önemli noktalar fluorophores seçimi etkiler. Parlak fluorophores mümkün olduğunda kullanın. Özellikle, en parlak kullanılabilir fluorophores üzerinde dimmest (daha az yüksek ifade) işaretleri kullanın. PD-1, CXCR3 ve CCR6, dimmer işaretleri içerir ve daha az bir ölçüde, CXCR5. Özellikle yeni BB, BV ve BUV kullanmak yapılmış mükemmel parlaklık sağlamak ve böylece hücrelerin farklı nüfusun daha kolay çözünürlüğünü etkinleştirmek fluorophores.

Fluorophore seçim spektral örtüşme ve böylece gerekli tazminat düzeyini en aza indirmek mümkün olduğu kadar emisyon spectra arasında yayıldı. Akış Sitometresi Bölmesi tasarlamaya yardımcı olmak için kullanılan ücretsiz, online alet-ebilmek bulunmak burada: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Emisyon spektrumda yer kazanmak için bir "döküm kanal" ikisi de öldü algılama (ve dışlanma) etkinleştirmek için bu APC-H7 (CD45RA için Birleşik) ile örtüşen bir emisyon dalga boyu ile bir canlılık boya kullanarak çalıştırmaya başladık ve/veya CD45RA+ kullanarak bir tek dedektör.

Burada, bir protokol yalıtım+ T-hücrelerinin periferik kan CD4 ve onların daha sonraki analiz için farklı ve son zamanlarda açıklanan alt kümeleri dolaşan oranlarını belirlemek için akış sitometresi tarafından sunulur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Kan örnekleri normal bir konu (NS) elde (n = 12) yanı sıra marjinal zon Lenfoma (MZL) olan hastalar (n = 7) ve B hücreli non-Hodgkin Lenfoma (BNHL) (6 FL hastalar, 2 lymphoplasmacytic lenfoma hastaları ve 1 düşük dereceli B-hücre diğer türleri Non-Hodgkin's lenfoma değil Aksi takdirde hasta belirtilen). Sonra verilen bilgili, tüm çalışmaları için yerinde etik onayı ile yazılı izni hastalar Leicester Royal revir, Hematoloji Kliniği gelen işe. Etik onay Leicestershire, Northamptonshire ve Rutland Araştırma Etik Komitesi 1 ' başvuru 06/Q2501/122 hasta örnekleri ve sağlık araştırma yetkilisi (HRA) NRES Komitesi East Midlands-Derby tarafından elde edildi, 14/EM/1176 için referans normal konular.

1. yalıtım CD4+ T-tüm ikincil kan hücrelerinden

  1. Taze kan periferik (2-15 mL) K2EDTA tüpler içine almak standart iz ve en kısa zamanda en büyük canlılık korumak için işlem.
    Not: Standart laboratuvar kişisel koruyucu ekipman (ceket, eldiven, gözlük) kullanın ve bir sınıf II Biyogüvenlik kabini çalışmalarında yürütmek.
  2. Kan ve tüm gerekli kimyasalları getirmek (CD4+ zenginleştirme kokteyl, % 2 fetal Sığır serum/tamponlanmış fosfat serum (FBS/PBS), yoğunluğu degrade medya ve hücreleri cryopreserving Eğer donma orta) Oda sıcaklığında için.
  3. Mix kan antikorlar insan CD4 zenginleştirme için piyasada bulunan bir kokteyl ile+ T hücreleri. Reaktif 50 µL kan her 1 mL-için kullanın. 50 mL konik polipropilen boru için 5 ila 15 mL kan kullanın.
    Not: 2-4 mL kan kullanıyorsanız, bu adımı bir 14 mL konik Polipropilen tüp içinde gerçekleştirin.
  4. Karışımı, oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
  5. Karışımı eşit bir birimdeki % 2 oranında seyreltin FBS/PBS
  6. Yavaş yavaş arabirimi rahatsız edici önlemek ve hemen yoğunluk gradient orta içine kan difüzyon önlemek için Santrifüjü geçin yoğunluğu degrade medya üstüne seyreltilmiş bu karışımı katman.
    1. 2-3 mL kan yoğunluk gradient orta 3 mL 14 mL konik polipropilen boru, ancak 4 mL kan kullanımının, yoğunluk gradient orta 4 mL 14 mL konik polipropilen boru ve 5-15 mL kan için kullanın , yoğunluk gradient orta 15 mL 50 mL konik polipropilen boru içinde kullanın.
  7. 1200 x g de 20 dk için katmanlı karışımı ile fren off 20 ° C'de santrifüj kapasitesi
    Not: Altındaki ortam sıcaklık kırmızı kan hücreleri ve granülosit ile kirlenme neden olabilir. Daha düşük bir hız CD4 neden olur+ yalıtım işleminin başarısız olmasına. Nişanlı sonu bırakarak hücre verim azalır. Bir tezgah üst santrifüj aerosoller önlemek için kapalı rotorlar ile kullanın.
  8. Zenginleştirilmiş CD4 kaldırmak+ hücre katmanı Pasteur pipet kullanarak arabirim üzerinden.
    Not: Zenginleştirilmiş hücre katmanı bir standart "buffy kat" beyaz bulutlu hücre ama sadece CD4 olarak benzer+ hücreleri mevcut, bu doğal olarak daha küçük ve daha zor görmek için olacak.
  9. % 2 eklemek FBS / CD4 PBS'ye+ hücreleri toplam hacmi 10 mL ve % 2 ile iki kez daha sonra yıkama kadar 10 dk 400 x g de her yıkama sırasında centrifuging tarafından FBS/PBS.
  10. Pelet % 2 resuspend FBS/PBS ve sayısı hücreleri hücre sayıları ve canlılığı belirlemek için bir hayati boya ile (trypan mavi) lekeli.
  11. İsteğe bağlı adım: 5 x 105 1 mL aliquots (FBS % 10 dimetil sülfoksit) ortamda dondurma 1 x 106 hücrelere resuspend.
    Not: Düzeyleri bazı yüzey işaretlerinin cryo-koruma ve çözme tarafından değişmiş olabilir. Bu nedenle, olan çok önemli tüm örneklerini sürekli olarak işlenir. Analitik değişkenleri farklılıkları en aza indirmek için örnekleri cryo korunmuş ve analiz bu çalışmada için toplanmış.

2. akış sitometresi

  1. Cryopreserved CD4 çözülme+ hücreleri hızlı bir şekilde 37 ° C ve yıkama bir kez içinde önceden ısıtılmış orta (RPMI 1640 + L-glutamin %10 FBS ve 1 x penisilin-streptomisin) adlı bir su banyosunda.
  2. Orta, santrifüj 400 x g de 5 min için 9 mL hücreleri eklemek ve süpernatant kaldırın.
  3. PBS içinde % 1 sığır serum albümin (BSA) hücrelerde resuspend (50 µL) her koşulu test edilmesi için kullanır, böylece 5 x 105 ve 1 x 106 hücreler arasında.
  4. Hücreleri boyama arabellek ile karıştırın (50 µL).
    Not: İki veya daha fazla BV veya BUV lekeleri bu boyalar doğal kimyasal özellikleri sayesinde aynı anda kullanıldığında bu veri analizi ile girişime neden olabilir çeşitli boyama eserler parlak leke arabellek engel olur. Tek veya günahı koşullarda parlak leke arabellek 50 µL % 1 50 µL için yedek olabilir BSA/PBS.
  5. Antikorlar hücreleri (göre "kullanılan birim" sütun içinde tablo 1) ekleyin ve buz 30 dk için karanlıkta kuluçkaya.
  6. % 1'i iki kez hücrelerde yıkamak için 600 x g de 3 dk her yıkama sırasında centrifuging tarafından BSA/PBS.
  7. % 1'resuspend BSA/PBS (400 µL) ve bir akış sitometresi edinme tüp aktarmak.
  8. Girdap yavaşça bir akış sitometresi verileri alınıyor önce hücreleri:

3. akış sitometresi denetimleri ve kurulum

  1. Günahı bir örnek kullanarak, fotodiyot gerilimleri lenfositler bariz enkaz ve ölü hücreleri (yüksek dağılım (SSC) ve düşük ileri dağılım (FSC) alan olayları)16ayrılmış şekilde ayarlayın. Pozitif floresans gelen tüm olayların içinde tespit ölçekli Güz emin yaparken arka plan floresans ayırt edilebilir tek kullanarak örnekleri, lekeli photomultiplier (PMT) gerilimleri ayarlayın.
    Not: En düşük voltaj optimum çözünürlük ("Zirve 2" yöntemi19) bulmak için loş floresan boncuk kullanarak her Devresel_ödeme için Devresel_ödeme gerilim karşı CV çizilecek bir gelişme olur.
  2. Hesap yakalama boncuk ile tek lekeler kullanarak tazminat matris oluşturarak spektral örtüşme. Piyasada bulunan tazminat boncuk (60 µL) ve negatif kontrol boncuk (60 µL) % 1'e Ekle BSA/PBS (100 µL) ve girdap.
    Not: Kullanılan yakalama boncuk ana türler ve kullanılan antikor IgG izotip eşleşmesi gerekir. Herhangi bir tandem çok sayıda değişiklikleri, boya Eğer onlar kendi emisyon spectra arasında çok önemli ölçüde değişkenlik görüntüleyebilirsiniz tazminat matris yeniden hesaplanan olmalı.
  3. Bir tek antikor (20 µL) ve girdap ekleyin.
  4. 30 dk için karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya.
  5. Vasıl 200 x g 10 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  6. 1%BSA/PBS içinde resuspend (500 µL) ve girdap.
  7. Örnek bir akış sitometresi edinme yazılım üretici yönergelerine göre belirlenen tazminat matris jeneratör kullanarak elde.
  8. Arka plan floresans deneylerde ≥4 Renkler16kullanarak ana kaynağı olan, boya dökülür hesaba olumlu işaret floresans geçitlerini yerleştirme kılavuzunu FMO denetimleri kullan. Adım 3'deki ama her koşul için açıklandığı gibi protokol genel hücre yüzey boyama takip atlayın bir boyama adım fluorophores (CD45RA atlanmış yerde, aynı zamanda canlı/ölü leke atın). Her koşul için 100.000 lenfositler elde etmek.
  9. Kapı pozitif hücrelerinin ≤0.5% ayarlamak. Şekil 2 resimli FMO denetimleri örneği için bkz.

4. veri analizi

  1. Akış Sitometresi'nın satın alma yazılım bir eşik 5000 Birim çok küçük enkaz dışlamak için FSC parametresini ayarlamak için kullanır.
  2. 10.000 cTfh hücreleri elde etmek için bir durdurma kapı kullanmak (CD4+ CD45RA- CXCR5+).
    Not: Bireysel kullanıcı 10.000'den fazla hücreleri toplar. Bu numara anlamlı sonuçlar ve koleksiyon için geçen süre sağlamak için yeterince hücre toplama arasında bir uzlaşma oldu.
  3. FSC alanõ kullanarak / SSC-alan nokta arsa, enkaz hariç ederken lenfositler nüfusu seçmek için bir elips veya Çokgen kapı çizmek ve açıktan açığa ölü hücreleri (olayları bir yüksek SSC-alanı ve düşük FSC-alan).
  4. FSC alanõ kullanarak / FSC-genişlik nokta arsa, Çiz Çokgen bir kapı ise (birini var ama benzer genişliği artan bir alan tek hücrelere) birini hariç tek hücreleri seçmek için.
  5. FSC alanõ kullanarak / CD45RA ve canlılığı marker nokta arsa, canlı, CD45RA seçmek için dikdörtgen bir kapı çizmek- hücreleri (Bu işaretçi için düşük bir floresan hücreleri).
  6. FSC alanõ kullanarak / CD4 nokta arsa, CD4 seçmek için dikdörtgen bir kapı çizmek+ hücreleri (Bu işaretçi için yüksek bir floresan hücreleri).
  7. Bir CD4 kullanarak / CXCR5 nokta arsa, CXCR5 seçmek için dikdörtgen bir kapı çizmek+ (yani cTfh) hücreleri (Bu işaretçi için yüksek bir floresan hücreleri).
  8. Bir CXCR3 kullanarak / CCR6 nokta arsa, dört bir kapı cTfh hücre cTfh1, daha alt bölümlere ayırma 2 ve 17 hücreler (her işaretçisi için yüksek ve düşük olan hücreleri).
    Not: Hücreleri CD4 fenotip ile+ CXCR5+ CXCR3+ CCR6+ ile karakterize olan kötü. Biz çünkü cTfh1/1718 bu hücrelere başvuran geleneksel yardımcı T hücreleri (CD4+ CXCR5-) bu CXCR3 Th1 ve Th17 Haritayı ifade ve CCR6 arasında geçiş ve cTfh1/1719tarif edilmiştir.
  9. PD-1 çubuk grafik kullanarak cTfh hücreleri daha alt bölümlere ayırma aralığı aracı kullanmak (veya tercih edilen, bireysel cTfh1 2, 17 veya 1/17 alt kümeleri) PD-1 içine-/ + veya Merhaba nüfus.
    Not: PD-1+ ve PD-1Merhaba arasında ayrım literatürde iyi tanımlanmış değildir. Eşik bona fide Tfh akış sitometresi ile aynı antikor panelini kullanarak tonsil insan lenfosit süspansiyonlar algılamak için gereken aynı PD-1 yoğunluk olarak kuruldu. Alternatif olarak, yalnızca PD1Merhaba hücreleri ICOS+olduğu gibi ICOS için bir işaretleyici antikor paneline eklenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yüksek CD4+ saflık elde CD4 kullanarak+ tüm kan örnekleri arasında güvenilir yalıtım Protokolü tarafımızca test (yani: %96.6, SD: 2.38, n = 31) (Şekil 3).

CTfh tanımlaması (CD4+ CXCR5+ hücreleri) konuda normal bir temsilcisi olan (Şekil 4A) sunulmaktadır. Toplam cTfh hücreleri CD4 içinde oranı+ hücreleri vardı %29.4 medyan değeri (arası DÖRTTEBİRLİK aralığı (IQR) 10,8 =) 12 normal konular arasında. Hepatosellüler karsinom17,20, sistemik lupus eritematöz11,21ve romatoid artrit11,14 dahil olmak üzere birçok farklı hastalıklar arasında birden fazla çalışmalar genel cTfh heathy denetimleri ve hastalar arasında bir fark algılama yeteneğini çakışan olmuştur. Hiçbir önemli farklılıklar arasında normal konular ve MZL veya BNHL hastalar (Şekil 4B)21genel cTfh bulundu.

PD-1 ifade içinde bir temsilcisi normal konu ve BNHL hasta karşılaştırma için cTfh hücrelerden tanımlaması Şekil 5içindeAgösterilir. PD-1 ifade normal konular (Şekil 5B)21MZL ve BNHL hastalarda anlamlı olarak daha yüksek. PD-1 ifade benzer artışlar birden çok otoimmün hastalıklar11,12,13,14' te gösterilmiştir.

CTfh1, 2, tanımlaması 17 ve 1/17 cTfh hücreleri bir temsilcisi normal konu CXCR3 ve CCR6 ifade kullanarak nüfusu içinde Şekil 6'Agösterilir. CTfh1 hücre oranı önemli ölçüde daha yüksek MZL ve BNHL hastalarda normal konular (Şekil 6B)21.

Figure 1
Resim 1 : CTfh hücreleri ve alt grupları tanımlamak için kullanılan genel gating strateji Illustration. Üst soldan, lenfositler nüfusu ayırt edilirler ve birini hariç tutulur. CD45RA canlı- hücreleri "döküm kanal" kullanarak seçilir. CD4+ hücrelere geçişli ve CXCR5+ hücre cTfh tanımlanır. cTfh cTfh1, 2-17 gibi CXCR3 ve CCR6 ifade kullanarak bölünmüş. PD-1 ifade şu alt kümeleri içinde o zaman ayrılır. Temsilcisi normal konu kan örneği alınan rakamlar. FSC-A, FSC alan; SSC-A SSC alan; FSC-W, FSC genişliği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : FMO illüstrasyon denetler. Her biaxial akış sitometresi Arsa CD4 gösterir+ ile tüm fluorophores lekeli hücreleri floresan pozitifliği ayarlanabilir en azından hangi kapıları göstermek için faiz biri hariç. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : CD4 tanımlaması gösterilen biaxial akış sitometresi Arsa + hücreleri lenfositler yaşamak için geçişi sonra. Temsilcisi normal konu kan örneği alınan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : CTfh hücreleri tanımlaması. (A)Biaxial akış sitometresi Arsa CXCR5 gösterilen+ ifade CD4 için geçişli hücrelerde+ CD45RA-. Bir temsilcisi normal konu alınmış. (B) cTfh toplam CD4 içinde göreli yüzde+ hücreleri normal bireylerde (n = 12), MZL (n = 7), BNHL (n = 9). Yatay çizgiler ortanca gösterir ve hata çubukları arası DÖRTTEBİRLİK aralığı gösterir. Hiçbir önemli farklılıklar Mann-Whitney U testi kullanılarak gruplar arasında bulundu. Bu rakam Byford vd.21değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : PD-1 ifade ve cTfh hücreleri ile ilişkisi. (A)akış sitometresi histogram PD-1 ifade içinde toplam cTfh hücreleri belirlemek için kullanılır. Temsilcisi normal konu ve BNHL hasta alındı. (B) PD-1+ toplam cTfh hücrelerin bir kısmı hücreleri. Yatay çizgiler ortanca gösterir ve hata çubukları arası DÖRTTEBİRLİK aralığı gösterir. Medians çoğu önemli ölçüde (Mann-Whitney U-testi) normal konular arasında farklı (%21,5, IQR 10,8, n = = 12) ve lenfoma hastaları (MZL %54.1, IQR 21,2, n = 7, p = 0.0008 ve BNHL = %45.2, IQR 11,4, n = 9, p = 0,0003 =). Bu rakam Byford vd.21değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : CXCR3 ve CCR6 ifade ve cTfh1 sayı ile ilişkilerini. (A)Biaxial akış sitometresi Arsa CXCR3 ve CCR6 ifadesi CD4 üzerinde gösterilen+ CD45RA- CXCR5+ hücreleri. Temsilcisi normal konu ve BNHL hasta alındı. (B) cTfh1 hücreleri toplam cTfh hücre yüzdesi olarak. Yatay çizgiler ortanca gösterir ve hata çubukları arası DÖRTTEBİRLİK aralığı gösterir. Medians çoğu önemli ölçüde (Mann-Whitney U-testi) normal konular arasında farklı (%20,8, IQR 6,7, n = = 12) ve lenfoma hastaları (MZL %32,1, IQR 6.8, n = 7, p = 0,013 ve BNHL = %35,4, IQR % 7.6, n = 9, p = 0.0056 =). Bu rakam Byford vd.21değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Table 1
Tablo 1: akış sitometresi antikor paneli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu iletişim kuralı periferik kan cTfh hücreleri, literatürde şimdiye kadar tanımlanan tüm ilgili alt kümeleri algılanmasını sağlayan analiz etmek için basit ve verimli bir şekilde temsil eder. Standart out-hasta klinikler ve seri örnekleri parçası klinik veri ile paralel olarak toplanabilir gibi kan örneklerini kolayca ve verimli bir şekilde elde edilebilir. Buna karşılık, bu prospektif çalışmalar hastalık ilerleme veya tedaviye yanıt için biyolojik olarak cTfh alt kümeleri değerlendirmek sağlar. Bu çalışmalar özellikle nerede Tfh bozukluk otoimmünite ve sağlam ve hematolojik kanser belirli türleri gibi patogenezinde karıştığı hastalığında garanti. Buna ek olarak, cTfh işlevi hastalığında değişimler cTfh hücreleri tek hücre yüzey işaretleyicileri bu protokol için kullanılan olarak akış sitometresi kullanarak sıralama tarafından soruşturma. CTfh hücre MZL hastalarda sıralama ne zaman normal konular21' e göre ifade profilleri gen farkları bulun sağladı.

Bu verimli bulduk CD4+ T hücre izolasyon geliştirilmiş veri analizi. Santrifüj fren ve hız gibi küçük sorunlar yalıtım yordamına kritik olduğu için adımları ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Tazminat ve FMO denetimleri ayarlamak için tüm Akış Sitometresi Analizi, gelince diğer önemli adım olduğunu.

CTfh hücreleri üzerinde PD-1 ifadesi değişir ve en yüksek PD-1 içeren hücreleri en işlevsel ve bu nedenle özellikle otoimmün hastalık11,12çalışma için uygun olabilir. Literatürde tanımlanan standart limitsiz olarak kapıyı PD-1Merhaba hücreleri, aktif cTfh alt tanımlanması için karar vermek için bir önemli konu oldu. Bu önemli ama küçük alt küme küme muhtemelen etkin Tfh farklılaşma lenfoid doku11yansıtır. Bu zorluğu aşmak için böyle aynı antikor paneliyle insan bademcik bona fide Tfh hücrelerden algılamak için gereken aynı eşik kuruldu. Bademcikler elde bazı kullanıcılar için sorunlu olabilir anlıyoruz. Başka bir seçenek, yalnızca PD-1Merhaba hücreleri ICOS+ 12olduğu gibi bu protokol için anti-ICOS, ek tarafından kullanılan antikor panel genişletmek için olurdu.

Burada, yüzey işaretleyicileri CD4 dolaşan karakteristik algılamak için bir antikor paneli mevcut+ T-hücreleri. Dolaşımdaki T foliküler düzenleyici hücreleri (CFTR) kan bellek kartı yuvası hücrelerin lenfoid doku içinde ikamet ve germinal Merkez tepki22,23 düzenlenmesinde önemli rollere sahip T-foliküler Düzenleyici (Tfr) vardır . CFTR çoğu kan CD4+ CXCR5+ hücreleri transkripsiyon faktörü FoxP3 de dahil olmak üzere bu ortak express T-regülasyon hücre işaretleri. CFTR cTfh yanında ölçme germinal Merkez faaliyete daha kapsamlı bir resmi sağlayabilir ve bir biyomarker kendi doğru24hastalığında mevcut. CFTR sayılar doğal olarak düşük olmakla birlikte (demek: %1,82, SD: 1,40, n toplam CD4 24 =+ hücreleri kendi deneyleri), CFTR cTfh ayıran cTfh analiz özgüllük de artırmak. Bizim panel CD25 ve CD12725 gibi bir kombinasyon belirli düzenleyici T hücre yüzey işaretlerinin ekleme ek olarak tüm cTfh alt kümeleri çok benzer bir iletişim kuralı kullanılarak aynı deneyinde CFTR tespiti sağlayacak. Bu fiksasyon ve aşağı akım fonksiyonel deneyleri önleme permeabilization gerektirir rağmen alternatif olarak, daha klasik hücre içi düzenleyici işaret FoxP3 kullanılabilir. CTfh analiz üzerinde konsantre olarak, ancak, aynı zamanda, klinik olarak elde etmek için bir Standart laboratuvar akış sitometresi veya deneysel olarak yararlı sonuçlar ile birlikte çalışan en az bir panel tanımlama avantajı vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

İş lösemi UK hibe ETB ve MJA tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL TECHNOLOGIES 15062
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare Life Sciences 17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 BD Horizon 565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 BD Horizon 563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 BD Horizon 562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4 BD Horizon 564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 BD Pharmingen 557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100 BD Pharmingen 560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific L34973
Brilliant Stain Buffer BD Horizon 563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set BD CompBead 552843
FACS Aria II Flow Cytometer BD Biosciences 644832
FACSDiva 6.1.3 BD Biosciences 643629 Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2 Treestar Inc. Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody BD Horizon  565223
Anti-CCR6 antibody BD Horizon  563923
Anti-CXCR5 antibody BD Horizon  562747
Anti-CD4 antibody BD Horizon  564419
Anti-PD-1 antibody BD Pharmingen  557946
Anti-CD45RA antibody BD Pharmingen  560674
Viability Marker ThermoFisher Scientific  L34973

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. Follicular Helper T Cells. Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).
  2. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325 (5943), New York, N.Y. 1001-1005 (2009).
  3. Breitfeld, D., et al. Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production. The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).
  4. Linterman, M. A., et al. Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity. The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).
  5. Bindea, G., et al. Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer. Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).
  6. Gu-Trantien, C., et al. CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).
  7. Amé-Thomas, P., et al. Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells. Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).
  8. Bossaller, L., et al. ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells. The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).
  9. Morita, R., et al. Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion. Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).
  10. Locci, M., et al. Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses. Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).
  11. He, J., et al. Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure. Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).
  12. Schmitt, N., Bentebibel, S. -E., Ueno, H. Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood. Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).
  13. Simpson, N., et al. Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).
  14. Wang, J., et al. High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis. Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).
  15. Ueno, H. Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease. Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).
  16. Maecker Holden, T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  17. Jia, Y., et al. Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression. PLOS ONE. 10 (2), 0117458 (2015).
  18. Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin's lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma. PLOS ONE. 13 (1), 0190468 (2018).
  19. Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. Journal of Experimental Medicine. 204 (8), 1849-1861 (2007).
  20. Duan, Z., et al. Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis. Oncotarget. 6 (42), 44239-44253 (2015).
  21. Zhang, X., et al. Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production. Lupus. 24 (9), 909-917 (2015).
  22. Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood. Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).
  23. Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties. The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).
  24. Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging. Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).
  25. Yu, N., et al. CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).

Tags

Biyoloji sayı 143 CD4 T hücreli akış sitometresi periferik kan T-foliküler yardımcı hücresi hücre alt kümeleri dolaşan T foliküler yardımcı hücresi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Byford, E., Carr, M., Piñon,… More

Byford, E., Carr, M., Piñon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (143), e58431, doi:10.3791/58431 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter