Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av CD4+ T-celler och analys av cirkulerande T-follikulär Helper (cTfh) Cell Subsets från perifert blod använder 6-färg flöda flödescytometri

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58431
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Leicester Cancer Research Centre and Ernest and Helen Scott Haematology Research Institute, University of Leicester, 2MRC Toxicology Unit, University of Leicester

Summary

Här, ett protokoll för isolering och karakterisering av CD4+ T-cell delmängder från perifert blod beskrivs. Renat CD4+ T-celler analyseras av flödescytometri att bestämma andelen T-follikulär helper cell delmängder.

Abstract

Avvikande T-follikulär helper (Tfh) cellsaktivitet detekteras i autoimmuna tillstånd och deras närvaro är associerade med kliniska resultat när den lymfkörtel närmiljön i B-cells non-Hodgkins lymfom är analyserat. Delmängder av cirkulerande T-follikulär hjälpare celler (cTfh), den cirkulerande minne facket Tfh celler i blodet, är också oroade i sjukdom och därför representerar potentiella nya Prediktiva biomarkörer. Perifert blod-baserad testning är fördelaktigt eftersom det är relativt icke-invasiv och tillåter enkel seriell övervakning. Den här artikeln beskrivs en metod för att isolera CD4+ T-celler från humanblod, och vidare analys av flödescytometri att räkna upp cTfh celler och proportionerna av deras olika undergrupper (cTfhPD-1-/ +/ hi, cTfh1, 2, 17 och cTfh1/17). Nivån på dessa grupper jämfördes sedan mellan friska försökspersoner och patienter med lymfom. Vi hittade att metoden var tillräckligt robust för att få tillförlitliga resultat från rutinmässigt insamlade patientmaterial. Den teknik som vi beskriver för analys kan enkelt anpassas till cell sortering och nedströms tillämpningar såsom RT-PCR.

Introduction

T-follikulär hjälpare celler (Tfh) är en CD4+ T-cell delmängd som kännetecknades inledningsvis i lymfvävnad1. Dessa celler uttrycker PD-1 och CXCR5 yta receptorer, utsöndrar IL-21 och IL-4 och Visa nukleära uttryck av Transkriptionfaktorn, BCL-62,3. Som namnet antyder, de finns i stilbildande centrum och är en förutsättning för hög affinitet antikropp produktion1.

Dysregulated Tfh Svaren har varit inblandade i sjukdomspatogenes, framför allt autoimmun sjukdom, där de främjar utbyggnaden av autoreaktiva B celler4. De spelar också en roll i den tumör mikromiljö både solid5,6 och lymfoida cancerformer7. Omvänt, genetiska defekter yta proteiner viktiga för Tfh fungera såsom inducerbara T-cell costimulator (ICOS) resultatet i humant immunbristvirus syndrom8. CD4+ CXCR5+ celler i perifert blod betecknas cirkulerande T-follikulär hjälpare celler (cTfh) och tros vara minne facket Tfh celler i vävnader9. Syftet med den metod som beskrivs här är analysen av cTfh grupper efter CD4+ cell isolering från perifert blodprover.

Flera cTfh undergrupper har definierats och effektivitet som de ger B-cell hjälp skiljer sig från en delmängd till en annan9,10,11,12. De relativa proportionerna av dessa grupper är förändrade på ett antal sjukdomar, mest framträdande autoimmun sjukdom där det är nästan alltid en relativ ökning i mer funktionell PD-1+/ Hej eller cTfh2 eller cTfh17 grupper i jämförelse med mindre funktionella PD-1– eller cTfh1 delmängder12. Omfattningen av dessa förändringar ofta förknippar med kliniska parametrar inklusive sjukdom aktivitet och autoantikroppar titrar, indikerar en potentiell roll av cTfh delmängd distribution som en prognostisk biomarkörer i sjukdomen, vilket kan återspegla aktiviteten av Tfh i lymfvävnad9,12,13,14. Dessutom att ta blodprov från deltagarna är snabb, säker och godtagbar, och så tillåter seriell övervakning för analys av sjukdomsprogression eller behandlingssvaret.

Användningen av isolerade CD4+ T-celler över traditionella perifera mononukleära (PBMNC) cellsuspensioner möjliggör högre genomströmning flöde flödescytometri experiment genom att minska den tid som krävs för att förvärva ett betydande antal cTfh celler för analys. Detta är särskilt användbart när sortering celler från sällsynta cTfh undergrupper med hjälp av flöde aktiverad cell sortering (FACS). För att underlätta effektiviteten, dessa suspensioner kan förvaras i fryst tillstånd för att aktivera ”dosering” av prover som skall användas i flödet flödescytometri experimentet. Vid provtagning, CD4+ renhet inte minskade frysförvaring.

Medan olika laboratorier används olika markörer för att kategorisera cTfh celler i de tidiga stadierna av sin upptäckt, metoden presenteras här använder sig av ett enhetligt system av två grupper av cellytan markörer som föreslagits av Schmidt et al.12, 15 till möjliggöra samtidiga identifiering av cTfh och deras nio erkända undertabeller i en enda flödescytometri experimentera.

Som enda cell yta markörer används, cellerna kräver inte fixering eller permeabilisering, och således kan förbli levande för nedströms funktionella studier. Detta kan underlättas genom cell sortering med FACS med samma antikropp panel. Denna panel kan utvidgas för att omfatta andra markörer, möjliggör begränsningarna av den flödescytometer används.

Analysen av flerfärgade flöde flödescytometri experiment kan vara utmanande natur subjektiv pågrund av gating på 2-dimensionella dot tomter, särskilt när cellpopulationer inte har en tydlig bi-modal fördelning i markör fluorescens, som är den fall för cTfh celler och deras undergrupper. Därför är det absolut nödvändigt att inrätta effektiva kontroller för att minska artefakter att möjliggöra bättre upplösning av populationer och ange gating strategier tryggt. Som sådan, antikropp panel design och uppsättning av grundläggande kontroller för en flödescytometri experimentera, dvs använda ersättning och FMO kontroller beskrivs i steg 3.4.2 och 3.4.3,respectively.

Alla cTfh celler definieras som CD4+ CXCR5+ CD45RA–. Nivån på uttryck för den karakteristiska Tfh aktivering markören PD-1 kan sedan bestämmas att identifiera delmängder av PD-1-, PD-1+ eller PD-1Hej cTfh celler. Sedan använda en kombination av chemokine receptorerna CXCR3 och CCR6, som uttrycks differentially av traditionella Th1, 2 eller 17 celler, cTfh kan karakteriseras som cTfh1, 2 eller 17-liknande av en profil av CXCR3+ CCR6-, CXCR3– CCR6- , och CXCR3– CCR6+, respektive.

Panelen antikropp används av vårt laboratorium visas i tabell 1. Användaren kan behöva anpassa sin fluorophore urval för att redogöra för laser och ljus-filterkonfiguration tillgänglig på deras lokala flödescytometer.

Följande överväganden påverkar valet av fluorophores. Använd ljusa fluorophores där så är möjligt. I synnerhet använda den ljusaste tillgängliga fluorophores på dämpad (mindre starkt uttryckt) markörer. Dimmer markörer inkludera PD-1, CXCR3 och CCR6, och i mindre utsträckning, CXCR5. Vi särskilt utnyttjat de nyare BB, BV och BUV fluorophores som ger utmärkt ljusstyrka och därmed aktivera lättare upplösning av distinkta populationer av celler.

Spridda fluorophore markeringen över utsläpp spektra så mycket som möjligt för att minimera spektrala överlappning och därmed ersättning krävs. En gratis, online-verktyg som kan användas för att hjälpa till att utforma en flöde flödescytometri panel kan hittas här: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. För att spara utrymme på emissionsspektrum, vi anställt en ”dump-kanal” genom att använda ett livskraft färgämne med emissionsvåglängden som överlappar med det av APC-H7 (konjugerat till CD45RA) för att aktivera den upptäckt och uteslutning av båda döda eller CD45RA+ med en enda detektor.

Här presenteras ett protokoll för isolering av perifert blod CD4+ T-celler och deras efterföljande analys av flödescytometri att bestämma proportionerna av de olika och nyligen beskriven cirkulerande delmängder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Blodprov erhölls från normala individer (NS) (n = 12) samt patienter med marginell zone lymfom (MZL) (n = 7) och andra typer av B-cells non-Hodgkins lymfom (BNHL) (6 FL patienter, 2 lymfoplasmacytiskt lymfom patienter och 1 låggradig B-cell Non-Hodgkins lymfom inte annat anges patient). Patienterna rekryterades från hematologi klinikerna på Leicester Royal Infirmary efter att ha gett informerat, skriftliga medgivande, med etiskt godkännande för alla studier. Etiskt godkännande erhölls av Leicestershire, Northamptonshire och Rutland forskning etiska kommittén 1, referens 06/Q2501/122 för patientprover och forskning HRA (Health Authority) NRES kommittén East Midlands-Derby, referera 14/EM/1176 för normala individer.

1. isolering av CD4+ T-celler från hela perifert blod

  1. Ta färska perifert blod (2 till 15 mL) K2EDTA rör av standard venpunktion och process så snart som möjligt för att bibehålla maximal lönsamhet.
    Obs: Använd standard laboratorium personlig skyddsutrustning (kappa, handskar, glasögon) och utföra arbetet i en klass II biosäkerhet skåp.
  2. Ge blod och alla nödvändiga reagens (CD4+ anrikning cocktail, 2% fetalt bovint serum/fosfatbuffrad saltlösning (FBS/PBS), täthet lutning media och frysning medium om bevarandet celler) till rumstemperatur.
  3. Blanda blodet med en kommersiellt tillgänglig cocktail av antikroppar för anrikningen av mänskliga CD4+ T-celler. Använd 50 µL av reagens för varje 1 mL blod. Använda en 50 mL konisk polypropylen tub för 5 till 15 mL blod.
    Obs: Om du använder 2 till 4 mL blod, utföra det här steget i en 14 mL koniska polypropylen rör.
  4. Inkubera blandningen i rumstemperatur i 20 min.
  5. Späd blandningen med en lika stor volym 2% FBS/PBS
  6. Lager för denna utspädda blandningen ovanpå täthet lutning media långsamt för att undvika att störa gränssnittet och gå vidare till centrifugering omedelbart för att undvika diffusion av blodet i täthet lutning medium.
    1. För 2 till 3 mL blod, 3 mL täthet lutning medium i ett 14 mL koniska polypropylen rör, men för 4 mL blod, Använd 4 mL täthet lutning medium i ett 14 mL koniska polypropylen rör och för 5 till 15 mL blod , Använd 15 mL av täthet lutning medium i en 50 mL konisk polypropylen rör.
  7. Centrifugera skiktad blandningen i 20 min vid 1200 x g med broms vid 20 ° C.
    Obs: En temperatur lägre än omgivande kan leda till kontaminering med röda blodkroppar och granulocyter. En lägre hastighet kommer att orsaka CD4+ isolering processen misslyckas. Lämnar den paus som engagerade minskar cell avkastning. Använd en bänk topp centrifug med rotorer som kan stängas för att undvika aerosoler.
  8. Ta bort den berikade CD4+ celllagrar från gränssnittet använder en Pasteur-pipett.
    Obs: Det berikade celllagrar kommer att likna en standard ”buffy coat” av vit grumlig celler, men som endast CD4+ celler är närvarande, detta kommer naturligtvis att bli mindre och svårare att se.
  9. Lägga till 2% FBS/PBS till CD4+ celler upp till en total volym på 10 mL och sedan tvätta två gånger med 2% FBS/PBS genom centrifugering för 10 min vid 400 x g under varje tvätt.
  10. Återsuspendera pelleten i 2% FBS/PBS och räkna cellerna färgas med en vitala färgämnet (trypan blå) att fastställa cell nummer och livskraft.
  11. Valfritt steg: Omsuspendera 5 x 105 till 1 x 106 celler i frysning medium (10% dimetyl sulfoxid i FBS) i 1 mL portioner.
    Obs: Nivåer av vissa yta markörer kan ändras av cryo-bevarande och upptining. Det är därför mycket viktigt att alla prover behandlas konsekvent. För att minimera skillnaderna i analytiska variabler, var proverna cryo-bevarade och grupperade för analysen i denna studie.

2. flödescytometri

  1. Tina de nedfrysta CD4+ celler snabbt i ett vattenbad vid 37 ° C och tvätta en gång i förväg värmde medium (RPMI 1640 + L-glutamin kompletteras med 10% FBS och 1 x penicillin-streptomycin).
  2. Lägga till celler till 9 mL medium, Centrifugera under 5 minuter vid 400 x g och avlägsna supernatanten.
  3. Att resuspendera cellerna i 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS (50 µL) så att varje skick provas använder mellan 5 x 105 och 1 x 106 celler.
  4. Blanda cellerna med färgning buffert (50 µL).
    Obs: Lysande Stain buffert förhindrar olika färgning artefakter som kan störa dataanalys när två eller flera BV eller BUV fläckar används samtidigt på grund av inneboende kemiska egenskaper av dessa färgämnen. I enkel- eller ofärgade förhållanden, de 50 µL av lysande fläck buffert kan ersätta 50 µL av 1% BSA/PBS.
  5. Lägga till antikropparna i celler (enligt den ”volym används” kolumn i tabell 1) och inkubera på is i mörkret i 30 min.
  6. Tvätta cellerna två gånger i 1% BSA/PBS genom centrifugering för 3 min vid 600 x g under varje tvätt.
  7. Återsuspendera i 1% BSA/PBS (400 µL) och överföring till ett flöde flödescytometri förvärv rör.
  8. Vortex cellerna försiktigt innan uppgifter om en flödescytometer:

3. flöde flödescytometri kontroller och Set-up

  1. Med hjälp av en ofärgade prov, ange fotodiod spänningar så att lymfocyter kan skiljas från uppenbara skräp och döda celler (händelser med hög side scatter (SSC) och låg framåt scatter (FSC) område)16. Använda enskilda färgade prover, ange fotomultiplikatorn (PMT) spänningar så att positiva fluorescens kan urskiljas från bakgrunden fluorescens medan att se till att alla evenemang omfattas detekterbara skalan.
    Obs: En förbättring skulle vara att rita CV mot PMT spänning för varje betalning med svagt fluorescerande pärlor för att hitta den lägsta spänningen för optimal upplösning (”Peak 2” metod19).
  2. Konto för spektral överlappning genom att generera en kompensationsmatris med enstaka fläckar med fånga pärlor. Lägg till kommersiellt tillgängliga kompensation pärlor (60 µL) och negativ kontroll pärlor (60 µL) till 1% BSA/PBS (100 µL), och vortex.
    Obs: Fånga pärlor används måste matcha värdart och IgG-isotyp av antikropp används. Matrisen ersättning bör beräknas om partinumret för någon tandem färgämnen förändringar, som de kan visa betydande variabilitet i deras utsläpp spektra mellan massor.
  3. Lägga till en enskild antikropp (20 µL) och vortex.
  4. Odla i rumstemperatur i mörkret i 30 min.
  5. Centrifugera vid 200 x g i 10 min och kasta bort supernatanten.
  6. Återsuspendera i 1%BSA/PBS (500 µL) och vortex.
  7. Förvärva provet med en flödescytometer med hjälp av utsedda ersättning matrix generator i förvärvet programvaran enligt tillverkarens anvisningar.
  8. Använda FMO kontroller att styra placeringen av utfärda utegångsförbud för positiv markör fluorescens för dye spilla över, vilket är den huvudsakliga källan till bakgrunden fluorescens i experiment med ≥4 färger16. Följ de allmänna cellytan färgning protokoll som beskrivs i steg 3, men för varje villkor, utelämna en av fluorophores från färgning steg (där CD45RA utelämnas också utelämna live/dead fläcken). Förvärva 100.000 lymfocyter för varje villkor.
  9. Ange det gate positivitet ≤0, 5% av celler. Se figur 2 illustrerade exempel på FMO kontroller.

4. dataanalys

  1. Anställa en flödescytometer förvärv mjukvaran till sätta ett tröskelvärde på 5 000 enheter på parametern FSC att utesluta mycket små skräp.
  2. Använda en stoppa grind för att förvärva 10.000 cTfh celler (CD4+ CD45RA– CXCR5+).
    Obs: Den enskilda användaren kan samla in mer än 10.000 celler. Detta numrerar var en kompromiss mellan att samla tillräckligt med celler för att ge meningsfulla resultat och tiden för samling.
  3. Med ett FSC-område / SSC-området dot tomten, rita en ellips eller polygon gate Markera befolkningen av lymfocyter samtidigt utesluts skräp och öppet döda celler (händelser med hög SSC-området och låga FSC-området).
  4. Med ett FSC-område / FSC-bredd dot tomten, rita en polygon gate för att välja enstaka celler medan exklusive midjekort jacka (midjekort jacka har en ökad yta men liknande bredd att enstaka celler).
  5. Med ett FSC-område / CD45RA och livskraft markör dot tomten, rita en rektangulär grind för att välja live, CD45RA– celler (celler med en låg fluorescens för denna markör).
  6. Med ett FSC-område / CD4 dot tomten, rita en rektangulär grind Markera CD4+ celler (celler med en hög fluorescens för denna markör).
  7. Använda en CD4 / CXCR5 dot tomten, rita en rektangulär grind Markera CXCR5+ (dvs. cTfh) celler (celler med en hög fluorescens för denna markör).
  8. Med hjälp av en CXCR3 / CCR6 dot tomten, en quad gate för att indela cTfh celler i cTfh1, 2-17 celler (celler som är hög och låg för varje markör).
    Obs: Celler med fenotypen CD4+ CXCR5+ CXCR3+ CCR6+ är dåligt karakteriserat. Vi hänvisar till dessa celler som cTfh1/1718 eftersom konventionella helper T-celler (CD4+ CXCR5–) som övergår mellan Th17 och Th1 Visa uttryck för CXCR3 och CCR6 och har beskrivits som cTfh1/1719.
  9. Använda en PD-1 histogram, Använd verktyget utbud för att indela cTfh celler (eller om så önskas, den enskilda cTfh1, 2, 17 eller 1/17 grupper) till PD-1-/ + eller Hej populationer.
    Obs: Skillnaden mellan PD-1+ och PD-1Hej är inte väl definierad i litteraturen. Gränsen var satt som samma PD-1 intensitet krävs att upptäcka godtroende Tfh i mänskliga tonsill lymfocyter suspensioner med flödescytometri med samma antikropp panel. Alternativt kan en markör för ICOS läggas till panelen antikropp som endast PD1Hej celler är ICOS+.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Höga CD4+ renhet uppnås med hjälp av CD4+ isolering protokoll, som var pålitliga över alla blodprov testas av oss (menar: 96,6%, SD: 2,38, n = 31) (figur 3).

Identifiering av cTfh (CD4+ CXCR5+ celler) i ett representativt normala ämne presenteras (figur 4A). Andel av totala cTfh celler inom CD4+ celler hade en medianvärdet för 29,4% (mellan kvartil rad (IQR) = 10,8) över 12 normala individer. Flera studier över flera olika sjukdomar inklusive hepatocellulära carcinom17,20, systemisk lupus erytematösa11,21och reumatoid artrit11,14 har varit motstridiga förmåga att upptäcka en skillnad i total cTfh mellan heathy kontroller och patienter. Inga signifikanta skillnader i total cTfh mellan normala individer och MZL eller BNHL patienter (figur 4B)21.

Identifiering av PD-1 uttryck inom cTfh celler från ett representativt normala ämne och BNHL patienten för jämförelse visas i figur 5A. PD-1 uttrycket var betydligt högre i MZL och BNHL patienter än normala individer (figur 5B)21. Liknande höjningar av PD-1 uttryck har påvisats i flera autoimmuna sjukdomar11,12,13,14.

Identifiering av cTfh1, 2, 17 och 1/17 inom befolkningen av cTfh celler med hjälp av CXCR3 och CCR6 uttryck från en representativ normal individ visas i figur 6A. Andelen cTfh1 celler var betydligt högre i MZL och BNHL patienter än normala individer (figur 6B)21.

Figure 1
Figur 1 : Illustration av övergripande Usenets strategi används för att identifiera cTfh celler och deras undergrupper. En befolkning av lymfocyter särskiljs från överst till vänster, och de midjekort jacka är utesluten. Live CD45RA– celler är markerade med en ”dump-kanal”. CD4+ celler är gated och CXCR5+ celler identifieras som cTfh. cTfh är indelade i cTfh1, 2 eller 17-liknande med CXCR3 och CCR6 uttryck. PD-1 uttryck inom dessa undergrupper kännetecknas sedan. Siffror från ett representativt normal individ blodprov. FSC-A, FSC område. SSC-A SSC område. FSC-W, FSC bredd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Illustration av FMO styr. Varje biaxiell flöde flödescytometri tomt visar CD4+ celler som färgas med alla fluorophores utom en av intresse att visa ett minimum på som utfärda utegångsförbud för fluorescens positivitet kan ställas in. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Biaxial flöde flödescytometri tomt visar identifieringen av CD4 + celler efter gating levande lymfocyter. Tas från ett representativt normal individ blodprov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Identifiering av cTfh celler. (A) Biaxial flöde flödescytometri tomt visar CXCR5+ uttryck på gated för CD4-celler+ CD45RA–. Tagna från en representativ normal individ. (B) relativ procentandel av cTfh inom totala CD4+ celler hos normala försökspersoner (n = 12), MZL (n = 7), BNHL (n = 9). Horisontella linjer representerar medianen och felstaplar representera mellan kvartil rad. Inga signifikanta skillnader mellan grupperna med Mann-Whitney U test. Denna siffra har ändrats från Byford et al.21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : PD-1 uttryck och relation till celler som cTfh. (A) flöde flödescytometri histogram används för att bestämma PD-1 uttryck inom totala cTfh celler. Tagna från en representativ normal individ och BNHL patienten. (B) PD-1+ celler som andel av totala cTfh celler. Horisontella linjer representerar medianen och felstaplar representera mellan kvartil rad. Medianer är betydligt (Mann-Whitney U-test) olika mellan normala individer (21,5%, IQR = 10,8, n = 12) och lymfom patienter (MZL 54,1%, IQR = 21,2, n = 7, p = 0,0008 och BNHL 45,2%, IQR = 11,4, n = 9, p = 0.0003). Denna siffra har ändrats från Byford et al.21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : CXCR3 och CCR6 uttryck och deras förhållande till cTfh1 nummer. (A) Biaxial flöde flödescytometri tomt visar uttrycket av CXCR3 och CCR6 på CD4+ CD45RA– CXCR5+ celler. Tagna från en representativ normal individ och BNHL patienten. (B) cTfh1 celler som andel av totala cTfh celler. Horisontella linjer representerar medianen och felstaplar representera mellan kvartil rad. Medianer är betydligt (Mann-Whitney U-test) olika mellan normala individer (20,8%, IQR = 6,7, n = 12) och lymfom patienter (MZL 32,1%, IQR = 6,8, n = 7, p = 0,013 och BNHL 35,4%, IQR = 7,6%, n = 9, p = 0,0056). Denna siffra har ändrats från Byford et al.21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Table 1
Tabell 1: flöde flödescytometri antikropp panelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll utgör ett enkelt och effektivt sätt att analysera perifert blod cTfh celler, möjliggör upptäckt av alla relevanta grupper identifieras i litteraturen hittills. Blodprov kan enkelt och effektivt sätt erhållas som en del av standard poliklinisk kliniker och seriell prover kan samlas parallellt med kliniska data. Detta gör i sin tur prospektiva studier utvärdera cTfh delmängder som biomarkörer för sjukdomsprogression eller svar på behandling. Dessa studier skulle vara särskilt motiverat vid sjukdom där Tfh dysreglering är inblandad i patogenes som autoimmunitet och vissa typer av solid och hematologisk cancer. Förändringarna i cTfh-funktionen i sjukdom kunde dessutom undersökas genom att sortera cTfh celler med flödescytometri som enda cell yta markörer används i detta protokoll. Sortera cTfh celler i MZL patienter kunde vi hitta skillnader i gen uttryck profiler jämfört med normala försökspersoner21.

Vi hittade det effektiva CD4+ T-cell isolering förbättrad dataanalys. Vi beskriver de olika stegen i detalj eftersom mindre frågor såsom centrifug bromsning och hastighet var kritiska till förfarandet isolering. Ett annat viktigt steg, som för alla Flödesanalys för flödescytometri, är att ställa in kompensation och FMO kontroller.

PD-1 uttryck varierar på cTfh celler och celler med den högsta PD-1 kan vara den mest funktionella och därför relevant, särskilt för studiet av autoimmun sjukdom11,12. En viktig fråga var att bestämma utfärda utegångsförbud för identifiering av PD-1Hej celler, aktiverade cTfh delmängden, så det finns ingen standard gräns definieras i litteraturen. Denna viktiga men mindre delmängd återspeglar troligen aktiva Tfh differentiering i lymfoid vävnad11. För att övervinna denna utmaning, sattes tröskeln så att det var samma som krävs för att upptäcka godtroende Tfh celler från mänskliga tonsill med samma antikropp panel. Vi inser att få tonsillerna kan vara problematiskt för vissa användare. Ett alternativ vore att expandera panelen antikropp används i detta protokoll genom tillsats av anti-ICOS, som endast PD-1Hej celler är ICOS+ 12.

Här presenterar vi en antikropp panel för att upptäcka yta markörer för cirkulerande CD4 karakteristiska+ T-celler. Cirkulerande T-follikulär regulatoriska celler (cTfr) är blod minne facket av T-follikulär regulatoriska celler (Tfr) som är bosatta i lymfoid vävnad och har viktiga roller i regleringen germinal center reaktion22,23 . cTfr är blod CD4+ CXCR5+ celler att samtidig express T-reglerande cell markörer inklusive Transkriptionfaktorn FoxP3. Mäta cTfr tillsammans med cTfh kan ge en mer fullständig bild av aktiviteten i germinal center och kunde presentera en biomarkör i sjukdom i sin egen rätt24. Trots cTfr nummer är till sin natur låga (menar: 1,82%, SD: 1,40, n = 24 av totalt CD4+ celler i våra egna experiment), separera cTfr från cTfh skulle också öka specificiteten av cTfh analys. Lägg till en kombination av specifika T-reglerande celler-yta markörer till vår panel såsom CD25 och CD12725 skulle göra det möjligt för detektion av cTfr förutom alla cTfh grupper i samma experiment med ett mycket liknande protokoll. Alternativt, den mer klassiska intracellulära reglerande markören FoxP3 kan användas, men detta kräver fixering och vilket förhindrar nedströms funktionella analyser. Koncentrationssvårigheter på cTfh analys, men finns det också fördelar med att definiera en minsta panel som kan användas tillsammans med en standard laboratorium flödescytometer att erhålla kliniskt eller experimentellt användbara resultat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Arbetet stöds av ett bidrag från leukemi UK ETB och MJA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL TECHNOLOGIES 15062
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare Life Sciences 17144003
BUV395 Mouse Anti-Human CD183 Clone 1C6/CXCR3 BD Horizon 565223
BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6) Clone 11A9 BD Horizon 563923
BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185) Clone RF8B2 BD Horizon 562747
BB515 Mouse Anti-Human CD4 Clone  RPA-T4 BD Horizon 564419
PE Mouse Anti-Human CD279 Clone MIH4 BD Pharmingen 557946
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone  HI100 BD Pharmingen 560674
LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation ThermoFisher Scientific L34973
Brilliant Stain Buffer BD Horizon 563794
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set BD CompBead 552843
FACS Aria II Flow Cytometer BD Biosciences 644832
FACSDiva 6.1.3 BD Biosciences 643629 Flow Cytometer Acquisition Software
FlowJo 10.2 Treestar Inc. Flow Cytometry Data Analysis Software
Anti-CXCR3 antibody BD Horizon  565223
Anti-CCR6 antibody BD Horizon  563923
Anti-CXCR5 antibody BD Horizon  562747
Anti-CD4 antibody BD Horizon  564419
Anti-PD-1 antibody BD Pharmingen  557946
Anti-CD45RA antibody BD Pharmingen  560674
Viability Marker ThermoFisher Scientific  L34973

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. Follicular Helper T Cells. Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).
  2. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325 (5943), New York, N.Y. 1001-1005 (2009).
  3. Breitfeld, D., et al. Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production. The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).
  4. Linterman, M. A., et al. Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity. The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).
  5. Bindea, G., et al. Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer. Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).
  6. Gu-Trantien, C., et al. CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).
  7. Amé-Thomas, P., et al. Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells. Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).
  8. Bossaller, L., et al. ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells. The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).
  9. Morita, R., et al. Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion. Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).
  10. Locci, M., et al. Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses. Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).
  11. He, J., et al. Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure. Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).
  12. Schmitt, N., Bentebibel, S. -E., Ueno, H. Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood. Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).
  13. Simpson, N., et al. Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).
  14. Wang, J., et al. High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis. Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).
  15. Ueno, H. Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease. Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).
  16. Maecker Holden, T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  17. Jia, Y., et al. Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression. PLOS ONE. 10 (2), 0117458 (2015).
  18. Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin's lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma. PLOS ONE. 13 (1), 0190468 (2018).
  19. Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. Journal of Experimental Medicine. 204 (8), 1849-1861 (2007).
  20. Duan, Z., et al. Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis. Oncotarget. 6 (42), 44239-44253 (2015).
  21. Zhang, X., et al. Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production. Lupus. 24 (9), 909-917 (2015).
  22. Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood. Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).
  23. Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties. The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).
  24. Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging. Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).
  25. Yu, N., et al. CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).

Tags

Biologi fråga 143 CD4 T-celler flödescytometri perifert blod T-follikulär helper cell cirkulerande T-follikulär helper cell cell delmängder
Isolering av CD4<sup>+</sup> T-celler och analys av cirkulerande T-follikulär Helper (cTfh) Cell Subsets från perifert blod använder 6-färg flöda flödescytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Byford, E., Carr, M., Piñon,… More

Byford, E., Carr, M., Piñon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (143), e58431, doi:10.3791/58431 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter