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Immunology and Infection

सह रिसेप्टर्स और एंजाइमों के बीच कार्यात्मक बातचीत का अध्ययन करने के लिए immunoprecipitation परख

Published: September 28, 2018 doi: 10.3791/58433

Summary

यहां, हम सह के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान immunoprecipitation और एक पर-मनका एंजाइमी गतिविधि परख के लिए एक साथ प्लाज्मा झिल्ली रिसेप्टर्स के विशिष्ट प्रोटीन डोमेन के योगदान का अध्ययन दोनों एंजाइम भर्ती और एंजाइम गतिविधि ।

Abstract

रिसेप्टर-संबद्ध एंजाइमों सेलुलर सक्रियण के प्रमुख मध्यस्थों हैं. इन एंजाइमों विनियमित रहे हैं, कम से कम भाग में, रिसेप्टर्स की cytoplasmic पूंछ के साथ शारीरिक बातचीत से. बातचीत अक्सर विशिष्ट प्रोटीन डोमेन और एंजाइमों के सक्रियकरण में परिणाम के माध्यम से होते हैं । वहां प्रोटीन के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए कई तरीके हैं । जबकि सह immunoprecipitation सामांयतः डोमेन है कि प्रोटीन के लिए आवश्यक है अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जाता है प्रोटीन बातचीत, वहां कोई परख रहे है कि दस्तावेज एक ही समय में भर्ती एंजाइमों की गतिविधि के लिए विशिष्ट डोमेन का योगदान । तदनुसार, विधि यहां वर्णित सह immunoprecipitation और एक पर-मनका एंजाइमी प्रोटीन और संबंधित एंजाइमी सक्रियण के बीच बातचीत के एक साथ मूल्यांकन के लिए गतिविधि परख को जोड़ती है । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य है कि एक प्रोटीन और एंजाइम और डोमेन है कि एंजाइम की पूरी सक्रियण के लिए अनिवार्य कर रहे है के बीच शारीरिक बातचीत के लिए महत्वपूर्ण है डोमेन की पहचान करने के लिए है । इस परख के महत्व का प्रदर्शन किया है, के रूप में कुछ रिसेप्टर प्रोटीन डोमेन रिसेप्टर के cytoplasmic पूंछ करने के लिए एंजाइम के बंधन में योगदान है, जबकि अन्य डोमेन के लिए एक ही एंजाइम के समारोह को विनियमित करने के लिए आवश्यक हैं.

Introduction

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उत्प्रेरक रिसेप्टर्स और रिसेप्टर tyrosine kinases transmembrane प्रोटीन है जिसमें एक extracellular ligand के बंधन एंजाइमी ओर1पर intracellular गतिविधि का कारण बनता है । कुछ रिसेप्टर्स दोनों रिसेप्टर और एंजाइमी कार्यों के अधिकारी, जबकि दूसरों को अपने cytoplasmic पूंछ के लिए इस तरह के kinases और phosphatases के रूप में विशिष्ट एंजाइमों की भर्ती. रिसेप्टर की पूंछ के लिए एक एंजाइम की भर्ती और इस एंजाइम के बाद उत्प्रेरक कार्रवाई दो अलग प्रक्रियाओं है कि हमेशा एक ही प्रोटीन डोमेन2द्वारा विनियमित नहीं कर रहे हैं । दुर्भाग्य से, एक साथ बातचीत और एंजाइमी गतिविधि दोनों का आकलन करने के लिए कोई विशिष्ट उपकरण हैं । कार्यात्मक सह immunoprecipitation परख यहां वर्णित एक उपयोगी तरीका है अपने सक्रियण से एक रिसेप्टर की पूंछ के लिए एक एंजाइम की भर्ती काटना है । इस परख एंटीबॉडी-लेपित मोतियों से टैग रिसेप्टर्स के immunoprecipitation का इस्तेमाल करता है । बाद में, दोनों एक एंजाइमी गतिविधि परख और मोतियों पर पश्चिमी दाग विश्लेषण प्रदर्शन कर रहे हैं । इस विधि के समग्र लक्ष्य को उजागर करने के लिए जो प्रोटीन डोमेन रिसेप्टर्स और एंजाइमों के बीच बातचीत के लिए आवश्यक हैं (पश्चिमी ब्लाट विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन) और जो डोमेन एंजाइमों की पूरी सक्रियण के लिए अनिवार्य कर रहे हैं (पर से मापा-मनका एंजाइमी गतिविधि परख) । यह रिसेप्टर के अलग कार्यों का अध्ययन करने के लिए उपकरण विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है-जुड़े एंजाइमों मानव रोगों के रोगजनन में उनकी भागीदारी के कारण. इसके अलावा, आगे इन प्रोटीन की कार्रवाई के तंत्र को समझने के उपंयास चिकित्सीय हस्तक्षेप के डिजाइन में मदद कर सकते हैं ।

क्रमादेशित मृत्यु-1 (पीडी-1) टी कोशिकाओं की सतह पर एक निरोधात्मक रिसेप्टर है और अत्यधिक टी सेल प्रतिक्रियाओं को सीमित करने के लिए आवश्यक है. हाल के वर्षों में, विरोधी पीडी-1 एंटीबॉडी एकाधिक द्रोह1,2के उपचार में फंसाया गया है । पीडी-1 बंधाव प्रसार, आसंजन, और कई साइटोकिंस3,4,5के स्राव सहित कई टी सेल कार्यों को नियंत्रित करता है । पीडी-1 प्रतिरक्षा synapse, टी कोशिकाओं और प्रतिजन के बीच इंटरफेस-6कोशिकाओं को पेश करने के लिए स्थानीयकृत है, जहां यह टी सेल रिसेप्टर (TCR)7के साथ colocalizes. इसके बाद, tyrosine फॉस्फेट SHP2 [Src समरूपता 2 (SH2) डोमेन युक्त tyrosine फॉस्फेट 2] पीडी-1 की cytoplasmic पूंछ के लिए भर्ती है, dephosphorylation परिसर और उससे जुड़े समीपस्थ के भीतर प्रमुख tyrosine अवशेषों के TCR के लिए अग्रणी अणुओं3,4,5,8,9संकेत । पीडी-1 के cytoplasmic टेल दो tyrosine रूपांकनों, एक immunoreceptor tyrosine आधारित निरोधात्मक आकृति (इति॒), और एक immunoreceptor tyrosine आधारित-स्विच आकृति (आईटीएसएम)10शामिल हैं । दोनों रूपांकनों पीडी-1 बंधाव9,10पर phosphorylated हैं । Mutagenesis स्टडीज में SHP2 भर्ती में आईटीएसएम के लिए एक प्राथमिक भूमिका का पता चला है, के रूप में इति॒, पीडी-1 संकेतन और समारोह में जिनकी भूमिका4स्पष्ट नहीं है ।

SHP2 को गोद ले या तो एक बंद (मुड़ा हुआ), बाधित रचना या एक खुला (विस्तारित), सक्रिय अनुरूपता11. SHP2 बाइंडिंग या सक्रियण के लिए पीडी-1 के प्रत्येक टेल डोमेन के योगदान का अभी तक आविर्भाव नहीं हुआ है । इस सवाल का जवाब देने के लिए, हम एक परख है कि SHP2 की भर्ती के समानांतर परीक्षण पीडी-1 की पूंछ और अपनी गतिविधि12में सक्षम बनाता है विकसित की है । हम सह immunoprecipitation और एक पर-मनका फॉस्फेट गतिविधि परख कार्यरत दोनों बातचीत और समानांतर में एंजाइमी गतिविधि का परीक्षण । इस परख का उपयोग हम बताते हैं कि पीडी-1 की आईटीएसएम को पीडी-1 की टेल तक SHP2 भर्ती करने के लिए पर्याप्त है, जबकि पीडी-1 के इति॒ को पूरी तरह से बढ़ाने और एंजाइम को एक्टिवेट करने की जरूरत है ।

वहां कई रिसेप्टर्स कि उनके cytoplasmic पूंछ में कई आसंन डोमेन है । कार्यात्मक सह immunoprecipitation परख विशिष्ट डोमेन है कि या तो प्रोटीन भर्ती या एंजाइमी सक्रियण के लिए आवश्यक है की भूमिका को उजागर कर सकते हैं ।

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Protocol

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1. कोशिकाओं की अभिकर्मक

  1. बीज HEK 293T कोशिकाओं में १२ १० सेमी प्लेट्स (5 x 106 कोशिकाओं प्रति प्लेट) दिन पहले अभिकर्मक (चित्रा 1) । एक hemocytometer का उपयोग कर सेल गिनती प्रदर्शन । प्रत्येक प्लेट के लिए, 10% FBS और 1% पेनिसिलिन/streptomycin के साथ पूरक DMEM के १० मिलीलीटर का उपयोग करें । 5% CO2में ३७ ° c पर कोशिकाओं को मशीन ।
  2. एक बार कोशिकाओं 80-90% धाराप्रवाह हैं, transfect 5 HEK 293T प्लेट निम्न plasmids में से एक के साथ एक लिपिड आधारित अभिकर्मक एजेंट का उपयोग कर: एक SHP2-व्यक्त वेक्टर, एक पीडी-1-GFP-व्यक्त वेक्टर [पीडी-1 के एक जंगली प्रकार (WT) संस्करण], एक इति॒-रूपांतरित संस्करण (Y223F ) एक पीडी-1-GFP-व्यक्त वेक्टर के, और एक आईटीएसएम-रूपांतरित संस्करण (Y248F) के एक पीडी-1-GFP-व्यक्त वेक्टर (चित्रा 1) ।
    नोट: दो प्लेट WT पीडी-1-GFP-एक्सप्रेस वेक्टर के साथ transfected किया जाएगा । एक अतिरिक्त प्लेट एक गैर transfected कोशिकाओं नियंत्रण (चित्रा 1) के रूप में काम करेंगे ।
  3. 10 सेमी प्लेट्स में अनुयाई कोशिकाओं के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार अभिकर्मक प्रदर्शन करते हैं ।
    नोट: पीडी-1 के रूपांतरित संस्करणों में, प्रत्येक आकृति में tyrosine (Y) को फेनिलएलनिन (F) की जगह दी गई थी जिसे phosphorylated नहीं किया जा सकता.
  4. Transfect एक दूसरे के समान सेट पांच प्लेटों और एक अतिरिक्त थाली व्यक्त प्रोटीन राशि की माप के लिए एक गैर transfected नियंत्रण के रूप में सेवारत [इनपुट; भी पूरे सेल lysate (वेकोलि) के रूप में जाना जाता है] immunoprecipitation से पहले (चित्रा 1) ।
  5. एक ऊतक संस्कृति मशीन में ३७ ° c, 5% CO2 में ४८ h के लिए transfected कोशिकाओं की मशीन ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि अभिकर्मक सफलतापूर्वक हुई है, एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग GFP अभिव्यक्ति के लिए कोशिकाओं की जांच करने के लिए ।

2. Transfected कोशिकाओं में फास्फारिलीकरण को बढ़ावा देना

  1. निंनलिखित मशीन, सोडियम के ५० µ एल मिश्रण से ताजा pervanadate तैयार-orthovanadate (१०० mM स्टॉक से) के साथ ५० µ एल के 30% एच22
    नोट: मिश्रण एक पीले रंग में बदलना चाहिए । Pervanadate एक सेल पारगंय फॉस्फेट अवरोध करनेवाला है कि13tyrosine अवशेषों के फास्फारिलीकरण को बढ़ावा देता है । इस परख में, यह पीडी-1 की पूंछ के फास्फारिलीकरण मजबूत प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  2. पीडी-1 के टैग किए गए संस्करणों को phosphorylate करने के लिए, मीडिया को पीडी-1-GFP-transfected कक्षों से निकालें और 10 मिलीलीटर सादा DMEM (बिना सीरम या एंटीबायोटिक्स) के साथ एक साथ 10 µ l के pervanadate (चरण २.१) प्रत्येक 10 सेमी प्लेट में जोड़ें (जिसके परिणामस्वरूप आठ प्लेट्स एक्सप्रेस पीडी-1 के विभिन्न संस्करण) (चित्रा 1). 15 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर प्लेटें रखें ।
    नोट: SHP2-transfected कोशिकाओं (दो प्लेटें; चित्रा 1) और दो गैर transfected नियंत्रण प्लेट pervanadate के साथ इलाज नहीं कर रहे हैं, क्योंकि इन प्लेटों सक्रिय SHP2 एंजाइम के लिए स्रोत के रूप में सेवा करेंगे ।
  3. आइस-कोल्ड 1x पंजाबियों के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें । इस चरण को दो बार दोहराएं ।

3. Immunoprecipitation

नोट: निम्नलिखित चरणों बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए.

  1. lysis बफ़र (५० mm Tris-HCl पर pH ७.२, २५० mm NaCl, ०.१% NP-४०, 2 mm EDTA, 10% ग्लिसरॉल) को छेड़ने वाले अवरोधकों (lysis बफ़र के 10 मिलीलीटर में 1 गोली भंग) और 1 मिमी सोडियम orthovanadate के साथ पूरक । बर्फ के ५०० µ एल जोड़ें-शीत lysis बफर कोशिकाओं के लिए और हटाने और तुरंत एक सेल खुरचनी का उपयोग कर प्लेटों से कोशिकाओं को इकट्ठा ।
    नोट: यह सोडियम orthovanadate केवल lysis बफर कि पीडी-1-GFP-transfected प्लेटों के लिए इस्तेमाल किया जाएगा करने के लिए जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है, के बाद से SHP2-transfected प्लेटें और गैर transfected नियंत्रण प्लेट फॉस्फेट गतिविधि बनाए रखने चाहिए.
  2. १.५ मिलीलीटर ठंडा ट्यूबों में lysates हस्तांतरण और उंहें ०.००५ x जी, 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बारी ।
  3. lysates से पोस्ट नाभिक supernatant (पीएन) इकट्ठा करने के लिए, १०,००० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए lysates नीचे स्पिन और नए ट्यूबों में supernatants हस्तांतरण । गोली छोड़ें । छह प्लेटों के दूसरे सेट की supernatants (चित्रा 1) बर्फ पर बाद में वेकोलि विश्लेषण के लिए स्टोर ।
  4. पीडी-1-GFP से पीडी-1-GFP-transfected lysates के पहले सेट (चार प्लेट) (चित्रा 1) के immunoprecipitation के लिए एंटी-GFP मोतियों की तैयारी.
    1. को मोतियों की बसने को रोकने के लिए, धीरे खोलने से पहले मोतियों के साथ बोतल हिला । प्रत्येक शर्त प्रति घोल से विरोधी GFP मोतियों की ४० µ एल निकालें ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए ५०० x g पर स्पिन और मोतियों को धोने के लिए supernatant को हटा दें ।
      नोट: यह पिपेट प्लास्टिक युक्तियां और agarose मोतियों के बीच संपर्क को कम करने के लिए नुकसान को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है । यह एक और ट्यूब के लिए मोतियों को स्थानांतरित करने से पहले एक २०० µ एल टिप के किनारे में कटौती करने के लिए सिफारिश की है ।
    3. lysis बफर (नमूना प्रति) के ८० µ एल में मोतियों को फिर से स्थगित ।
  5. पहले सेट (चार प्लेट) (स्टेप ३.३) के पीडी-1-GFP-एक्सप्रेस कोशिकाओं से धोकर मोतियों को सीधे सेल lysate (पीएन) में डालें । GFP-tagged प्रोटीन को immunoprecipitate करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ०.००५ x g पर रोटेट करें ।
  6. (orthovanadate के बिना) शीत lysis बफर के 1 मिलीलीटर के साथ मोती धो 3 बार । 10 एस के लिए २,५०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक
    नोट: जब मोतियों को lysis बफर जोड़ने, उंहें सुझावों के साथ छूने के बिना मोतियों पर सीधे जोड़ें । बहाकर ले जाने के दौरान ऊपर और नीचे पिपेट की जरूरत नहीं होती ।
  7. समान रूप से सक्रिय SHP2 के lysate को पहले सेट से विभाजित करें (एक प्लेट; चरण ३.३) और इसे धोकर पीडी-1-GFP-युक्त मोतियों की तीन नलियों में डालें (WT पीडी-1-GFP और दो भिन्न phosphdeficient उत्परिवर्तनों, Y223F और Y248F). नॉन-transfected कोशिकाओं के lysate से वॉल्यूम की एक-तिहाई WT पीडी-1-GFP मोतियों की दूसरी ट्यूब पर डालें । शेष दो-तिहाई त्याग दें.
  8. कोमल रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 एच के लिए मोतियों की मशीन (०.००५ x g) ।
  9. मोतियों को दो बार ठंडे lysis बफर के 1 मिलीलीटर के साथ धो लें (बिना pervanadate या orthovanadate), चरण ३.६ में रिपोर्ट के रूप में ।
  10. lysis बफर के ८० µ एल जोड़ें (pervanadate या orthovanadate) प्रति नमूना सुनिश्चित करना है कि प्रत्येक ट्यूब में कुल मात्रा १०० µ एल (मोतियों की 20 µ एल और µ बफर के ८० lysis एल) है । मिश्रण धीरे और दो ताजा १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में प्रत्येक ट्यूब से ५० µ एल हस्तांतरण ।
    नोट: इस कदम के बाद, वहां दो एक मिश्रण है कि मोतियों और lysis बफर है के साथ भरा ट्यूबों होगा: एक ट्यूब सह पश्चिमी सोख्ता द्वारा immunoprecipitated SHP2 परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, और दूसरा फॉस्फेट गतिविधि परख के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।

4. फॉस्फेट गतिविधि परख

  1. फॉस्फेट वॉश बफर (पीएच ७.४ और १२० mm NaCl पर 30 मिमी Hepes) के साथ एक बार मोतियों को धो लें । supernatant को पूरी तरह से हटा दें ।
  2. परख बफर के १०० µ एल जोड़ें (पीएच ७.४, १२० mm NaCl, 5 मिमी डीटीटी, 10 मिमी पी nitrophenylphosphate में 30 मिमी Hepes) मोतियों के लिए, और 30 डिग्री सेल्सियस पर कोमल आंदोलन के तहत 30 मिनट के लिए मशीन । नोट: मशीन समय भिन्न हो सकते हैं, लेकिन बफ़र dephosphorylation पर पीला हो जाता है जब तक प्रतीक्षा करें ।
  3. प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए, 1 मीटर NaOH के ५० µ एल जोड़ें जब बफर पीले रंग बदल जाता है ।
  4. 10 एस के लिए २,५०० x जी पर नीचे स्पिन और दो कुओं को supernatant के ५० µ एल हस्तांतरण (प्रति अच्छी तरह से ५० µ एल के साथ डुप्लिकेट) एक ९६-अच्छी तरह से थाली में आधा क्षेत्र । ४०५ एनएम में अवशोषक पढ़ें ।
  5. पीडी-1-GFP के नियंत्रण जंगली प्रकार के संस्करण पर सापेक्ष ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) के रूप में परिणाम व्यक्त करते हैं ।

5. SHP2 वेस्टर्न ब्लाट विश्लेषण

  1. मोतियों को नीचे स्पिन करें और supernatant को हटा दें ।
  2. 2x Laemmli बफर के 20 µ एल जोड़ें ( सामग्री तालिकादेखें) मोती और 5 मिनट के लिए ९५ ° c पर फोड़ा ।
  3. इनपुट नियंत्रण (दूसरा सेट) एक बीसीए किट ( सामग्री तालिकादेखें) का उपयोग कर के प्रोटीन एकाग्रता उपाय । एक नई ट्यूब के लिए सबसे पतला नमूना के 30 µ एल स्थानांतरण । सबसे पतला नमूना के रूप में एक ही एकाग्रता के लिए lysis बफर के साथ इनपुट नियंत्रण के बाकी पतला, और एक नई ट्यूब के लिए उनमें से प्रत्येक से 30 µ एल हस्तांतरण.
    नोट: इस कदम के बाद, वहां 30 µ एल प्रत्येक के साथ 4 ट्यूबों, समान प्रोटीन सांद्रता पर होगा, इनपुट नियंत्रण lysates का प्रतिनिधित्व ।
  4. lysates करने के लिए 2x Laemmli बफर के बराबर मात्रा जोड़ें और 5 मिनट के लिए ९५ ° c पर फोड़ा । मोतियों नीचे स्पिन और 4 पर supernatant लोड-20% एसडीएस-पृष्ठ Tris आधारित जेल (देखें सामग्री तालिकापश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए) । इसके अलावा, दूसरे सेट के प्रत्येक नमूने से लोड ५० µ एल ।
  5. जारी रखें पश्चिमी ब्लाटर विश्लेषण पहले वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार12.

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Representative Results

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जबकि पीडी-1 के आईटीएसएम का योगदान SHP2 बाइंडिंग के लिए स्थापित किया गया है, पीडी-1 के इति॒ की भूमिका कम स्पष्ट है । क्योंकि SHP2 दो SH2 डोमेन है जो पीडी-1 पर दो अनुक्रमिक phosphotyrosines को बाइंड कर सकता है (एक tyrosine में आईटीएसएम और दूसरा इति॒ में), हमारी परिकल्पना थी कि पीडी-1 एंकर की आईटीएसएम पीडी-1 को SHP2, जबकि पीडी-1 की इति॒ को स्थिर करके SHP2 गतिविधि की सुविधा देता है । ओपन के गठन की स्थिति11,14. इस परीक्षण के लिए, हम एक संयुक्त co-immunoprecipitation और एंजाइमी रिसेप्टर-एंजाइम बातचीत और सक्रियण के समानांतर आकलन के लिए गतिविधि परख विकसित की है । वाइल्ड टाइप GFP-पीडी-1, GFP-पीडी-1 Y223F (इति॒ उत्परिवर्ती), या GFP-पीडी-1 Y248F (आईटीएसएम उत्परिवर्ती) HEK 293T कोशिकाओं है कि बाद में pervanadate (चित्रा 1) के साथ इलाज किया गया, phosphorylated पीडी-1 पूंछ के लिए अग्रणी में व्यक्त किया गया । पीडी-1 प्रोटीन विरोधी GFP लेपित मोतियों का उपयोग कर एकत्र किया गया । इन मोतियों का उपयोग SHP2 के लिए किया गया था-immunoprecipitation lysates से SHP2 की कोशिकाओं का । पीडी-1 और उसकी एंजाइमी गतिविधि के प्रत्येक संस्करण के लिए बाध्य SHP2 के स्तर दर्ज किए गए ।

आश्चर्य की बात है, SHP2 पीडी-1 को बाँधने में असफल रहा जब आईटीएसएम का रूपांतरित हुआ (Y248F; चित्र 2a) । उल्लेखनीय है, इति॒ के उत्परिवर्ती संस्करण (Y223F) केवल एक सीमित सीमा तक बाध्यकारी SHP2 (चित्रा बी) बाधा । फिर भी, SHP2 फॉस्फेट गतिविधि परख से पता चला कि इति॒ और आईटीएसएम एंजाइमी गतिविधि (चित्रा 2c) के लिए समान रूप से अपरिहार्य थे । के बाद से पीडी-1 immunoprecipitates अन्य phosphatases शामिल हो सकते हैं, SHP2 के अलावा, हम एक नियंत्रण शर्त का उपयोग किया (चित्रा 2 बी और 2c नीले) जिसमें SHP2 नहीं किया गया था.

इसलिए, एक दो कदम सक्रियण मॉडल से पता चला है जिसमें SHP2 आराम शर्तों (चित्रा 2d, बाएं) के तहत एक ऑटो बाधित अनुरूप में जोड़ रहा है । पीडी-1 के सक्रियकरण पर, SHP2 phosphorylated आईटीएसएम (चित्रा 2d, मध्य) के लिए भर्ती है । हालांकि, इति॒ भी अपने सक्रिय रूप (चित्रा 2d, सही) में SHP2 प्रकट करना phosphorylated होना चाहिए ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक स्थितियों और रणनीति । GFP-पीडी-1 WT (जंगली प्रकार), GFP-पीडी-1 Y223F (इति॒ उत्परिवर्ती), या GFP-पीडी-1 Y248F (आईटीएसएम उत्परिवर्ती) HEK 293T कोशिकाओं है कि बाद में इलाज किया गया में व्यक्त किए गए थे । Phosphorylated GFP-पीडी-1 प्रोटीन GFP immunoprecipitation द्वारा एकत्र lysates के साथ कोशिकाओं से SHP2 के साथ मिश्रित थे, और पीडी-1 के प्रत्येक संस्करण के लिए बाध्य SHP2 के स्तर और गतिविधि दर्ज की गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: SHP2 गतिविधि के लिए पीडी-1 की इति॒ आवश्यक है । HEK 293T कोशिकाओं GFP-पीडी-1 के संकेत संस्करणों के साथ transfected थे, इसके बाद pervanadate उपचार और immunoprecipitation का उपयोग कर विरोधी GFP मॉब-agarose (). SHP2 स्तरों को उपजी GFP-पीडी-1 थे quantified (बी) और एक फॉस्फेट गतिविधि परख (सी) के अधीन । खींच-डाउन SHP2 के मानों को GFP व्यंजक स्तरों पर सामान्यीकृत किया गया था. सभी मान WT GFP-पीडी-1 (जंगली प्रकार) द्वारा उपजी SHP2 की तीव्रता के साथ तुलना में गुना-परिवर्तन कर रहे हैं. फॉस्फेट गतिविधि मान WT GFP-PD-1 द्वारा सह-immunoprecipitated SHP2 की गतिविधि के साथ तुलना में फ़ोल्ड-परिवर्तन होते हैं । निय = सापेक्ष इकाइयां । (d) दो-चरणीय सक्रियण मॉडल । सबसे पहले, SHP2 आईटीएसएम के लिए भर्ती है, और केवल तब पीडी-1 के इति॒ के लिए दूसरा SH2 डोमेन बांध करता है, जो पूरी तरह से सक्रिय अनुरूपता के लिए SHP2 के उत्प्रेरक डोमेन फैली हुई है । डाटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । तारांकन चिह्नित समूह और WT पीडी-1 के बीच महत्वपूर्ण अंतर का प्रतिनिधित्व करते हैं (b और c): * *p < 0.01, * * *p < 0.001, ख़राब t-test, n = 3. पेले एट अल से डेटा का उपयोग करने की अनुमति । (२०१८) 12 दी गई कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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रिसेप्टर-एंजाइम बातचीत intracellular संकेतन के लिए महत्वपूर्ण हैं. कई एंजाइमों SH2 phosphorylated tyrosines के लिए बाध्यकारी डोमेन के माध्यम से रिसेप्टर्स के लिए भर्ती कर रहे हैं कि एक ही रिसेप्टर्स की पूंछ को सजाने. हालांकि, एंजाइमों अक्सर बंद निष्क्रिय संरचनाओं में जोड़ रहे हैं, और सक्रियण एक ही रिसेप्टर के अन्य डोमेन द्वारा मध्यस्थता किया जा सकता है कि एक संरचना परिवर्तन11 की आवश्यकता है. यहां वर्णित परख रिसेप्टर्स और एंजाइमों के बीच बातचीत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इन बातचीत से प्रेरित गतिविधि के उपाय ।

हम एक वर्णमिति परख कि उपयोग पी nitrophenylphosphate (pNPP) SHP2 के लिए सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया । pNPP एक गैर चयनात्मक सब्सट्रेट और फॉस्फोरस दाता है कि एंजाइमों15की एक व्यापक संख्या के द्वारा जारी की है । Phosphorylated रिकॉमबिनेंट पेप्टाइड्स वैकल्पिक सब्सट्रेट के रूप में सेवा कर सकते हैं (जैसे, उन लोगों के समान मैलाकाइट हरी परख में इस्तेमाल किया). इन पेप्टाइड्स फॉस्फेट गतिविधि के मामले में अधिक विशिष्ट हैं; हालांकि, यह महंगा है, और इसकी संवेदनशीलता के कारण, यह केवल फॉस्फेट मुक्त समाधान में किया जा सकता है । एक अंय दृष्टिकोण pNPP की ओर विशिष्टता की कमी को दरकिनार करने के लिए एक नियंत्रण कक्ष लाइन जिसमें प्रश्न में फॉस्फेट बाहर खटखटाया है शामिल है । इन कोशिकाओं में, SHP2 के व्यक्त एंजाइम के लिए ही स्रोत हो जाएगा, और फॉस्फेट गतिविधि में किसी भी वृद्धि विशेष रूप से अधिक व्यक्त फॉस्फेट को जिंमेदार ठहराया जाना चाहिए । एक तीसरे दृष्टिकोण के लिए एक शुद्ध epitope-टैग SHP2 प्रोटीन और शुद्ध epitope-टैग पीडी-1 के बजाय वेकोलि के रूप में phosphopeptides द्वारा पूरक सब्सट्रेट का उपयोग करने के लिए है । सब्सट्रेट के रूप में एक phosphopeptide का उपयोग करने के लिए एक विकल्प के बजाय एक phosphoprotein का उपयोग करने के लिए है, और फिर प्रोटीन की dephosphorylation एक phospho-विशिष्ट एंटीबॉडी या phos-टैग एसडीएस-पृष्ठ द्वारा पता लगाया जा सकता है ।

महत्वपूर्ण बात, विधि यहां वर्णित अंय रिसेप्टर-एंजाइम बातचीत के जीवविज्ञान पर प्रकाश डाला जा सकता है । उदाहरण के लिए, यह स्लैम परिवार रिसेप्टर्स में tyrosine अवशेषों के समारोह को उजागर कर सकते हैं, जो16 SHP2 के साथ बातचीत के लिए नगण्य हो पाया गया है, लेकिन वास्तव में एक ही एंजाइम के सक्रियण के लिए आवश्यक हो सकता है. इस विधि भी अंय phosphatases के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रिसेप्टर बातचीत kinases के लिए लागू किया जा सकता है ।

हालांकि इस विधि अपेक्षाकृत सरल है, यह ध्यान दें जब फॉस्फेट अवरोधों से बचना चाहिए महत्वपूर्ण है । पीडी-1 के फास्फारिलीकरण प्रेरण के प्रारंभिक चरण में ये आवश्यक हैं, लेकिन बाद में वे SHP2 के फॉस्फेट गतिविधि का परीक्षण करने के क्रम में हटा दिया जाना चाहिए.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना को NIH अनुदान 1R01AI125640-01 और संधिवातीयशास्त्र रिसर्च फाउंडेशन द्वारा वित्तपोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Lonza 17-516F Phosphate Buffered Saline
Microcentrifuge Eppendorf 5424-R 1.5 mL
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red Gibco 25200114
Heat Inactivated FBS Denville FB5001-H Fetal bovine serum
Penicillin / Streptomycin Fisher BP295950
DMEM high glucose without L-glutamine Lonza BE12-614F
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305
Anti-SHP2 Santa Cruz SC-280
Anti–GFP-agarose MBL D153-8
Anti-GFP Roche 118144600
Anti-Actin Santa Cruz SC-1616
HEK-293 cells ATCC CRL-1573
Orthovanadate Sigma S6508
H2O2 Sigma 216763 30%
Protease inhibitor cocktail Roche 11836170001 EDTA-free
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x) Invitrogen LC2676 Modified Laemmli buffer
4-20% Tris-Glycine Mini Gels Invitrogen XP04205BOX 15-well
Nitrocellulose membranes General Electric 10600004
NaCl Sigma S7653 Sodium chloride
HEPES Gibco 15630080 N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid
DTT Invitrogen D1532 Dithiothreitol
pNPP Sigma 20-106 p-Nitrophenyl Phosphate
NaOH Sigma S8045 Sodium hydroxide
BCA Fisher 23225 Bi Cinchoninic Acid assay

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References

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सह रिसेप्टर्स और एंजाइमों के बीच कार्यात्मक बातचीत का अध्ययन करने के लिए immunoprecipitation परख
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Peled, M., Strazza, M., Mor, A. Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes. J. Vis. Exp. (139), e58433, doi:10.3791/58433 (2018).More

Peled, M., Strazza, M., Mor, A. Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes. J. Vis. Exp. (139), e58433, doi:10.3791/58433 (2018).

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