Summary
نقدم هنا، على بروتوكول لشركة إيمونوبريسيبيتيشن ومقايسة نشاط الأنزيمي في حبة للدراسة في نفس الوقت مساهمة مجالات محددة من البروتين مستقبلات غشاء البلازما لأنزيم التوظيف ونشاط إنزيم.
Abstract
هي الإنزيمات المرتبطة بمستقبلات الوسطاء الرئيسية لتنشيط الهاتف الخلوي. هذه الإنزيمات وينظم، على الأقل في جزء منه، التفاعلات المادية مع ذيول هيولى مستقبلات. التفاعلات وكثيراً ما تحدث من خلال مجالات محددة من البروتين ويؤدي إلى تنشيط الإنزيمات. هناك عدة طرق لدراسة التفاعلات بين البروتينات. بينما co-إيمونوبريسيبيتيشن يستخدم عادة لدراسة المجالات التي تكون مطلوبة لتفاعلات البروتين البروتين، هناك لا فحوصات تلك الوثيقة مساهمة مجالات محددة لنشاط الإنزيمات المعينين في نفس الوقت. تبعاً لذلك، يجمع بين الأسلوب الموصوفة هنا co-إيمونوبريسيبيتيشن ومقايسة نشاط الأنزيمي في حبة للتقييم المتزامن للتفاعلات بين البروتينات والتنشيط الانزيمية المرتبطة بها. والهدف من هذا البروتوكول هو تحديد المجالات التي تعتبر بالغة الأهمية للتفاعلات الفيزيائية بين بروتين والانزيم والمجالات التي إلزامية للتنشيط الكامل للانزيم. وتتضح أهمية هذا الفحص، كبعض مستقبلات نطاقات البروتين تسهم الملزمة للانزيم بذيل هيولى المستقبلات، مع مجالات أخرى ضرورية لتنظيم وظيفة إنزيم نفس.
Introduction
مستقبلات الحفاز ومستقبلات تيروسين مؤنزم هي بروتينات transmembrane فيها أسباب ملزمة ليجند خارج الخلية النشاط الأنزيمي على الجانب داخل الخلية1. تمتلك بعض مستقبلات مستقبلات ووظائف الانزيمية، بينما آخرون توظيف إنزيمات معينة مثل مؤنزم وفوسفاتاسيس إلى ذيولها هيولى. التجنيد لأنزيم الذيل المستقبلات وعمل الحفاز اللاحقة لهذا الإنزيم هي عمليتين منفصلتين لا تخضع دائماً لنطاقات البروتين نفسه2. لسوء الحظ، هناك أية أدوات محددة لتقييم كل من التفاعل والنشاط الأنزيمي في وقت واحد. الإنزيم co-إيمونوبريسيبيتيشن الفنية الموصوفة هنا طريقة مفيدة لتشريح توظيف إنزيم بذيل مستقبلات من تنشيطه. ويستخدم هذا التحليل إيمونوبريسيبيتيشن مستقبلات الموسومة بالخرز المغلفة بالأجسام المضادة. في وقت لاحق، يتم تنفيذ كلا من تحليل النشاط الأنزيمي وتحليل لطخة غربية في الخرز. والهدف العام لهذا الأسلوب للكشف عن المجالات البروتينات التي هي ضرورية للتفاعلات بين المستقبلات والأنزيمات بتحليل لطخة غربية (تقييم) والمجالات التي هي إلزامية للتنشيط الكامل للإنزيمات (تقاس على حبة تحليل النشاط الأنزيمي). أنها هامة لتطوير أدوات لدراسة مهام منفصلة مرتبطة بمستقبلات الإنزيمات بسبب مشاركتهم في الآلية المرضية للأمراض التي تصيب الإنسان. وعلاوة على ذلك، قد تساعد المزيد من فهم آليات العمل هذه البروتينات تصميم التدخلات العلاجية الرواية.
المبرمجة الموت-1 (PD-1) مستقبلات مثبطة على سطح الخلايا التائية ومطلوب من أجل الحد من الاستجابات المفرطة T الخلية. وفي السنوات الأخيرة، قد تورط الأجسام المضادة-PD-1 في علاج الأورام الخبيثة متعددة1،2. ربط PD-1 يقيد العديد من المهام T الخلية، بما في ذلك انتشار والالتصاق وإفراز السيتوكينات متعددة3،،من45. يتم ترجمة PD-1 إلى المشبك المناعية، التفاعل بين خلايا تي وعرض مستضد الخلايا6، حيث أنها كولوكاليزيس مع خلايا تي مستقبلات (تكر)7. وفي وقت لاحق، الفوسفاتيز تيروزين SHP2 [Src التماثل 2 (SH2) المجال الذي يحتوي على تيروزين الفوسفاتيز 2] يتم تجنيده بذيل هيولى PD-1، مما أدى إلى ديفوسفوريليشن من بقايا تيروزين الرئيسية داخل تكر المعقدة وما يرتبط بها الدانية إشارات الجزيئات3،،من45،،من89. ذيل هيولى PD-1 يحتوي على اثنين تيروزين زخارف، إيمونوريسيبتور المستندة إلى تيروزين مثبطة فكرة (عيتيم)، ورمز التبديل على أساس فكرة (ITSM) تيروزين إيمونوريسيبتور10. يتم فوسفوريلاتيد على حد سواء زخارف عند PD-1 ربط9،10. وأظهرت الدراسات الطفرات دور أساسي ل ITSM في التوظيف، مقابل ايتيم، يتمثل دورها في إشارات PD-1 ووظيفة ليست واضحة SHP24.
SHP2 يعتمد أما مغلقة (مطوية)، وتحول دون تكيف أو مفتوح (الموسع)، تكيف النشط11. لا بعد توضيح مساهمة كل مجال ذيل PD-1 لربط SHP2 أو التنشيط. للإجابة على هذا السؤال، قمنا بتطوير مقايسة التي تمكن من اختبار موازية لتوظيف SHP2 بذيل PD-1 وفي النشاط12. استخدمنا co-إيمونوبريسيبيتيشن ومقايسة نشاط الفوسفاتيز في حبة لاختبار كل من التفاعل والنشاط الأنزيمي بالتوازي. باستخدام هذا الفحص، ونحن تبين أن "مقدمو الخدمات" PD-1 كافية لتوظيف SHP2 بذيل PD-1، بينما يلزم ايتيم PD-1 تماما توسيع وتنشيط الإنزيم.
وهناك العديد من المستقبلات التي لديها العديد من المجالات المجاورة في ذيولها هيولى. يمكن كشف التحليل وظيفية co-إيمونوبريسيبيتيشن دور المجالات المحددة التي ضرورية لتعيين البروتين أو التنشيط الانزيمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-تعداء الخلايا
- البذور HEK 293T الخلايا إلى اثني عشر لوحات 10 سم (5 × 106 خلايا للوحة الواحدة) في اليوم السابق تعداء (الشكل 1). إجراء عد الخلايا استخدام هيموسيتوميتير. لكل لوحة، استخدام 10 مل دميم وتستكمل مع 10% FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في شركة 5%2.
- عندما تكون الخلايا روافد 80-90 ٪، ترانسفيكت 5 لوحات HEK 293T استخدام كاشف تعداء على أساس المادة الدهنية مع واحدة من البلازميدات التالية: ناقل التعبير عن SHP2، ناقل PD-1-التجارة والنقل-وإذ يعرب عن [إصدار نوع البرية (WT) PD-1]، وإصدار تحور ايتيم (Y223F ) ناقل PD-1-التجارة والنقل-وإذ يعرب عن، وعلى إصدار تحور مقدمو الخدمات (Y248F) من ناقل PD-1-التجارة والنقل-وإذ يعرب عن (الشكل 1).
ملاحظة: سوف transfected لوحات اثنين مع ناقل WT PD-1-التجارة والنقل-وإذ يعرب عن. لوح إضافي واحد سيكون بمثابة عنصر تحكم غير transfected خلايا (الشكل 1). - أداء تعداء وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة للخلايا ملتصقة في لوحات 10 سم.
ملاحظة: في إصدارات تحور PD-1، التيروزين (Y) في كل فكرة حلت فينيلألانين (و) التي لا يمكن أن تكون فوسفوريلاتيد. - ترانسفيكت مجموعة متطابقة ثانية من خمس لوحات ولوحة إضافية واحدة تخدم كعنصر تحكم غير ترانسفيكتيد لقياس كمية البروتين أعرب [الإدخال؛ ويعرف أيضا باسم خلية كله ليستي (الاتحاد)] قبل إيمونوبريسيبيتيشن (الشكل 1).
- احتضان الخلايا transfected ح 48 في 37 درجة مئوية، 5% CO2 في حاضنة زراعة الأنسجة.
ملاحظة: لضمان أن تعداء حدث بنجاح، فحص الخلايا للتعبير التجارة والنقل باستخدام مجهر فلوري.
2-تشجيع الفسفرة في الخلايا ترانسفيكتيد
- بعد الحضانة، إعداد بيرفاناداتي الطازجة بخلط 50 ميليلتر من أورثوفاناداتي الصوديوم (من الأسهم 100 ملم) مع 50 ميليلتر من 30 ٪ ح2س2.
ملاحظة: يجب تغيير هذا الخليط إلى لون الأصفر. بيرفاناداتي هو مثبط الفوسفاتيز نفاذية خلية التي تعزز الفسفرة تيروزين بقايا13. في هذا الفحص، يتم استخدامه للحث على قوة الفسفرة ذيول PD-1. - فوسفوريلاتي إصدارات المعلمة PD-1، قم بإزالة الوسائط من الخلايا PD-1-التجارة والنقل-ترانسفيكتيد وإضافة 10 مل دميم عادي (دون المصل أو المضادات الحيوية) جنبا إلى جنب مع 10 ميليلتر من بيرفاناداتي (الخطوة 2، 1) لكل لوحة 10 سم (أسفر عن ثمانية لوحات معربا عن إصدارات مختلفة من PD-1) (الشكل 1). وضع اللوحات في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: SHP2 transfected الخلايا (لوحات اثنين. الشكل 1) ولوحات التحكم غير transfected اثنين لا تعامل مع بيرفاناداتي، ﻷن هذه اللوحات ستكون بمثابة المصدر لأنزيم SHP2 النشطة. - تغسل الخلايا مع 5 مل من المثلج x 1 برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة مرتين.
3-إيمونوبريسيبيتيشن
ملاحظة: يجب أن يكون تنفيذ الخطوات التالية على الجليد أو عند 4 درجة مئوية.
- الملحق تحلل المخزن المؤقت (50 مم من HCl تريس في الرقم الهيدروجيني 7.2، 250 ملم كلوريد الصوديوم، 0.1% NP-40، 2 مم يدتا، والغليسيرول 10 ٪) مع مثبطات البروتياز (قرص ذوب 1 في 10 مل من المخزن المؤقت لتحلل) ومع أورثوفاناداتي الصوديوم 1 مم. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل المثلج للخلايا وإزالة وجمع الخلايا من لوحات فورا باستخدام مكشطة خلية.
ملاحظة: من المهم إضافة أورثوفاناداتي الصوديوم إلى تفسخ المخزن المؤقت الذي سيتم استخدامه لوحات PD-1-التجارة والنقل-ترانسفيكتيد، حيث يجب الاحتفاظ بلوحات ترانسفيكتيد SHP2 ولوحات التحكم غير transfected النشاط الفوسفاتيز فقط. - نقل ليساتيس إلى 1.5 مل الأنابيب الباردة واستدارتها في 0.005 س ز، 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- جمع وظيفة الأنوية طافية (السندات الإذنية) من ليساتيس، تدور أسفل ليساتيس لمدة 10 دقيقة في 10,000 س ز في 4 درجات مئوية ونقل سوبيرناتانتس في أنابيب جديدة. تجاهل بيليه. تخزين سوبيرناتانتس المجموعة الثانية من ست لوحات (الشكل 1) على الجليد لتحليلها لاحقاً الاتحاد العالمي للعمل.
-
تعيين إعداد الخرز المضادة-التجارة والنقل إيمونوبريسيبيتيشن PD-1-التجارة والنقل من ليساتيس PD-1-التجارة والنقل-ترانسفيكتيد الأولى (أربع لوحات) (الشكل 1).
- لمنع تسوية الخرز، بلطف يهز الزجاجة مع الخرز قبل الافتتاح. إزالة 40 ميليلتر من الخرز المضادة-التجارة والنقل من الطين في كل حالة.
- تدور في 500 x ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية لغسل الخرز.
ملاحظة: من المهم تقليل الاتصال بين النصائح ماصة البلاستيك والخرز [اغروس] لمنع الخسارة. من المستحسن لقطع حافة تلميح ميليلتر 200 قبل نقل الخرز إلى أنبوب آخر. - ريسوسبيند الخرز في 80 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت (لكل عينة).
- إضافة الخرز غسلها مباشرة إلى الخلية ليستي (السندات الإذنية) من الخلايا PD-1-التجارة والنقل-وإذ يعرب عن المجموعة الأولى (أربع لوحات) (الخطوة 3، 3). تدوير في 0.005 x ز لمدة 30 دقيقة عند 4 درجة مئوية للبروتينات إيمونوبريسيبيتاتي معلم التجارة والنقل.
- أغسل حبات مع 1 مل من تحلل الباردة المخزن المؤقت (بدون أورثوفاناداتي) 3 مرات. الطرد المركزي الأنبوب في س 2,500 ز ل 10 ق.
ملاحظة: عند إضافة المخزن المؤقت تحلل الخرز، إضافته مباشرة على الخرز دون لمسها مع النصائح. ليست هناك حاجة "الماصة؛" صعودا وهبوطاً خلال يغسل. - أيضا تقسيم من SHP2 النشطة من المجموعة الأولى (لوحة واحدة؛ الخطوة 3.3) وإضافته إلى ثلاثة أنابيب من الخرز PD-1-التجارة والنقل-تتضمن غسلها (WT PD-1-بروتينات فلورية خضراء والطفرات فوسفديفيسينت مختلفة اثنين، Y223F و Y248F). إضافة ثلث الحجم من ليساتي الخلايا غير transfected إلى الأنبوب الثاني من الخرز WT PD-1-التجارة والنقل. تجاهل-الثلثين المتبقيين.
- احتضان الخرز ح 4 في 4 درجات مئوية مع تناوب لطيف (0.005 س ز).
- أغسل حبات مرتين مع 1 مل من تحلل الباردة المخزن المؤقت (بدون بيرفاناداتي أو أورثوفاناداتي)، كما ورد في الخطوة 3، 6.
- إضافة ميليلتر 80 تحلل المخزن المؤقت (بدون بيرفاناداتي أو أورثوفاناداتي) كل عينة ضمان أن الحجم الإجمالي في كل أنبوب 100 ميليلتر (20 ميليلتر من الخرز) و 80 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت. المزيج بلطف ونقل 50 ميليلتر من كل أنبوبة إلى أنبوبين الطازجة 1.5 مل.
ملاحظة: بعد هذه الخطوة، سيكون هناك اثنان أنابيب مملوءة بخليط يحتوي على الخرز وتحلل المخزن المؤقت: سيتم استخدام أنبوب واحد لاختبار SHP2 co-إيمونوبريسيبيتاتيد من النشاف الغربية، والثاني سيتم استخدامه لتحليل النشاط الفوسفاتيز.
4-الفوسفاتيز نشاط الإنزيم
- أغسل حبات مرة واحدة مع المخزن المؤقت ليغسل الفوسفاتيز (30 ملم من هيبيس على درجة الحموضة 7.4 و 120 ملم كلوريد الصوديوم). إزالة المادة طافية تماما.
- إضافة 100 ميليلتر الإنزيم المخزن المؤقت (30 ملم من حبيس في درجة الحموضة 7.4، 120 مم كلوريد الصوديوم، 5 مم DTT، 10 مم فنيتروفينيلفوسفاتي) الخرز، واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تحت الانفعالات لطيف. ملاحظة: وقت الحضانة قد تختلف، ولكن انتظر حتى المخزن المؤقت يتحول إلى اللون الأصفر عند ديفوسفوريليشن.
- إنهاء رد فعل، إضافة 50 ميليلتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم عند المخزن المؤقت يتحول إلى اللون الأصفر.
- زيادة ونقصان لأسفل في س 2,500 ز ميليلتر 50 s ونقل 10 من المادة طافية على بئرين (التكرارات مع 50 ميليلتر للبئر الواحد) من منطقة نصف في صفيحة 96-جيدا. قراءة امتصاص في 405 نانومتر.
- التعبير عن النتائج الكثافة البصرية النسبية (OD) عبر إصدار PD-1-التجارة والنقل البرية من نوع عنصر التحكم.
5-SHP2 تحليل لطخة غربية
- تدور أسفل الخرز وإزالة المادة طافية.
- إضافة 20 ميليلتر من المخزن المؤقت x Laemmli 2 (انظر الجدول المواد) بالخرز ويغلي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- قياس تركيز البروتين الإدخال عناصر التحكم (ثاني تعيين) من اتفاق التعاون الأساسي باستخدام كيت (انظر الجدول المواد). نقل 30 ميليلتر من العينة الأكثر المخفف لأنبوب جديد. تمييع بقية عناصر تحكم الإدخال مع تحلل المخزن المؤقت إلى تركيز نفسه كنموذج آخر المخفف، ونقل 30 ميليلتر من كل منها إلى أنبوب جديد.
ملاحظة: بعد هذه الخطوة، سيكون هناك أنابيب 4 مع كل منها 30 ميليلتر في تركيزات البروتين مماثلة، تمثل المدخلات يتحكم ليساتيس. - إضافة كميات متساوية من المخزن المؤقت x Laemmli 2 ليساتيس ويغلي عند 95 درجة مئوية للحد الأدنى 5 تدور أسفل الخرز وتحميل المادة طافية على 4 – 20% هلام القائم على الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تريس (انظر الجدول المواد) للغربية لطخة تحليل. وبالإضافة إلى ذلك، تحميل 50 ميليلتر من كل عينة من المجموعة الثانية.
- مواصلة تحليل لطخة غربية ووفقا للبروتوكول الموصوفة سابقا12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بينما يتم إنشاء المساهمة من ITSM PD-1 لربط SHP2، ودور ايتيم PD-1 أقل وضوحاً. بسبب SHP2 بين المجالات SH2 الذي يمكن ربطه باثنين فوسفوتيروسينيس متسلسلة على PD-1 (تيروزين واحدة في ITSM)، والآخر في "عيتيم"، افترضنا أن المراسي "مقدمو الخدمات" PD-1 SHP2 PD-1، بينما يسهل ايتيم PD-1 النشاط SHP2 بتحقيق الاستقرار في فتح الدولة كونفورماشونال11،14. لاختبار ذلك، قمنا بتطوير إيمونوبريسيبيتيشن co مجتمعة والمقايسة النشاط الأنزيمي للتقييم موازية للتفاعلات مستقبلات إنزيم والتنشيط. نوع البرية 1-التجارة والنقل-PD، Y223F التجارة والنقل-PD-1 (عيتيم متحولة)، أو بروتينات فلورية خضراء-PD-1 Y248F (مقدمو الخدمات المسخ) أبديت في الخلايا HEK 293T التي كانت تعامل في وقت لاحق مع بيرفاناداتي (الشكل 1)، مما يؤدي إلى فوسفوريلاتيد PD-1 ذيول. وجمعت البروتينات PD-1 استخدام الخرز المضادة بروتينات فلورية خضراء المغلفة. واستخدمت هذه الخرز لشركة SHP2-إيمونوبريسيبيتيشن من ليساتيس للخلايا overexpressing SHP2. وسجلت مستويات SHP2 ملزمة لكل إصدار من PD-1 ونشاطها الأنزيمي.
لا غرابة، SHP2 فشل في ربط PD-1 عندما كان المتحولة مقدمو الخدمات (Y248F؛ الشكل 2 (أ)). بشكل ملحوظ، أعاق إصدار متحولة ايتيم (Y223F) SHP2 ملزمة إلا بدرجة محدودة (الشكل 2). ومع ذلك، تحليل النشاط الفوسفاتيز SHP2 كشفت أن ايتيم ومقدمو الخدمات على قدم المساواة لا غنى عنها للنشاط الأنزيمي (الشكل 2). منذ إيمونوبريسيبيتاتيس PD-1 قد تحتوي على فوسفاتاسيس الأخرى، بالإضافة إلى SHP2، استخدمنا شرط تحكم (الشكل 2 ج 2، الأزرق) الذي كان أوفيريكسبريسيد لا SHP2.
ومن ثم فهو كشف نموذج تنشيط خطوتين التي يتم طي SHP2 تكيف إعاقة السيارات تحت يستريح الشروط (الشكل 2D، اليسار). عند التنشيط PD-1، يتم تجنيد SHP2 إلى ITSM فوسفوريلاتيد (الشكل 2D، الأوسط). ومع ذلك، يجب أيضا فوسفوريلاتيد عيتيم تتكشف SHP2 إلى أن تكيف النشطة (الشكل 2D، حق).
رقم 1: استراتيجية والظروف التجريبية. بروتينات فلورية خضراء-PD-1 وزن (نوع البرية)، والتجارة والنقل-PD-1 Y223F (عيتيم متحولة)، أو بروتينات فلورية خضراء-PD-1 Y248F (مقدمو الخدمات المسخ) أبديت في الخلايا HEK 293T التي كانت تعامل في وقت لاحق مع بيرفاناداتي. مختلطة مع ليساتيس من الخلايا overexpressing SHP2 فوسفوريلاتيد البروتينات بروتينات فلورية خضراء-PD-1 التي جمعتها إيمونوبريسيبيتيشن التجارة والنقل، وسجلت مستويات ونشاط SHP2 ملزمة لكل إصدار من PD-1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: عيتيم PD-1 ضروري لنشاط SHP2- تم transfected الخلايا 293T HEK مع الإصدارات المشار إليه للتجارة والنقل-PD-1، تليها العلاج بيرفاناداتي وإيمونوبريسيبيتيشن باستخدام مكافحة التجارة والنقل ماب-[اغروس] (). مستويات SHP2 منضمة إلى سرع بروتينات فلورية خضراء-PD-1 كمياً (ب) وتعرض مقايسة نشاط الفوسفاتيز (ج). تم تطبيع قيم SHP2 سحبت إلى أسفل إلى مستويات التعبير التجارة والنقل. وتكون كافة القيم تغير إضعاف مقارنة مع كثافة SHP2 سرع بوزن بروتينات فلورية خضراء-PD-1 (النوع البري). قيم النشاط الفوسفاتيز تغير إضعاف مقارنة مع نشاط شركة إيمونوبريسيبيتاتيد SHP2 بوزن بروتينات فلورية خضراء-PD-1. RU = وحدات نسبية. (د) نموذج التنشيط خطوتين. أولاً، يتم تجنيد SHP2 مقدمو الخدمات، وفقط ثم ربط إلى ايتيم PD-1 الذي يمتد المجال الحفاز من SHP2 لتكيف نشط بشكل كامل في مجال SH2 الثاني. وترد البيانات يعني ± "sem. العلامات النجمية" تمثل اختلافات كبيرة بين مجموعة دينوتيد ووزن PD-1 (ب وج): * *ف < 0.01، * * *ف < 0.001، مزاوج اختبار t، n = 3. الإذن باستخدام بيانات من بيليد et al. (2018) وقد منحت 12 . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التفاعلات مستقبلات إنزيم ذات أهمية حاسمة للإشارات داخل الخلايا. ويتم تجنيد العديد من الإنزيمات المستقبلات من خلال نطاقات SH2 ملزمة إلى تيروسينيس فوسفوريلاتيد التي تزين ذيول مستقبلات نفس. بيد أن الإنزيمات هي غالباً مطوية في والتشكلات الخاملة مغلقة ويتطلب التنشيط تغيير conformational11 التي يمكن بمجالات أخرى من مستقبلات نفس وساطة. ووصف المقايسة هنا التدابير التفاعلات بين المستقبلات والأنزيمات فضلا عن النشاط الناجم عن هذه التفاعلات.
كنا مقايسة اللونية التي تستخدم فنيتروفينيلفوسفاتي (بنب) كالركيزة ل SHP2. بنب هو أحد المانحين الركيزة والفوسفور غير انتقائي الذي تم إصداره من قبل عدد كبير من الإنزيمات15. الببتيدات المؤتلف فوسفوريلاتيد يمكن أن تكون بمثابة ركائز بديلة (على سبيل المثال-، أولئك مشابهة لتلك المستخدمة في التحليل الملكيت الأخضر). هذه الببتيدات أكثر تحديداً من حيث النشاط الفوسفاتيز؛ ومع ذلك، أنها أكثر كلفة، ونظرا لحساسيتها، فإنه يمكن فقط تنفيذ حلول خالية من الفوسفات. نهج آخر للتحايل على عدم وجود خصوصية نحو بنب هو تضمين خط خلية تحكم الذي خرج الفوسفاتيز في السؤال. في هذه الخلايا، overexpression SHP2 سوف تكون المصدر الوحيد للانزيم، وينبغي أن تعزى أي زيادة في النشاط الفوسفاتيز على وجه التحديد إلى الفوسفاتيز المعلنة المفرط. وثمة نهج ثالث استخدام تنقية البروتين SHP2 حانمه معلم ومعلم حانمه PD المنقي-1 بدلاً من الاتحاد يكملها فوسفوبيبتيديس كالركيزة. بديل لاستخدام فوسفوبيبتيدي وصفها الركيزة لاستخدام فوسفوبروتين بدلاً من ذلك، وثم قد يتم الكشف عن ديفوسفوريليشن البروتين بجسم والرمات محددة أو العلامة فوس الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.
الأهم من ذلك، الأسلوب الموصوفة هنا يمكن أن تلقي الضوء على علم الأحياء الأخرى التفاعلات مستقبلات إنزيم. على سبيل المثال، فإنه يمكن كشف وظيفة بقايا التيروسين في مستقبلات الأسرة البطولات الأربع، التي وجدت لتكون ضئيلة للتفاعل مع SHP216 ولكن في الواقع قد يكون ضروريا لتنشيط إنزيم نفس. يمكن أيضا تطبيق هذا الأسلوب إلى فوسفاتاسيس الأخرى، فضلا عن التفاعل مستقبلات مؤنزم.
بينما هذا الأسلوب بسيط نسبيا، فإنه من المهم ملاحظة عندما ينبغي تجنب مثبطات الفوسفاتيز. هذه ضرورية في الخطوة الأولى من تحريض الفسفرة PD-1، ولكن في وقت لاحق أنهم يجب إزالتها من أجل اختبار النشاط الفوسفاتيز من SHP2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذا المشروع "منح المعاهد الوطنية للصحة" 1R01AI125640-01 و "مؤسسة أبحاث أمراض الروماتيزم".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
References
- Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17 (1), (2018).
- Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).
- Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).
- Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).
- Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).
- Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
- Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
- Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).
- Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).
- Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).
- McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 18, Unit18 18 (2010).
- Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).
