Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av CD4+ T-celler og analyse av sirkulerende T-follicular Helper (cTfh) celle undergrupper fra perifert blod bruker 6-farge Flow cytometri

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58431
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Leicester Cancer Research Centre and Ernest and Helen Scott Haematology Research Institute, University of Leicester, 2MRC Toxicology Unit, University of Leicester

Summary

Her, en protokoll for isolering og karakterisering av CD4+ T-celle delsett fra menneskelige perifert blod er beskrevet. Renset CD4+ T-celler blir analysert av flowcytometri å bestemme proporsjoner av T-follicular hjelper celle undergrupper.

Abstract

Avvikende T-follicular helper (Tfh) celle aktivitet er i autoimmune tilstander og deres tilstedeværelse er forbundet med kliniske utfall når lymfeknute microenvironment i B-celle non-Hodgkins lymfom er analysert. Delsett av sirkulerende T-follicular hjelper celler (cTfh), den sirkulerende hukommelse avlukke Tfh celler i blodet, er også perturbed i sykdom og derfor representerer potensielle romanen prediktiv biomarkers. Perifert blod-baserte tester er en fordel fordi det er relativt ikke-invasiv og kan enkelt føljetong overvåking. Denne artikkelen beskriver en metode for å isolere CD4+ T-celler fra menneskeblod og videre analyse av flowcytometri nummerere cTfh celler og andelen delmengder ulike (cTfhPD-1-/ / Hei, cTfh1, 2, 17 og cTfh1-17). Hvilket av disse undergrupper ble sammenlignet mellom vanlig fag og pasienter med lymphoma. Vi fant at metoden var robuste nok til å få pålitelige resultater fra rutinemessig innsamlede pasienten materiale. Teknikken vi beskrive for analyse kan enkelt tilpasses til celle sortering og nedstrøms programmer som RT PCR.

Introduction

T-follicular hjelper celler (Tfh) er en CD4+ T-celle delsett som var utgangspunktet preget i lymfoide vev1. Disse cellene uttrykke PD-1 og CXCR5 overflate reseptorer, skiller IL-21 og IL-4 og vise kjernefysiske uttrykk for transkripsjon faktoren, BCL-62,3. Som navnet antyder, de er funnet i germinal sentre og er avgjørende for høy affinitet antistoff produksjon1.

Dysregulated Tfh svar har vært innblandet i sykdom patogenesen, særlig autoimmun sykdom, der de fremmer utvidelsen av autoreactive B celler4. De spiller også en rolle i svulst microenvironment både solid5,6 og lymfoide kreft7. Omvendt, genetiske defekter av overflaten proteiner viktig for Tfh funksjonen induserbart T-celle costimulator (ICOS) resultatet i menneskelig immunsvikt syndromer8. CD4+ CXCR5+ celler i menneskelig perifert blod kalles sirkulerende T-follicular hjelper celler (cTfh) og antas å være hukommelse avlukke Tfh celler i vev9. Formålet med metoden beskrevet her er analysen av cTfh undergrupper etter CD4+ celle isolasjon fra perifert blodprøver.

Flere cTfh delsett er definert og effektiviteten som de gir B-celle hjelp skiller seg fra en undergruppe til en annen9,10,11,12. De relative proporsjonene i disse delsett er endret i en rekke sykdommer, mest fremtredende autoimmun sykdom der det er nesten alltid en økningen i mer funksjonelle PD-1/ Hei og/eller cTfh2 eller cTfh17 delsett i forhold til mindre funksjonell PD-1- og/eller cTfh1 delsett12. Omfanget av disse endringene ofte knytte klinisk parametere inkludert sykdom aktivitet og autoantibody titers, som indikerer en mulig rolle for cTfh delsett distribusjon som en prognostiske biomarkør i sykdom, som kanskje gjenspeiler aktiviteten til Tfh i lymfoid vev9,12,13,14. I tillegg tar blodprøver fra deltakere er rask, sikker og akseptabelt, og så tillater føljetong overvåking for analyse av sykdomsprogresjon eller svar til terapi.

Bruk av isolerte CD4+ T-celler over tradisjonelle perifert blod mononukleære celle (PBMNC) suspensjoner gir høyere gjennomstrømming flyt cytometri eksperimenter ved å redusere tiden det tar å skaffe seg et betydelig antall cTfh celler for analyse. Dette er spesielt nyttig når sortering celler fra sjeldne cTfh delsett med flyt aktivert celle sortering (FACS). For å hjelpe effektiviteten, kan disse suspensjoner være cryopreserved for å aktivere "batching" å brukes i flyt cytometri eksperimentet. På testing, CD4+ renhet ble ikke redusert med kryonisk bevaring.

Mens ulike laboratorier brukes forskjellige indikatorer for å kategorisere cTfh celler i tidlige stadier av deres oppdagelse, metoden presenteres her gjør bruk av en felles ordning av to grupper av celle-overflate markører som foreslått av Schmidt et al.12, 15 aktivere samtidig identifisering av cTfh og delmengder ni anerkjent i en enkelt flowcytometri eksperimenter.

Som eneste celle overflate markører brukes, cellene krever ikke fiksering eller permeabilization, og dermed kan forbli i live for nedstrøms funksjonelle studier. Dette kan ordnes av cellen sortere ved hjelp av FACS med samme antistoff panel. Dette panelet kan bli utvidet til å omfatte andre markører, slik at begrensningene i flyt cytometer brukes.

Analyse av multi-farge flyt cytometri eksperimenter kan være utfordrende på grunn av iboende subjektiv natur gating på 2-dimensjonal dot tomter, spesielt når celle populasjoner har ikke en klar bi-modalt distribusjon i markør fluorescens, som er den tilfellet for cTfh celler og delmengder. Derfor er det viktig å sette opp effektive kontroller å redusere gjenstandene aktiverer bedre oppløsning befolkninger og angi gating strategier trygt. Antistoff panel design og av grunnleggende kontroller for en flowcytometri eksperimenter slik, dvs. bruker kompensasjon og FMO kontroller er skissert i trinn 3.4.2 og 3.4.3,respectively.

Alle cTfh celler er definert som CD4+ CXCR5+ CD45RA-. Hvilket uttrykk for karakteristiske Tfh aktivisering markøren PD-1 kan da bli bestemt å identifisere delsett av PD-1-, PD-1+ eller PD-1Hei cTfh celler. Deretter bruker en kombinasjon av chemokine reseptorer CXCR3 og CCR6, som uttrykkes ulikt tradisjonelle Th1, 2 eller 17 celler, cTfh kan karakteriseres som cTfh1, 2 eller 17-lignende av en profil av CXCR3+ CCR6-, CXCR3- CCR6- , og CXCR3- CCR6+, henholdsvis.

Antistoff panelet brukes av vårt laboratorium vises i tabell 1. Brukeren må tilpasse seg deres fluorophore utvalg kontoen for laser og lys filter konfigurasjon tilgjengelig på deres lokale flyt cytometer.

Følgende hensyn påvirke valg av fluorophores. Bruk lyse fluorophores der det er mulig. Spesielt bruk den smarteste tilgjengelig fluorophores mørkeste (mindre svært uttrykt) markører. Dimmer merkene inkluderer PD-1, CXCR3 og CCR6, og i mindre grad, CXCR5. Vi spesielt gjort bruk av nyere BB, BV og BUV fluorophores som gir utmerket lysstyrke og dermed aktivere enklere løsning av forskjellige populasjoner av cellene.

Spredt fluorophore valget over utslipp spectra så mye som mulig for å minimalisere spectral overlapping, og dermed nivået på kompensasjon. Et gratis, nettbasert verktøy som kan brukes til å hjelpe designe en flyt cytometri panel kan bli funnet her: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. For å spare plass på utslipp spektrum, vi ansatt en "dump kanal" ved hjelp av en levedyktighet farge med et utslipp bølgelengde som overlapper med at av APC-H7 (konjugert til CD45RA) for å aktivere gjenkjenning (og utelukkelse) av både døde og/eller CD45RA+ bruker en enkelt detektor.

Her presenteres en protokoll for isolering av perifert blod CD4+ T-celler og deres påfølgende analyse av flowcytometri til å bestemme ulike og nylig beskrevet sirkulerende delsett.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Blodprøver ble innhentet fra vanlig fag (NS) (n = 12) og pasienter med marginale sonen lymphoma (MZL) (n = 7) og andre B-celle non-Hodgkins lymfom (BNHL) (6 FL pasienter, 2 lymphoplasmacytic lymfom pasienter og 1 lav karakter B-celle Non-Hodgkins lymfom ikke angitt pasient). Pasienter ble rekruttert fra hematologi klinikkene på Leicester Royal sykehus etter å ha gitt informert, skriftlige samtykke, med etiske godkjenning i stedet for alle studier. Etiske godkjenning ble innhentet av Leicestershire, Northamptonshire og Rutland forskning etikk komiteen 1, referanse 06/Q2501/122 for pasientprøvene og helse Research Authority (HRA) NRES komiteen East Midlands-Derby, referanse 14/EM/1176 for vanlig fag.

1. isolering av CD4+ T-celler fra hele perifert blod

  1. Ta frisk perifert blod (2 til 15 mL) K2EDTA rør av standard venipuncture og så snart som mulig for å opprettholde maksimal levedyktighet.
    Merk: Bruk standard laboratorium personlig verneutstyr (frakk, hansker, briller), og utføre arbeidet i en klasse II Biosafety regjering.
  2. Blod og nødvendig reagenser (CD4+ berikelse cocktail, 2% fosterets bovin serum/fosfat bufret saltvann (FBS/PBS), tetthet gradert media og frysing medium hvis cryopreserving celler) til romtemperatur.
  3. Blanding blod med en kommersielt tilgjengelig cocktail av antistoffer for anriking av menneskelig CD4+ T celler. Bruk 50 µL til reagensen for hver 1 mL blod. Bruk en 50 mL konisk polypropylen rør for 5-15 mL blod.
    Merk: Hvis bruker 2 til 4 mL blod, utføre dette trinnet i et 14 mL konisk polypropylen rør.
  4. Inkuber blandingen ved romtemperatur for 20 min.
  5. Fortynne blandingen med en lik mengde 2% FBS/PBS
  6. Laget denne utvannet blandingen over tetthet gradert media sakte å unngå å forstyrre grensesnittet og videre til sentrifugering umiddelbart for å unngå spredning av blodet til tetthet gradert medium.
    1. For 2 til 3 mL blod, bruker 3 mL tetthet gradert medium i en 14 mL konisk polypropylen rør, men for 4 mL blod, bruker 4 mL av tetthet gradert medium i en 14 mL konisk polypropylen rør og for 5-15 mL blod , bruke 15 mL av tetthet gradert medium i en 50 mL konisk polypropylen rør.
  7. Sentrifuge lagdelt blandingen for 20 min på 1200 x g med bremsen av på 20 ° C.
    Merk: En temperatur under ambient kan føre til forurensning med røde blodceller og granulocytter. En lavere hastighet vil føre til CD4+ isolasjon prosessen mislykkes. Forlate pause engasjert vil redusere celle avkastning. Bruk en benk toppen sentrifuge med rotorer som kan lukkes for å unngå aerosoler.
  8. Fjerne den beriket CD4+ celle lag fra grensesnittet bruker en Pasteur pipette.
    Merk: Beriket celle laget vil ligne en standard "buffy strøk" hvit skyet celler, men som bare CD4+ celler er til stede, vil dette selvsagt bli mindre og vanskeligere å se.
  9. Legge til 2% FBS/PBS til CD4+ celler til et totalt volum på 10 mL og deretter vaske to ganger med 2% FBS/PBS av sentrifugering i 10 min 400 x g under hver vask.
  10. Resuspend pellet i 2% FBS/PBS og teller cellene farget med en viktig fargestoff (trypan blå) å bestemme cellen tallene og levedyktighet.
  11. Valgfritt trinn: resuspend 5 x 105 til 1 x 106 celler i iskaldt medium (10% dimethyl sulfoxide i FBS) i 1 mL dele.
    Merk: Nivåer av noen overflate markører bli endret av cryo-bevaring og tine. Det er derfor svært viktig at alle prøvene behandles konsekvent. For å minimere forskjellene i analytisk variabler, var prøvene cryo bevarte og benytte for analyse i denne studien.

2. flowcytometri

  1. Tine cryopreserved CD4+ celler raskt i et vannbad på 37 ° C og vask en gang i forvarmes medium (RPMI 1640 + L-glutamin supplert med 10% FBS og 1 x penicillin-streptomycin).
  2. Legge celler til 9 mL medium, sentrifuge for 5 min på 400 x g og fjerne nedbryting.
  3. Resuspend cellene i 1% bovin serum albumin (BSA) i PBS (50 µL) slik at hver betingelse for å bli testet bruker mellom 5 x 105 og 1 x 106 celler.
  4. Bland cellene med flekker Buffer (50 µL).
    Merk: Strålende flekken Buffer hindrer ulike flekker gjenstander som kan forstyrre dataanalyse når to eller flere BV eller BUV flekker brukes samtidig på grunn av iboende kjemiske egenskaper av disse fargestoffer. I enkle eller unstained kvinne forhold, de 50 µL strålende flekken bufferen kan erstattes for 50 µL av 1% BSA/PBS.
  5. Legge til antistoffer i celler (i "volum brukes" kolonnen i tabell 1) og ruge på isen i mørket 30 min.
  6. Vask cellene to ganger i 1% BSA/PBS av sentrifugering for 3 min 600 x g under hver vask.
  7. Resuspend i 1% BSA/PBS (400 µL) og overføre til en flow cytometri oppkjøpet røret.
  8. Vortex cellene forsiktig før du henter på en flyt cytometer:

3. flow cytometri kontroller og oppsett

  1. Bruker en unstained kvinne prøve, angi photodiode spenninger slik at lymfocytter kan skilles fra åpenbare rusk og døde celler (hendelser med høye siden xy (SSC) og lav frem xy (FSC) område)16. Bruke enkelt farget prøver, angi photomultiplier (avdrag) spenninger slik at positiv fluorescens kan skjelnes fra bakgrunnen fluorescens samtidig sørge for at alle hendelser innenfor synlig skalaen.
    Merk: En forbedring vil være å tegne inn CV mot avdrag spenning for hvert avdrag bruker svakt fluorescerende perler for å finne minimum spenningen for optimal oppløsning ("Topp 2" metoden19).
  2. Konto for spectral overlapping ved å generere en kompensasjonsmatrise enkelt flekker med fangst perler. Legge til kommersielt tilgjengelig kompensasjon perler (60 µL) og negativ kontroll perler (60 µL) 1% BSA/PBS (100 µL), og vortex.
    Merk: Fange perler brukt samsvare vert arter og IgG isotype antistoff brukes. Kompensasjonsplanen bør være nytt beregnet hvis partinummeret for en tandem fargestoffer endringer, som de kan vise betydelig variasjon i deres utslipp spektra mellom.
  3. Legge til en enkelt antistoff (20 µL) og vortex.
  4. Inkuber ved romtemperatur i mørket 30 min.
  5. Sentrifuge 200 x g i 10 min og kast nedbryting.
  6. Resuspend i 1%BSA/PBS (500 µL) og vortex.
  7. Kjøpe prøven med en flyt cytometer ved hjelp av utpekte kompensasjon matrix generator i oppkjøpet programvaren i henhold til produsentens instruksjoner.
  8. Bruk FMO kontroller å styre plasseringen av portene for positiv markør fluorescens rede for fargestoff søl over, som er den viktigste kilden til bakgrunnen fluorescens eksperimenter med ≥4 farger16. Følge den generelle celle-overflate flekker protokoll som beskrevet i trinn 3, men for hver tilstand, utelater ett av fluorophores fra flekker trinn (der CD45RA utelates, også utelate live/dead flekken). Erverve 100.000 lymfocytter for hvert vilkår.
  9. Angi porten positivitet på ≤0.5% av celler. Se figur 2 for en illustrert eksempel FMO kontroller.

4. dataanalyse

  1. Ansette flyt cytometer oppkjøpet programvare for å sette en grense av 5000 enheter på parameteren FSC utelate svært små rusk.
  2. Bruke en stoppe gate for å erverve 10.000 cTfh celler (CD4+ CD45RA- CXCR5+).
    Merk: Den enkelte brukeren kan samle mer enn 10.000 celler. Dette tallet var et kompromiss mellom samle nok celler for å gi meningsfulle resultater og tiden for samlingen.
  3. Bruke en FSC-området / SSC-området dot tomten, tegne en ellipse- eller mangekantverktøyet gate for å velge befolkningen av lymfocytter mens unntatt rusk og åpenlyst døde celler (hendelser med høy SSC-området og lav FSC-området).
  4. Bruke en FSC-området / FSC bredde dot tomten, tegne en polygon gate velge enkeltceller mens utenom doublets (doublets har et økt område men lignende bredden til enkeltceller).
  5. Bruke en FSC-området / CD45RA og levedyktighet markør dot tomten, tegne et rektangulært gate for å velge live, CD45RA- celler (celler med en lav fluorescens for denne markør).
  6. Bruke en FSC-området / CD4 dot tomten, tegne et rektangulært gate for å velge CD4+ celler (celler med en høy fluorescens for denne markør).
  7. Bruke en CD4 / CXCR5 dot tomten, tegne et rektangulært gate for å velge CXCR5+ (dvs. cTfh) celler (celler med en høy fluorescens for denne markør).
  8. Bruke en CXCR3 / CCR6 dot tomten, setter du en quad gate for å dele cTfh celler i cTfh1, 2 og 17 celler (celler som er høyt og lavt for hver merketråd).
    Merk: Celler med fenotypen CD4+ CXCR5+ CXCR3+ CCR6+ er dårlig preget. Vi refererer til disse cellene som cTfh1/1718 fordi konvensjonelle hjelper T-celler (CD4+ CXCR5-) som er overgangen mellom Th17 og Th1 Vis uttrykk for CXCR3 og CCR6 og har blitt beskrevet som cTfh1/17-19.
  9. Bruke et PD-1 histogram, bruke verktøyet området til å dele cTfh celler (eller hvis foretrukket, den personlige cTfh1, 2, 17 eller 1/17 delsett) i PD-1-/ + eller Hei populasjoner.
    Merk: Skillet mellom PD-1+ og PD-1Hei er ikke godt definert i litteraturen. Terskelen ble satt som samme PD-1 intensitet kreves for å gjenkjenne bona-fide Tfh i menneskelig mandel lymfocytt suspensjoner flowcytometri med samme antistoff panel. En markør for ICOS kan eventuelt legges til antistoff panelet, som bare PD1Hei celler er ICOS+.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Høy CD4+ renhet ble oppnådd ved hjelp av CD4+ isolasjon-protokollen, som var pålitelig over alle blodprøver testet av oss (mener: 96.6%, SD: 2,38, n = 31) (Figur 3).

Identifikasjon av cTfh (CD4+ CXCR5+ celler) i et representativt normal emne vises (Figur 4A). Andelen totale cTfh celler i CD4+ cellene hadde median verdien 29,4% (inter-kvartil rekkevidde (IQR) = 10,8) over 12 normale individer. Flere studier over flere ulike sykdommer, inkludert hepatocellulært karsinom17,20, systemisk lupus erythematous11,21og revmatoid artritt11,14 har vært motstridende evne til å oppdage en forskjell i totale cTfh mellom heathy kontroller og pasienter. Ingen signifikante forskjeller ble funnet i totale cTfh mellom vanlig fag og MZL eller BNHL pasienter (Figur 4B)21.

Identifikasjon av PD-1 uttrykket i cTfh celler fra en representant normal emnet og BNHL pasient for sammenligning er vist i figur 5et. PD-1 uttrykket var betydelig høyere i MZL og BNHL pasienter enn vanlig fag (figur 5B)21. Tilsvarende økninger i PD-1 uttrykk har vært vist i flere autoimmune sykdommer11,12,13,14.

Identifikasjon av cTfh1, 2, 17 og 1/17 i befolkningen i cTfh celler ved hjelp av CXCR3 og CCR6 uttrykk fra en representant normal emne er vist i figur 6en. Andelen av cTfh1 celler var betydelig høyere i MZL og BNHL pasienter enn vanlig fag (figur 6B)21.

Figure 1
Figur 1 : Illustrasjon av samlede gating strategi brukes til å identifisere cTfh celler og delmengder. Fra øverst til venstre, en befolkning av lymfocytter skilles, og doublets er utelukket. Live CD45RA- celler er merket med en "dump kanal". CD4+ celler er gated og CXCR5+ celler identifiseres som cTfh. cTfh er delt i cTfh1, 2 eller 17-like ved hjelp CXCR3 og CCR6. PD-1 uttrykket i disse delsett kjennetegnes deretter. Tall fra en representant normal emnet blodprøve. FSC-A, FSC området; SSC-A SSC området; FSC-W, FSC bredde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Illustrasjon av FMO styrer. Hver biaxial flyt cytometri tomt viser CD4+ celler med alle fluorophores unntatt den rundt å demonstrere minimum på hvilke porter for fluorescens positivitet kan angis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Biaxial flyt cytometri plot viser identifikasjonen av CD4 + celler etter gating å leve lymfocytter. Tatt fra en representant normal emnet blodprøve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Identifikasjon av cTfh celler. (A) Biaxial flyt cytometri plot viser CXCR5+ uttrykk på celler gated for CD4+ CD45RA-. Tatt fra et representativt normal emne. (B) Relative prosenter av cTfh i totale CD4+ celler i normal fag (n = 12), MZL (n = 7), BNHL (n = 9). Vannrette linjer representerer medianen, og feilfelt representerer inter-kvartil rekkevidde. Ble ikke funnet ingen betydelige forskjeller mellom grupper ved hjelp av Mann-Whitney U testen. Dette tallet er endret fra Byford et al.21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : PD-1 uttrykk og forholdet til cTfh celler. (A) flyt cytometri histogrammet brukes til å bestemme PD-1 uttrykk i total cTfh celler. Tatt fra en representant normal emnet og BNHL pasienten. (B) PD-1+ celler som andel av samlede cTfh celler. Vannrette linjer representerer medianen, og feilfelt representerer inter-kvartil rekkevidde. Medians er betydelig (Mann-Whitney U-test) forskjellig mellom vanlig fag (21,5 prosent, IQR = 10,8, n = 12) og lymfom pasienter (MZL 54.1%, IQR = 21,2, n = 7, p = 0.0008 og BNHL 45.2%, IQR = 11.4, n = 9, p = 0.0003). Dette tallet er endret fra Byford et al.21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : CXCR3 og CCR6 og deres forhold til cTfh1 tall. (A) Biaxial flyt cytometri plot viser uttrykk for CXCR3 og CCR6 på CD4+ CD45RA- CXCR5+ celler. Tatt fra en representant normal emnet og BNHL pasienten. (B) cTfh1 celler i prosent av totalt cTfh celler. Vannrette linjer representerer medianen, og feilfelt representerer inter-kvartil rekkevidde. Medians er betydelig (Mann-Whitney U-test) forskjellig mellom vanlig fag (20,8%, IQR = 6,7, n = 12) og lymfom pasienter (MZL 32.1%, IQR = 6.8, n = 7, p = 0.013, og BNHL 35.4%, IQR = 7,6%, n = 9, p = 0.0056). Dette tallet er endret fra Byford et al.21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Table 1
Tabell 1: flyt cytometri antistoff panelet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen representerer en enkel og effektiv måte å analysere perifert blod cTfh celler, slik at påvisning av alle relevante delsett identifisert i litteraturen hittil. Blodprøver kan enkelt og effektivt fås som en del av standard polikliniske klinikker og føljetong prøver kan bli samlet sammen med kliniske data. Igjen, gjør dette prospektive studier vurdere cTfh delsett som biomarkers sykdomsprogresjon eller respons på behandling. Disse studiene ville være spesielt berettiget i sykdom der Tfh feilregulering er involvert i patogenesen som autoimmunitet og visse typer solid og Hematologisk kreft. I tillegg kan endres i cTfh-funksjonen i sykdommen undersøkes ved å sortere cTfh celler med flowcytometri som eneste celle overflate markører brukes i denne protokollen. Sortere cTfh celler i MZL pasienter mulig for oss å finne forskjellene i genet uttrykket profiler sammenlignet med normal fag21.

Vi fant så effektivt CD4+ T-celle isolasjon forbedret dataanalyse. Vi beskriver trinnene involvert i detaljer fordi mindre problemer som sentrifuge bremsing og fart var kritisk til isolasjon prosedyre. Et annet viktig skritt, som for alle flyt cytometri analyse, er å angi kompensasjon og FMO kontroller.

PD-1 uttrykk varierer på cTfh celler og celler som har den høyeste PD-1 kan være den mest funksjonelle og derfor relevant, særlig for studier av autoimmune sykdommer11,12. En viktig sak var å bestemme porten for identifikasjon av PD-1Hei celler, aktivert cTfh delsettet, som det er ingen standard begrensning definert i litteraturen. Dette viktige, men mindre delsettet gjenspeiler sannsynligvis aktive Tfh differensiering i lymfoidvev11. For å overvinne denne utfordringen, ble terskelen satt slik at det var den samme som kreves for å gjenkjenne bona-fide Tfh celler fra menneskelige mandel med samme antistoff panel. Vi erkjenner at å få mandlene kan være problematisk for noen brukere. Et alternativ vil være å utvide antistoff panelet brukes i denne protokollen ved tilsetning av anti-ICOS, som bare PD-1Hei celler er ICOS+ 12.

Her presenterer vi et antistoff panel for å oppdage overflate markører karakteristisk for sirkulerende CD4+ T-celler. Sirkulerende T-follicular regulatoriske celler (cTfr) er blod hukommelse avlukke T-follicular regulatoriske celler (SFT) som er bosatt i lymfoid vev og har viktige roller i å regulere det germinal sentrum reaksjon22,23 . cTfr er blod CD4+ CXCR5+ celler som co express T-regulatoriske celle indikatorer inkludert transkripsjon faktor FoxP3. Måle cTfr sammen med cTfh kan gi et mer komplett bilde av aktiviteten i germinal sentrum, og kan presentere en biomarkør sykdom i sin egen rett24. Selv om cTfr er iboende lav (mener: 1.82%, SD: 1.40, n = 24 av totale CD4+ celler i egne eksperimenter), skiller cTfr fra cTfh vil også øke spesifisiteten av cTfh analyse. Legger til en kombinasjon av spesifikke T-regulatoriske celle-overflate markører i panelet vårt som CD25 og CD12725 ville aktivere gjenkjenning av cTfr i tillegg til alle cTfh delsett i samme eksperimentere med en meget lignende protokoll. Alternativt kan mer klassiske intracellulær regulatoriske markøren FoxP3 brukes, men dette krever fiksering og permeabilization hindre nedstrøms funksjonelle analyser. I fokus på cTfh analyse, men er det også fordeler til å definere et minimum panel som kan brukes sammen med en standard laboratorium flyt cytometer å få klinisk eller eksperimentelt nyttige resultater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Arbeidet ble støttet av et stipend fra leukemi UK ETB og MJA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL TECHNOLOGIES 15062
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare Life Sciences 17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 BD Horizon 565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 BD Horizon 563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 BD Horizon 562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4 BD Horizon 564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 BD Pharmingen 557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100 BD Pharmingen 560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific L34973
Brilliant Stain Buffer BD Horizon 563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set BD CompBead 552843
FACS Aria II Flow Cytometer BD Biosciences 644832
FACSDiva 6.1.3 BD Biosciences 643629 Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2 Treestar Inc. Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody BD Horizon  565223
Anti-CCR6 antibody BD Horizon  563923
Anti-CXCR5 antibody BD Horizon  562747
Anti-CD4 antibody BD Horizon  564419
Anti-PD-1 antibody BD Pharmingen  557946
Anti-CD45RA antibody BD Pharmingen  560674
Viability Marker ThermoFisher Scientific  L34973

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. Follicular Helper T Cells. Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).
  2. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325 (5943), New York, N.Y. 1001-1005 (2009).
  3. Breitfeld, D., et al. Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production. The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).
  4. Linterman, M. A., et al. Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity. The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).
  5. Bindea, G., et al. Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer. Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).
  6. Gu-Trantien, C., et al. CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).
  7. Amé-Thomas, P., et al. Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells. Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).
  8. Bossaller, L., et al. ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells. The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).
  9. Morita, R., et al. Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion. Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).
  10. Locci, M., et al. Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses. Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).
  11. He, J., et al. Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure. Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).
  12. Schmitt, N., Bentebibel, S. -E., Ueno, H. Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood. Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).
  13. Simpson, N., et al. Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).
  14. Wang, J., et al. High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis. Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).
  15. Ueno, H. Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease. Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).
  16. Maecker Holden, T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  17. Jia, Y., et al. Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression. PLOS ONE. 10 (2), 0117458 (2015).
  18. Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin's lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma. PLOS ONE. 13 (1), 0190468 (2018).
  19. Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. Journal of Experimental Medicine. 204 (8), 1849-1861 (2007).
  20. Duan, Z., et al. Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis. Oncotarget. 6 (42), 44239-44253 (2015).
  21. Zhang, X., et al. Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production. Lupus. 24 (9), 909-917 (2015).
  22. Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood. Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).
  23. Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties. The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).
  24. Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging. Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).
  25. Yu, N., et al. CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).

Tags

Biologi problemet 143 CD4 T-celle flowcytometri perifert blod T-follicular hjelper celle sirkulerende T-follicular hjelper celle celle undergrupper
Isolering av CD4<sup>+</sup> T-celler og analyse av sirkulerende T-follicular Helper (cTfh) celle undergrupper fra perifert blod bruker 6-farge Flow cytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Byford, E., Carr, M., Piñon,… More

Byford, E., Carr, M., Piñon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (143), e58431, doi:10.3791/58431 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter