Summary
هنا، على بروتوكول لعزل وتوصيف CD4+ تي خلية هو وصف مجموعات فرعية من الدم المحيطي البشري. تنقية خلايا CD4+ خلايا تي يتم تحليلها بواسطة التدفق الخلوي لتحديد نسب تي جرابي الخلية مساعد مجموعات فرعية.
Abstract
نشاط الخلية مساعد (طفح) T جرابي الشاذة يمكن اكتشافها في الظروف الذاتية ويرتبط وجودهم بالنتائج السريرية عندما يتم تحليل المكروية العقدة الليمفاوية في الأورام اللمفاوية الخلية ب غير-هودجكين. مجموعات فرعية من تعميم مساعد تي جرابي الخلايا (كتفه)، حجرة الذاكرة المتداولة طفح الخلايا في الدم، وهي أيضا قلق في المرض، وتمثل بالتالي المؤشرات الحيوية التنبؤية رواية المحتملة. اختبار الطرفية المستندة إلى الدم مفيد لأنه نسبيا غير الغازية ويتيح رصد المسلسل بسيطة. توضح هذه المقالة طريقة لعزل خلايا CD4+ خلايا تي من الدم البشري، ومزيد من التحليل بقياس التدفق لتعداد الخلايا كتفه ونسب على مجموعات فرعية مختلفة (كتفهبد-1--/+/مرحبا، cTfh1، 2 و 17 و cTfh1/17). ثم مقارنة مع مستوى هذه المجموعات الفرعية بين المواضيع العادية والمرضى بسرطان الغدد اللمفاوية. وجدنا أن الأسلوب كانت قوية بما يكفي للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها من المواد التي تم جمعها بشكل روتيني المريض. الأسلوب الذي يصف لنا للتحليل يمكن تكييفها بسهولة لفرز الخلايا والمتلقين للمعلومات من تطبيقات مثل RT-PCR.
Introduction
تي جرابي مساعد الخلايا (طفح) هي خلايا CD4+ تي خلية فرعية التي تميزت في البداية في الأنسجة اللمفاوية1. هذه الخلايا التعبير عن PD-1 ومستقبلات CXCR5 السطحية وتفرز 21 إيل وايل-4، وإظهار التعبير النووية عامل النسخ، BCL-62،3. وكما يوحي اسمها، أنها توجد في مراكز جيرمنال وضرورية ل إنتاج الأجسام المضادة عالية تقارب1.
طفح Dysregulated الردود قد تورطت في إمراضية المرض، وأهمها أمراض المناعة الذاتية، حيث أنها تعزز توسيع نطاق من الخلايا أوتوريكتيفي ب4. كما أنها تلعب دوراً في ورم المكروية الصلبة5،6 والسرطانات اللمفاوية7. على العكس من ذلك، تعمل العيوب الوراثية من البروتينات السطحية ضرورية لطفح مثل تي خلية إيندوسيبلي كوستيمولاتور (نظام ايكوس) ينتج من متلازمات نقص المناعة البشرية8. خلايا CD4+ CXCR5+ الخلايا في الدم المحيطي البشري توصف بتعميم تي جرابي مساعد الخلايا (كتفه) ويعتقد أن تكون حجرة الذاكرة طفح الخلايا في الأنسجة9. وغرض الأسلوب الموصوفة هنا هو تحليل لمجموعات فرعية كتفه أثر CD4+ خلية العزلة من عينات الدم المحيطية.
وتم تحديد عدة مجموعات فرعية في كتفه والكفاءة التي يقدمونها مساعدة ب-الخلية يختلف عن مجموعة فرعية واحدة إلى آخر9،10،،من1112. يتم تغيير الارتفاع النسبي لهذه المجموعات الفرعية في عدد من الأمراض، ومعظم أمراض المناعة الذاتية مكاناً بارزا فيها هناك دائماً تقريبا زيادة نسبية في أكثر وظيفية PD-1+ مرحبا و/أو مجموعات فرعية cTfh2 أو cTfh17 بالمقارنة مع الأقل الفنية PD-1– و/أو مجموعات فرعية cTfh112. كثيرا ما ربط مدى هذه التغيرات مع المعلمات السريرية بما في ذلك مرض النشاط والأجسام التتر، مما يشير إلى دور محتمل لتوزيع فرعية كتفه كالعلامات البيولوجية تنبؤاتها في المرض، مما قد يعكس نشاط طفح في الأنسجة اللمفاوية9،12،،من1314. بالإضافة إلى ذلك، أخذ عينات دم من المشاركين سريعة ومأمونة ومقبولة، وتسمح بذلك المسلسل رصد لتحليل تطور المرض أو استجابة للعلاج.
استخدام خلايا CD4 المعزولة+ خلايا تي على تعليق خلية وحيدات النوى (ببمنك) الدم المحيطي التقليدية يتيح ارتفاع صافي التدفق الخلوي التجارب بتقليل الوقت المطلوب للحصول على عدد كبير من الخلايا كتفه للتحليل. وهذا مفيد بشكل خاص عند فرز الخلايا من كتفه النادرة مجموعات فرعية باستخدام تدفق تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية). للمعونة الكفاءة، يمكن أن cryopreserved هذه المعلقات لتمكين "الخلط" العينات لاستخدامها في تجربة التدفق الخلوي. في الاختبار، خلايا CD4+ نقاء بمقدار لم نعد.
في حين قدمت مختبرات مختلفة تستخدم علامات مختلفة لتصنيف الخلايا كتفه في المراحل الأولى للاكتشاف، الأسلوب هنا يجعل استخدام نظام موحد لمجموعتين من علامات سطح الخلية كما اقترحه شميت وآخرون12، 15 لتمكين تحديد المتزامن من كتفه وعلى مجموعات فرعية المعترف بها تسعة في قياس تدفق واحد التجربة.
كما تستخدم علامات سطح خلية فقط، لا تتطلب التثبيت أو بيرميبيليزيشن الخلايا، ومما يمكن أن تبقى على قيد الحياة للدراسات الفنية المتلقين للمعلومات. وهذا يمكن أن تيسره الخلية الفرز باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية مع نفس الفريق الضد. ويمكن توسيع هذا الفريق لتشمل علامات أخرى، السماح للقيود المفروضة على سيتوميتير تدفق قيد الاستخدام.
تحليل تجارب قياس التدفق متعدد الألوان يمكن أن تكون صعبة نظراً لطبيعة طبيعتها الذاتية النابضة في مؤامرات دوت ثنائي الأبعاد، لا سيما عندما السكان خلية لا تملك توزيعاً واضحا ثنائية مشروط في الأسفار ماركر، كما هو الحالة للخلايا كتفه وعلى مجموعات فرعية. ولهذا السبب، من الضروري إعداد ضوابط فعالة للحد من المصنوعات اليدوية لتمكين دقة أفضل للسكان ولتعيين النابضة استراتيجيات ثقة. على هذا النحو، جسم فريق تصميم وإقامة الضوابط الأساسية لقياس تدفق التجربة، أي استخدام التعويض وضوابط FMO مبينة في خطوة 3.4.2 و 3.4.3,respectively.
يتم تعريف كافة كتفه الخلايا كخلايا CD4+ CXCR5+ CD45RA–. يمكن تحديد مستوى التعبير علامة التنشيط طفح مميزة PD-1 ثم تحديد مجموعات فرعية من PD-1-، PD-1+ أو PD-1مرحبا كتفه الخلايا. ثم، باستخدام مزيج من مستقبلات تشيموكيني CXCR3 و CCR6، التي يعبر عنها خلطات Th1 التقليدية، 2 أو 17 من الخلايا، كتفه يمكن أن يوصف cTfh1، 2 أو 17 الشبيهة بنبذة عن CXCR3+ CCR6-، CXCR3– CCR6- ، و CXCR3– CCR6+، على التوالي.
يتم عرض لوحة الأضداد المستخدمة من قبل المختبر في الجدول 1. قد يكون المستخدم التكيف مع اختيارهم fluorophore مراعاة لليزر وتكوين تصفية الضوء المتاحة في سيتوميتير تدفق المحلية على.
الاعتبارات التالية التي تؤثر في الاختيار فلوروفوريس. استخدام fluorophores مشرق حيثما كان ذلك ممكناً. على وجه الخصوص، استخدام ألمع fluorophores متاح على العلامات الأكثر خفوت (أعرب أقل شدة). وتشمل علامات باهتة PD-1 و CXCR3 و CCR6، وإلى حد أقل، CXCR5. ونحن على وجه التحديد استخدام الأحدث BB وبي وبوب فلوروفوريس التي توفر سطوع ممتازة، وبالتالي تمكين القرار أسهل من السكان متميزة من الخلايا.
تنتشر التحديد fluorophore عبر أطياف الانبعاثات بقدر الإمكان للتقليل من التداخل الطيفي، ومن ثم مستوى التعويضات المطلوبة. يمكن العثور على أداة مجانية على الإنترنت التي يمكن استخدامها للمساعدة في تصميم لوحة قياس تدفق هنا: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. لتوفير مساحة على طيف الانبعاث، استخدمنا "قناة تفريغ" باستخدام صبغة بقاء مع الطول موجي انبعاثات التي تتداخل مع آسيا والمحيط الهادئ-H7 (يضاف إلى CD45RA) لتمكين الكشف (والإقصاء) من كلا الميت و/أو CD45RA+ باستخدام كشف واحد.
هنا، يرد بروتوكول لعزل الدم المحيطي CD4+ خلايا تي وتحليلها لاحقاً بالتدفق الخلوي لتحديد نسب مختلفة ووصفت ذلك مؤخرا تعميم مجموعات فرعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتم الحصول على عينات دم من المواضيع العادية (NS) (n = 12) فضلا عن المرضى الذين يعانون من سرطان الغدد الليمفاوية المنطقة الهامشية ([مزل]) (n = 7) وأنواع أخرى من الأورام اللمفاوية ب-الخلية غير-هودجكين (بنهل) (فلوريدا 6 المرضى ومرضى سرطان الغدد الليمفاوية ليمفوبلاسماسيتيك 2 وب درجة منخفضة 1-الخلية الأورام اللمفاوية غير هودجكين لا خلاف المريض). المرضى الذين تم تجنيدهم من عيادات أمراض الدم في "المستوصف الملكي ليستر" بعد نظراً لوجود علم، موافقة خطية، مع الموافقة الأخلاقية لجميع الدراسات. تم الحصول على الموافقة الأخلاقية ليسترشير، كنسنغتون وروتلاند بحوث أخلاقيات اللجنة 1، مرجع 06/Q2501/122 لعينات المرضى وهيئة البحوث الصحية (HRA) نريس اللجنة شرق ميدلاند-دربي، 14/م/1176 للرجوع المواضيع العادية.
1-عزل خلايا CD4+ خلايا تي من الدم المحيطي كاملة
- يأخذ الدم المحيطي الطازجة (2 إلى 15 مل) في أنابيب يدتا2ك فينيبونكتوري القياسية والعملية أقرب الإبقاء على الحد الأقصى من السلامة.
ملاحظة: استخدام معدات الوقاية الشخصية المختبر القياسية (معطف، قفازات، نظارات) والاضطلاع بالعمل في فئة الثانية السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. - جلب الدم وجميع الكواشف اللازمة (CD4+ 2% الجنيني البقري المصل/الفوسفات مخزنة المالحة (FBS/برنامج تلفزيوني) والكثافة المتدرجة وسائط الإعلام، إثراء كوكتيل والمتوسطة التجميد إذا كريوبريسيرفينج الخلايا) إلى درجة حرارة الغرفة.
- خلط الدم مع كوكتيل متوفرة تجارياً من الأجسام المضادة لإثراء البشرية CD4+ "خلايا تي". استخدام 50 ميليلتر من الكاشف لكل 1 مل من الدم. استخدام أنبوب 50 مل البوليبروبيلين مخروطية الشكل 5 إلى 15 مل دم.
ملاحظة: في حالة استخدام 2 إلى 4 مل دم، تنفيذ هذه الخطوة في أنبوب 14 مل البوليبروبيلين مخروطية الشكل. - احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
- تمييع المخلوط مع حجم تساوي 2% FBS/برنامج تلفزيوني
-
طبقة هذا الخليط المخفف على أعلى كثافة وسائل الإعلام التدرج ببطء تجنب الإخلال بالواجهة والمضي قدما للطرد المركزي فورا لتجنب انتشار الدم في المتوسط الكثافة المتدرجة.
- 2 إلى 3 مل من الدم، استخدام 3 مل من الكثافة المتوسطة التدرج في أنبوب 14 مل البوليبروبيلين مخروطية، ولكن لمل 4 من الدم، واستخدام 4 مل من الكثافة المتوسطة التدرج في أنبوب 14 مل البوليبروبيلين مخروطية والدم 5 إلى 15 مل ، تستخدم 15 مل من الكثافة المتوسطة التدرج في أنبوب 50 مل البوليبروبيلين مخروطية الشكل.
- الطرد المركزي خليط الطبقات لمدة 20 دقيقة في س 1,200 ز مع الفرامل قبالة عند 20 درجة مئوية.
ملاحظة: درجة حرارة أقل من المحيط قد يؤدي إلى تلوث مع خلايا الدم الحمراء والمحببة. سوف يتسبب بسرعة أقل في خلايا CD4+ إلى فشل عملية العزل. ترك فاصل تشارك ستنخفض غلة الخلية. استخدام أجهزة الطرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء مع الدوارات التي يمكن أن تكون مغلقة لتجنب الهباء الجوي. - إزالة خلايا CD4 المخصب+ خلية طبقة من واجهة استخدام ماصة باستور.
ملاحظة: سوف تشبه الطبقة خلية المخصب معيار "بافي معطف" الخلايا غائمة بيضاء، ولكن كخلايا CD4 فقط+ الخلايا الحالية، وهذا بطبيعة الحال سوف تكون أصغر حجماً وأكثر صعوبة لرؤية. - إضافة 2% FBS/برنامج تلفزيوني لخلايا CD4 خلايا+ تصل إلى إجمالي حجم 10 مل ويغسل ثم مرتين مع 2% FBS/برنامج تلفزيوني من سينتريفوجينج لمدة 10 دقائق في 400 x ز أثناء كل غسل.
- ريسوسبيند بيليه في 2% FBS/برنامج تلفزيوني وعدد الخلايا ملطخة بصبغة حيوية (تريبان الأزرق) لتحديد أرقام الخلية والجدوى.
- خطوة اختيارية: ريسوسبيند 5 × 105 إلى 1 × 106 خلايا في تجميد المتوسطة (10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد في FBS) في مختبرين 1 مل.
ملاحظة: قد يكون تغيير مستويات بعض علامات السطحية بالحفاظ على البرد وذوبان الجليد. ولذلك، مهم جداً أن تتم معالجة جميع العينات دائماً. من أجل تقليل الاختلافات في المتغيرات التحليلية، كانت العينات مجموعات للتحليل في هذه الدراسة والحفاظ على البرد.
2-التدفق الخلوي
- ذوبان الجليد cryopreserved CD4 الخلايا+ بسرعة في حمام مائي في 37 درجة مئوية ويغسل مرة واحدة في حرارة قبل المتوسطة (RPMI 1640 + L-الجلوتامين تكملة مع 10% FBS والبنسلين 1 x-ستربتوميسين).
- إضافة الخلايا إلى 9 مل متوسطة، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 x ز وإزالة المادة طافية.
- ريسوسبيند الخلايا في 1% البقري ألبومين المصل (BSA) في برنامج تلفزيوني (50 ميليلتر) حيث أن كل حالة اختبار يستخدم بين 5 × 105 و 1 × 106 خلايا.
- مزيج من الخلايا مع "المخزن المؤقت لتلطيخ" (50 ميليلتر).
ملاحظة: يمنع "المخزن المؤقت" الرائعة وصمة عار التحف المصبوغة المختلفة التي قد تتداخل مع تحليل البيانات عند استخدام البقع BV أو بوب اثنين أو أكثر في نفس الوقت نظراً للخصائص الكيميائية الملازمة لهذه الأصباغ. في ظروف واحدة أو أونستاينيد، يمكن أن يكون محل 50 ميليلتر من المخزن المؤقت وصمة عار الرائعة ميليلتر 50% 1 لجيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني. - إضافة الأجسام المضادة للخلايا (حسب "وحدة التخزين المستخدمة" العمود في الجدول 1) واحتضان على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة.
- تغسل الخلايا مرتين في 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني من سينتريفوجينج لمدة 3 دقائق في 600 x ز أثناء كل غسل.
- ريسوسبيند في 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني (400 ميليلتر) ونقل إلى أنبوب اقتناء تدفق الخلوي.
- دوامة الخلايا بلطف قبل الحصول على بيانات عن سيتوميتير تدفق:
3-التدفق الخلوي الضوابط والإعداد
- باستخدام نموذج أونستينيد، تعيين الفولتية الضوئي حيث أن الخلايا الليمفاوية لا يمكن فصلها عن الحطام واضحة والخلايا الميتة (الأحداث مع مبعثر الأمام منخفضة (FSC) ومنطقة مبعثر (SSC) الجانب عالية)16. باستخدام عينات الملون واحدة، تعيين ضوئي الفولتية (PMT) حيث يمكن تمييز إيجابي الأسفار من الأسفار الخلفية مع التأكد من أن جميع الأحداث تقع ضمن نطاق الكشف.
ملاحظة: سيكون تحسنا مؤامرة السيرة الذاتية ضد الجهد PMT لكل PMT استخدام الخرز نيون خافت لإيجاد الجهد الحد الأدنى للقرار الأمثل ("ذروة 2" أسلوب19). - حساب التداخل الطيفي بتوليد مصفوفة تعويض استخدام البقع واحد مع التقاط الخرز. إضافة الخرز التعويض المتاحة تجارياً (60 ميليلتر)، والمراقبة السلبية الخرز (60 ميليلتر) إلى 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني (100 ميليلتر)، ودوامه.
ملاحظة: يجب أن تطابق الخرز القبض استخدام الأنواع المضيفة وايستب مفتش من الأجسام المضادة المستخدمة. مصفوفة التعويض ينبغي إعادة محسوب إذا الأصباغ العدد الكثير من الترادف أي تغييرات، كما أنها تستطيع عرض تباين كبير في أطياف الانبعاث بهم بين الكثير. - إضافة جسم واحد (20 ميليلتر) ودوامه.
- احتضان في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة.
- الطرد المركزي في x 200 غ لمدة 10 دقائق، وتجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند في 1%BSA/PBS (500 ميليلتر) ودوامه.
- الحصول على العينة مع سيتوميتير تدفق استخدام مولد مصفوفة التعويض المعينة في اقتناء البرمجيات طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة.
- استخدام عناصر تحكم FMO لتوجيه وضع بوابات للأسفار علامة إيجابية لمراعاة انسكاب صبغة أكثر، وهو المصدر الرئيسي للأسفار الخلفية في تجارب باستخدام إيه فور ألوان16. اتبع تلطيخ سطح الخلية العامة البروتوكول كما هو موضح في الخطوة 3، ولكن لكل شرط، بحذف واحد من فلوروفوريس من الخطوة المصبوغة (حيث تم حذف CD45RA، كما تجاهل وصمة العيش/قتيلا). اكتساب 100,000 لمفاوية لكل حالة.
- تعيين الإيجابية بوابة ≤0.5 في المائة من الخلايا. انظر الشكل 2 على سبيل مثال يتضح من ضوابط FMO.
4. تحليل البيانات
- توظيف اقتناء البرمجيات سيتوميتير تدفق لتحديد عتبة من 000 5 وحدة على المعلمة منتدى التعاون الأمني لاستبعاد الحطام الصغيرة جداً.
- استخدام بوابة وقف لاكتساب 10,000 كتفه خلايا (CD4+ CD45RA– CXCR5+).
ملاحظة: يمكن للمستخدم الفردي جمع 10,000 أكثر من الخلايا. هذا الرقم كان حلاً وسطا بين جمع خلايا كافية لتقديم نتائج ذات مغزى، والوقت اللازم لجمع. - استخدام منتدى التعاون الأمني-مساحة الأرض دوت مجال التعاون بين بلدان الجنوب، رسم بوابة القطع الناقص أو مضلع لتحديد السكان من الخلايا الليمفاوية في حين تستبعد الحطام وعلنا قتل الخلايا (الأحداث بالتعاون بين بلدان الجنوب-منطقة عالية ومنطقة منتدى التعاون الأمني منخفضة).
- استخدام منطقة منتدى التعاون الأمني/منتدى التعاون الأمني-عرض دوت الأرض، رسم مضلع البوابة لتحديد خلايا مفردة مع استبعاد doublets (doublets لها منطقة زيادة لكن العرض مشابهة للخلايا المفردة).
- استخدام منطقة منتدى التعاون الأمني/دوت علامة CD45RA وبقاء الأرض، رسم بوابة مستطيل لتحديد لايف، CD45RA– الخلايا (الخلايا التي تحتوي الأسفار منخفضة لهذه العلامة).
- استخدام منطقة منتدى التعاون الأمني/CD4 دوت الأرض، رسم بوابة مستطيل لتحديد خلايا CD4 خلايا+ (الخلايا مع فلورية عالية لهذه العلامة).
- باستخدام خلايا CD4/CXCR5 دوت الأرض، رسم بوابة مستطيل لتحديد CXCR5+ (أي، من كتفه) الخلايا (الخلايا التي تحتوي فلورية عالية لهذه العلامة).
- استخدام CXCR3/CCR6 دوت الأرض، مكان رباعية بوابة لتقسيم الخلايا كتفه إلى cTfh1، 2 و 17 الخلايا (الخلايا التي تكون عالية ومنخفضة لكل علامة).
ملاحظة: الخلايا التي تحتوي على النمط الظاهري CD4+ CXCR5+ CXCR3+ CCR6+ هي سيئة تتميز. نشير إلى هذه الخلايا ك cTfh1/1718 لأنه مساعد التقليدية الخلايا التائية (CD4+ CXCR5–) التي يتم الانتقال بين التعبير إظهار Th17 و Th1 من CXCR3 و CCR6، وقد وصفت بأنها cTfh1/1719. - استخدام الرسم بياني PD-1، استخدم أداة النطاق لتقسيم الخلايا كتفه (أو إذا كان يفضل، cTfh1 الفردية، مجموعات فرعية 2 أو 17 أو 1/17) إلى PD-1--/+ أو مرحبا السكان.
ملاحظة: التمييز بين PD-1+ و PD-1مرحبا ليست محددة تحديداً جيدا في الأدب. وكان تعيين العتبة كنفس الكثافة PD-1 المطلوبة للكشف عن طفح حسن النية في لوزة البشرية اللمفاويات المعلقات استخدام التدفق الخلوي مع نفس الفريق الضد. وبدلاً من ذلك، يمكن إضافة علامة لنظام ايكوس إلى الفريق الضد، كما هي فقط PD1مرحبا خلايا ICOS+.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CD4 عالية+ النقاء كان يتحقق باستخدام خلايا CD4+ اختبار البروتوكول العزلة، التي كان يعول عليها عبر جميع عينات الدم قبل لنا (يعني: 96.6 في المائة، التنمية المستدامة: 2.38، ن = 31) (الشكل 3).
تحديد كتفه (CD4+ CXCR5+ الخلايا) يرد في موضوع عادي ممثل (الشكل 4أ). نسبة مجموع كتفه الخلايا داخل خلايا CD4+ الخلايا كان متوسط قيمة 29.4 في المائة (بين الشريحتين الربعيتين (IQR) = 10.8) عبر 12 المواضيع العادية. دراسات متعددة عبر عدة أمراض مختلفة بما في ذلك سرطانه الخلية الكبدية17،20والجهازية الذئبة الحمامية11،21والتهاب المفاصل11،14 كانت متضاربة في القدرة على اكتشاف فرقا في كتفه عموما بين عناصر تحكم حياتي والمرضى. تم العثور على لا اختلافات كبيرة في كتفه عموما بين مواضيع عادية و [مزل] أو بنهل المرضى (الشكل 4ب)21.
ويبين الشكل 5ألفتحديد التعبير PD-1 داخل الخلايا كتفه من الممثل هذا الموضوع العادي والمريض بنهل للمقارنة. التعبير PD-1 كان أعلى بكثير في المرضى [مزل] وبنهل من مواضيع العادي (الشكل 5ب)21. وقد تجلى زيادات مماثلة في التعبير PD-1 في عدة اضطرابات المناعة الذاتية11،،،من1213،14.
تحديد cTfh1، 2، 17 و 1/17 ضمن السكان من كتفه الخلايا باستخدام التعبير CXCR3 و CCR6 من موضوع عادي ممثل يظهر في الشكل 6A. وكانت النسبة الخلايا cTfh1 أعلى بكثير في المرضى [مزل] وبنهل من مواضيع العادي (الشكل 6ب)21.
الشكل 1 : شكل توضيحي لاستراتيجية النابضة العامة المستخدمة لتحديد الخلايا كتفه وعلى مجموعات فرعية- من أعلى اليسار، يتم تمييز سكان من الخلايا الليمفاوية، ومستبعدة في دوبليتس. يعيش CD45RA يتم تحديد الخلايا– باستخدام "قناة تفريغ". خلايا CD4+ هي بوابات الخلايا و CXCR5+ يتم تحديد الخلايا كتفه. وتنقسم كتفه cTfh1، 2 أو 17-مثل استخدام تعبير CXCR3 و CCR6. ويتميز ثم التعبير PD-1 ضمن هذه المجموعات الفرعية. الأرقام مأخوذة من عينة دم ممثل هذا موضوع عادي. منتدى التعاون الأمني-أ، منطقة منتدى التعاون الأمني؛ مجال التعاون بين بلدان الجنوب بالتعاون بين بلدان الجنوب؛ منتدى التعاون الأمني-W، عرض منتدى التعاون الأمني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : عناصر تحكم الرسم التوضيحي FMO. يظهر كل قطعة بياكسيال التدفق الخلوي CD4+ الخلايا ملطخة بجميع فلوروفوريس ما عدا واحدة اهتمام لإثبات الحد الأدنى في البوابات التي يمكن تعيين الإيجابية الأسفار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : بياكسيال التدفق الخلوي الأرض عرض تحديد خلايا CD4 + الخلايا بعد النابضة للعيش لمفاوية. مأخوذة من عينة دم ممثل هذا موضوع عادي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : تحديد خلايا كتفه. (A) بياكسيال التدفق الخلوي الأرض عرض CXCR5+ التعبير في الخلايا عن طريق بوابة لخلايا CD4+ CD45RA–. مأخوذة من مادة طبيعية ممثل. (ب) النسب المئوية النسبية من كتفه داخل خلايا CD4 مجموع الخلايا+ في المواضيع العادية (n = 12)، [مزل] (n = 7)، بنهل (n = 9). خطوط أفقية تمثل الوسيط، وتمثل أشرطة الخطأ بين الشريحتين الربعيتين. تم العثور على لا اختلافات كبيرة بين المجموعات باستخدام اختبار مان-ويتني U. وقد تم تعديل هذا الرقم من بايفورد et al.21. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : التعبير PD-1 وعلاقته بالخلايا كتفه. (أ) تدفق الرسم البياني الخلوي المستخدمة لتحديد التعبير PD-1 داخل الخلايا كتفه المجموع. مأخوذة من الممثل الموضوع العادي والمريض بنهل. (ب) PD-1+ الخلايا كنسبة من مجموع كتفه الخلايا. خطوط أفقية تمثل الوسيط، وتمثل أشرطة الخطأ بين الشريحتين الربعيتين. الوساطات إلى حد كبير (ش-اختبار مان-ويتني) مختلفة بين المواضيع العادية (21.5 في المائة، IQR = 10.8، ن = 12) ومرضى سرطان الغدد الليمفاوية ([مزل] 54.1 في المائة، IQR = 21.2، ن = 7، ف = 0.0008 وبنهل 45.2 ٪، IQR = 11.4، n = 9، ف = 0.0003). وقد تم تعديل هذا الرقم من بايفورد et al.21. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : CXCR3 و CCR6 التعبير وعلاقتها بالأرقام cTfh1- (أ) تدفق بياكسيال الخلوي الأرض عرض التعبير عن CXCR3 و CCR6 في خلايا CD4+ CD45RA– CXCR5+ الخلايا. مأخوذة من الممثل الموضوع العادي والمريض بنهل. (ب) خلايا cTfh1 كنسبة مئوية من مجموع كتفه الخلايا. خطوط أفقية تمثل الوسيط، وتمثل أشرطة الخطأ بين الشريحتين الربعيتين. الوساطات إلى حد كبير (ش-اختبار مان-ويتني) مختلفة بين المواضيع العادية (20.8 في المائة، IQR = 6.7، ن = 12) ومرضى سرطان الغدد الليمفاوية ([مزل] 32.1%، IQR = 6.8، ن = 7، ف = 0.013، وبنهل 35.4 في المائة، IQR = 7.6%، ن = 9، ف = 0.0056). وقد تم تعديل هذا الرقم من بايفورد et al.21. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: التدفق الخلوي جسم الفريق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمثل هذا البروتوكول بطريقة بسيطة وفعالة لتحليل خلايا الدم المحيطية كتفه، وتمكين الكشف عن جميع المجموعات الفرعية ذات الصلة المحددة في الأدب حتى الآن. عينات الدم ويمكن بسهولة وكفاءة الحصول كما يمكن جمع جزء من العيادات الخارجية القياسية وعينات المسلسل بالتوازي مع البيانات السريرية. بدوره، وهذا يتيح الدراسات المستقبلية تقييم مجموعات فرعية كتفه كالمؤشرات الحيوية لتطور المرض أو استجابة للعلاج. أن ما يبرر هذه الدراسات خاصة في المرض حيث تورط طفح التقلبات في أمراض مثل المناعة الذاتية، وأنواع معينة من السرطان الصلبة ودموية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن التحقيق فيها التغييرات في كتفه الدالة في المرض عن طريق فرز الخلايا كتفه باستخدام التدفق الخلوي كما تستخدم علامات سطح الخلية فقط في هذا البروتوكول. فرز الخلايا كتفه في المرضى [مزل] مكنتنا من البحث عن الاختلافات في الجينات ملامح التعبير عند مقارنتها بالمواضيع العادية21.
لقد وجدنا أن كفاءة خلايا CD4+ تي خلية عزل تحسين تحليل البيانات. ونحن تصف الخطوات التي تنطوي عليها بالتفصيل لأن قضايا ثانوية مثل أجهزة الطرد المركزي الكبح والسرعة الحرجة لإجراءات العزل. خطوة هامة أخرى، أما بالنسبة لكل تحليل التدفق الخلوي، لتعيين تعويض وضوابط FMO.
يختلف التعبير PD-1 على كتفه الخلايا وهذه الخلايا مع أعلى PD-1 قد تكون أكثر وظيفية وذلك ذات الصلة، لا سيما لدراسة أمراض المناعة الذاتية11،12. واحد مسألة هامة أن تقرر بوابة للتعرف على PD-1مرحبا الخلايا، مجموعة فرعية كتفه المنشط، كما لا يوجد معيار حد المعرفة في الأدب. هذا مهم ولكن ثانوية الفرعية يعكس على الأرجح التمايز طفح النشطة في الأنسجة اللمفاوية11. للتغلب على هذا التحدي، كان تعيين العتبة أن كان نفس المطلوبة للكشف عن خلايا طفح حسن النية من لوزة البشرية مع نفس الفريق الضد. نحن ندرك أن الحصول على اللوزتين قد تكون إشكالية بالنسبة لبعض المستخدمين. بديل لذلك، سيكون لتوسيع الفريق الضد المستخدمة في هذا البروتوكول بإضافة المضادة-نظام ايكوس، كما هي فقط PD-1مرحبا خلايا ICOS+ 12.
نقدم هنا، هيئة جسم للكشف عن السطح علامات مميزة لتعميم CD4+ خلايا تي. تعميم خلايا تنظيمية تي الحبيبي (كتفر) هي حجرة ذاكرة الدم الخلايا التنظيمية تي الحبيبي (معدل الخصوبة الإجمالي) المقيم في الأنسجة اللمفاوية ولديها أدوار هامة في تنظيم مركز جيرمنال رد22،23 . كتفر بالدم CD4+ CXCR5+ الخلايا علامات خلية T التنظيمية أن إكسبرس المشارك بما في ذلك عامل النسخ FoxP3. قياس كتفر جنبا إلى جنب مع كتفه قد توفر صورة أكثر اكتمالا للنشاط في مركز جيرمنال، ويمكن تقديم العلامات البيولوجية المرض في جانبها الأيسر24. على الرغم من أن الأرقام كتفر أصلاً منخفضة (يعني: 1.82%، التنمية المستدامة: 1.40، ن = 24 من مجموع خلايا CD4 خلايا+ في تجاربنا الخاصة)، فصل كتفر من كتفه ستزيد أيضا خصوصية تحليل كتفه. إضافة مجموعة من علامات سطح الخلية تي تنظيمية محددة لفريقنا مثل CD25 و CD12725 سيمكن من الكشف عن كتفر بالإضافة إلى جميع مجموعات فرعية كتفه في نفس التجربة باستخدام بروتوكول مماثل جداً. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام علامة التنظيمية داخل الخلايا أكثر كلاسيكية FoxP3، على الرغم من أن هذا يتطلب التثبيت و permeabilization منع الاختبارات الوظيفية المتلقين للمعلومات. في التركيز على تحليل كتفه، ومع ذلك، هناك أيضا مزايا لتعريف لوحة الحد أدنى التي يمكن أن تستخدم بالاقتران مع سيتوميتير تدفق مختبر قياسية للحصول على سريرياً أو نتائج مفيدة تجريبيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد الأعمال منحة من سرطان الدم المملكة المتحدة ETB ومجا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL TECHNOLOGIES | 15062 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17144003 | |
| BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 | BD Horizon | 565223 | |
| BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 | BD Horizon | 563923 | |
| BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 | BD Horizon | 562747 | |
| BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone RPA-T4 | BD Horizon | 564419 | |
| PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 | BD Pharmingen | 557946 | |
| APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone HI100 | BD Pharmingen | 560674 | |
| LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | ThermoFisher Scientific | L34973 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD Horizon | 563794 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD CompBead | 552843 | |
| FACS Aria II Flow Cytometer | BD Biosciences | 644832 | |
| FACSDiva 6.1.3 | BD Biosciences | 643629 | Flow Cytometer Acquisition Software |
| FlowJo 10.2 | Treestar Inc. | Flow Cytometry Data Analysis Software | |
| Anti-CXCR3 antibody | BD Horizon | 565223 | |
| Anti-CCR6 antibody | BD Horizon | 563923 | |
| Anti-CXCR5 antibody | BD Horizon | 562747 | |
| Anti-CD4 antibody | BD Horizon | 564419 | |
| Anti-PD-1 antibody | BD Pharmingen | 557946 | |
| Anti-CD45RA antibody | BD Pharmingen | 560674 | |
| Viability Marker | ThermoFisher Scientific | L34973 |
References
- Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. Follicular Helper T Cells. Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325 (5943), New York, N.Y. 1001-1005 (2009).
- Breitfeld, D., et al. Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production. The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).
- Linterman, M. A., et al. Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity. The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).
- Bindea, G., et al. Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer. Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).
- Gu-Trantien, C., et al. CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).
- Amé-Thomas, P., et al. Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells. Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).
- Bossaller, L., et al. ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells. The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).
- Morita, R., et al. Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion. Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).
- Locci, M., et al. Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses. Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).
- He, J., et al. Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure. Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).
- Schmitt, N., Bentebibel, S. -E., Ueno, H. Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood. Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).
- Simpson, N., et al. Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).
- Wang, J., et al. High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis. Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).
- Ueno, H. Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease. Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).
- Maecker Holden, T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Jia, Y., et al. Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression. PLOS ONE. 10 (2), 0117458 (2015).
- Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin's lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma. PLOS ONE. 13 (1), 0190468 (2018).
- Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. Journal of Experimental Medicine. 204 (8), 1849-1861 (2007).
- Duan, Z., et al. Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis. Oncotarget. 6 (42), 44239-44253 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production. Lupus. 24 (9), 909-917 (2015).
- Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood. Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).
- Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties. The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).
- Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging. Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).
- Yu, N., et al. CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).
