Summary
在这里, 我们提出了一个共同免疫沉淀的协议和一个在珠酶活性检测, 同时研究的具体蛋白质领域的血浆膜受体对酶的招募和酶活性。
Abstract
受体相关酶是细胞活化的主要媒介。这些酵素被调控, 至少部分, 由物理相互作用与受体的细胞质尾巴。这种相互作用经常发生在特定的蛋白质领域, 并导致酶的活化。有几种方法来研究蛋白质之间的相互作用。虽然共同免疫沉淀通常用于研究蛋白质与蛋白质相互作用所需的领域, 但没有化验证明特定领域对所吸收酶的活性的贡献。据此, 本文所描述的方法结合了免疫沉淀和一个珠状酶活性测定, 同时评价蛋白质与相关酶活化的相互作用。本协议的目标是确定对蛋白质和酶之间的物理交互至关重要的领域, 以及对酶的完全活化所必需的域。这一检测的重要性被证明, 因为某些受体蛋白域有助于酶对受体的细胞质尾部的结合, 而其他领域是必要的, 以调节同一酶的功能。
Introduction
催化受体和受体酪氨酸激酶是跨膜蛋白, 其中细胞外配体的结合导致酶活性的细胞内侧1。有些受体具有受体和酶功能, 而另一些则吸收特定的酶, 如激酶和磷酸的细胞质尾巴。在受体的尾部进行酶的招募, 以及随后这种酶的催化作用, 是两个不同的过程, 不总是由相同的蛋白域2调节。不幸的是, 没有具体的工具来评估相互作用和酶活性的同时。这里描述的功能性免疫沉淀检测是一种很有用的方法, 用于解剖从激活到受体的尾部的酶的招募。这种检测利用免疫沉淀的标记受体的抗体涂层珠。随后对珠进行酶活性测定和印迹分析。这个方法的总目标是发现哪些蛋白质领域是必要的在感受器官和酵素之间的相互作用 (由西部污点分析评估), 并且哪些领域是强制的对酵素的完全活化 (由在珠子测量酶活性测定)。开发用于研究受体相关酶的功能的工具是非常重要的, 因为它们参与了人类疾病的发病机制。此外, 进一步了解这些蛋白质的作用机制可以帮助设计新的治疗干预措施。
程控 death-1 (PD-1) 是 t 细胞表面的抑制受体, 是限制过度 t 细胞反应的必要条件。近年来, anti-PD-1 抗体已被牵连到治疗多发性恶性肿瘤1,2。PD-1 结扎抑制许多 T 细胞功能, 包括增殖, 黏附力和分泌多种细胞因子3,4,5。PD-1 的免疫突触, t 细胞和抗原呈现细胞之间的接口6, 它 colocalizes 与 T 细胞受体 (TCR)7。随后, 酪氨酸磷酸酶 SHP2 [Src 同源 2 (SH2) 域含有酪氨酸磷酸酶 2] 被招募到 PD-1 的细胞质尾部, 导致 TCR 复合体中关键酪氨酸残留物的除磷及其相关的近端信号分子3,4,5,8,9。PD-1 的细胞质尾包含两个酪氨酸图案, 一个 immunoreceptor 酪氨酸的抑制母题 (ITIM) 和一个 immunoreceptor 的酪氨酸基开关的主题 (ITSM)10。两个图案都是磷酸化后 PD-1 结扎9,10。突变研究揭示了 ITSM 在 SHP2 招聘中的主要作用, 而不是 ITIM, 后者在 PD-1 信号和功能方面的作用不清楚4。
SHP2 采用闭合 (折叠), 抑制构象或开放 (延长), 活跃构象11。PD-1 的每个尾部域对 SHP2 绑定或激活的贡献尚未阐明。为了回答这个问题, 我们开发了一种检测方法, 能够对 PD-1 的 SHP2 和它的活动12进行并行测试。我们采用了免疫沉淀和珠粒磷酸酶活性测定法, 同时测试了两者的相互作用和酶活性。使用这一方法, 我们表明, PD-1 的 ITSM 足以招募 SHP2 PD-1 的尾部, 而 ITIM PD-1 是需要充分扩展和激活的酶。
有许多受体有几个相邻的领域在他们的细胞质尾巴。功能性的免疫沉淀分析可以揭示特定领域的作用, 这是必要的蛋白质招募或酶活化。
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Protocol
1. 细胞转染
- 种子 HEK 293T 细胞成十二10厘米板 (每板 5 x 106细胞) 转染前的前一天 (图 1)。使用 hemocytometer 执行单元格计数。对于每个盘子, 使用10毫升的 DMEM 补充10% 的血清和1% 青霉素/链霉素。孵化细胞在37°c 在 5% CO2。
- 一旦细胞80-90% 汇合, 染 5 HEK 293T 板使用脂基转染试剂与以下质粒之一: SHP2-expressing 向量, PD-1-GFP-expressing 向量 [野生类型的 PD-1 的版本], ITIM 变异的版本 (Y223F) PD-1-GFP-expressing 向量和 PD-1-GFP-expressing 向量的 ITSM 变异版本 (Y248F) (图 1)。
注: 两个板块将被转染的 PD-1-GFP-expressing 矢量。一个额外的板块将作为一个未转染的细胞控制 (图 1)。 - 按照制造商的协议对10厘米板上的粘附细胞执行转染。
注意: 在 PD-1 的变异版本中, 每个母题中的酪氨酸 (Y) 被不能磷酸化的苯丙氨酸 (F) 所取代。 - 染第二个相同的一套五板块和一个额外的板块作为一个非转染的控制, 以测量表达蛋白量 [输入; 也称为整个细胞裂解 (劳联)] 在免疫沉淀之前 (图 1)。
- 在37°c, 5% CO2在组织培养孵化器中孵育转染细胞48小时。
注意: 为了确保转染成功地发生, 请使用荧光显微镜检查 GFP 表达式的细胞。
2. 促进转染细胞的磷酸化
- 孵化后, 通过混合50µL 钠原钒酸 (从100毫米的股票) 和50µL 30% H2O2, 准备新鲜 pervanadate。
注: 混合物应改为淡黄色。Pervanadate 是一种细胞渗透性的磷酸酶抑制剂, 促进酪氨酸残留的磷酸化13。该方法用于 PD-1 的尾部的磷酸化。 - 要 phosphorylate 标记的 PD-1 的版本, 请从 PD-1-GFP-transfected 细胞中取出介质, 并添加10毫升的纯 DMEM (不带血清或抗生素) 和10µL (步骤 2.1) 到每10厘米板 (导致八个板块表示不同版本的 PD-1) (图 1)。在室温下将盘子放在黑暗中15分钟。
注: SHP2-transfected 细胞 (两个板块;图 1)两个未转染的控制板不被 pervanadate 处理, 因为这些板块将作为活性 SHP2 酶的来源。 - 用5毫升冰冷的 1x PBS 冲洗细胞。重复此步骤两次。
3. 免疫沉淀
注: 以下步骤应在冰上或摄氏4度执行。
- 补充溶解缓冲 (50 毫米三盐酸在 pH 7.2, 250 毫米氯化钠, 0.1% NP-40, 2 毫米 EDTA, 10% 甘油) 与蛋白酶抑制剂 (溶解1个片剂在10毫升溶解缓冲) 和与1毫米钠原钒酸。将500µL 的冷裂解缓冲液添加到细胞中, 并立即使用细胞刮刀从盘子中取出并收集细胞。
注: 重要的是添加钠原钒酸仅在裂解缓冲, 将用于 PD-1-GFP-transfected 板, 因为 SHP2-transfected 板和非转染控制板必须保留磷酸酶活性。 - 将裂解物转换为1.5 毫升冷管, 旋转 0.005 x g, 4 °c 30 分钟。
- 从裂解物收集后核上清 (期票), 在 1万 x g处旋转10分钟, 裂解物4摄氏度, 将上清液转移到新管中。扔掉小球。将第二组六版 (图 1) 的上清液存储在冰上, 供以后的劳联分析。
-
从第一组的 PD-1-GFP-transfected 裂解物 (四片) 中制备免疫沉淀 PD-1-GFP 的抗 GFP 珠 (图 1)。
- 为了防止珠子的沉淀, 在开口前用珠子轻轻摇动瓶子。每个条件下, 从浆料中除去40µL 的抗 GFP 珠。
- 旋转在 500 x g 3 分钟在4°c, 并删除上清洗珠。
注意: 要尽量减少吸管塑料尖和琼脂糖珠之间的接触, 以防止损失。建议在将珠子转移到另一管之前, 切下200µL 尖端的边缘。 - 并用重悬80µL 溶解缓冲液中的珠子 (每样)。
- 从第一组的 PD-1-GFP-expressing 细胞 (四片) (步骤 3.3) 直接向细胞裂解 (三七) 中添加洗涤过的珠子。以 0.005 x g为30分钟, 在4摄氏度旋转, 以 immunoprecipitate GFP 标记的蛋白质。
- 用1毫升的冷裂解缓冲液 (不原钒酸) 冲洗珠3次。离心管在 2500 x g十年代。
注: 当添加溶解缓冲的珠子, 直接添加到珠子上, 而不接触他们的提示。在洗涤过程中不需要吸吸管。 - 同样, 将活性 SHP2 的裂解液从第一组 (一盘; 步骤 3.3) 中, 加入三管的水洗 PD-1-GFP-containing 珠 (PD-1-GFP 和两个不同的 phosphdeficient 突变, Y223F 和 Y248F)。将1/3 的体积从非转染细胞的裂解液中添加到 PD-1-GFP 珠的第二管。丢弃剩余的2/3。
- 用柔和的旋转 (0.005 x g) 在4摄氏度孵化出4小时的珠子。
- 用1毫升的冷裂解缓冲液 (不 pervanadate 或原钒酸) 清洗珠两次, 如步骤3.6 所报告。
- 添加80µL 的裂解缓冲液 (不 pervanadate 或原钒酸), 以确保每管的总容积为100µL (20 µL 的珠子和80µL 的溶解缓冲液)。轻轻混合, 将50µL 从每管转移到两个新鲜的1.5 毫升管。
注: 按照这一步骤, 将有两个管填充一个混合物, 其中含有珠子和裂解缓冲: 一管将用于测试 immunoprecipitated SHP2 由西方印迹, 第二个将用于磷酸酶活性测定。
4. 磷酸酶活性测定
- 用磷酸酶洗涤缓冲器 (30 毫米 Hepes 在 pH 值7.4 和120毫米氯化钠) 上洗一次珠子。完全移除上清。
- 添加100µL 的化验缓冲器 (30 毫米 Hepes 在 pH 7.4, 120 毫米氯化钠, 5 毫米, 10 毫米对硝基苯磷酸) 到珠, 和孵化在30°c 为30分钟在温和的鼓动下。注: 潜伏期可能不同, 但要等到缓冲区在除磷时变黄。
- 为终止反应, 当缓冲区变黄时, 添加50µL 1 米氢氧化钠。
- 十年代旋转 2500 x g , 将上清的50µL 转移到两个井 (重复50µL 每井) 一半面积在96井板。读405纳米的吸光度。
- 将结果表示为相对光学密度 (OD) 的控制野生型 PD-1-GFP 版。
5. SHP2 的印迹分析
- 向下旋转珠子, 取出上清液。
- 添加20µL 2x Laemmli 缓冲器 (见材料表) 的珠子和煮沸在95°c 5 分钟。
- 使用评估工具套件测量输入控件 (第二组) 的蛋白质浓度 (见材料表)。将最稀释样品的30µL 转移到新管上。稀释其余的输入控制与溶解缓冲, 以相同的浓度作为最稀释的样品, 并转移30µL 从他们每一个新的管。
注: 按照这一步骤, 将有4管与30µL 每个, 在相似的蛋白质浓度, 代表输入控制裂解物。 - 将等量的 2x Laemmli 缓冲器添加到裂解物中, 并在95摄氏度处煮沸5分钟. 旋下珠子, 并载入上清在 4–20% SDS 页三基凝胶 (见材料表) 的西方印迹分析。另外, 从第二组的每个样本中加载50µL。
- 根据先前描述的12号协议继续进行西方污点分析。
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Representative Results
虽然建立了 ITSM PD-1 对 SHP2 约束力的贡献, 但 PD-1 ITIM 的作用不那么明确。由于 SHP2 有两个 SH2 域, 它们可以绑定到 PD-1 上的两个连续 phosphotyrosines (一个在 ITSM 中的一个酪氨酸, 另一个在 ITIM 中), 我们假设 ITSM 的 PD-1 锚 SHP2 到 PD-1, ITIM PD-1 有助于 SHP2 活动, 稳定其打开构象状态11,14。为了测试这一点, 我们开发了一个联合免疫沉淀和酶活性测定的平行评估受体-酶相互作用和活化。野生型 GFP-PD-1, GFP-PD-1 Y223F (ITIM 突变体), 或 GFP-PD-1 Y248F (ITSM 突变体) 表达在 HEK 293T 细胞, 随后处理 pervanadate (图 1), 导致磷酸化 PD-1 尾。用抗 GFP 包覆的珠子收集 PD-1 蛋白。这些珠子用于 SHP2 免疫沉淀从裂解物细胞 overexpressing SHP2。记录了每个 PD-1 的 SHP2 水平及其酶活性。
不出所料, 当 ITSM 突变时, SHP2 未能绑定到 PD-1 (Y248F;图 2A)。值得注意的是, ITIM (Y223F) 的变种人版本仅在有限的范围内抑制 SHP2 绑定 (图 2B)。然而, SHP2 磷酸酶活性测定显示, ITIM 和 ITSM 对酶活性同样必不可少 (图 2C)。由于 PD-1 immunoprecipitates 可能包含其他磷酸, 除了 SHP2 之外, 我们还使用了一个控制条件 (图 2B和2C,蓝色), SHP2 不是抗原。
因此, 在休息条件下, SHP2 被折叠成自动抑制构象的两步活化模型 (图 2D, 左)。激活 PD-1 后, SHP2 被招募到磷酸化 ITSM (图 2D, 中间)。然而, ITIM 也必须磷酸化, 以展开 SHP2 到其活性构象 (图 2D, 右)。
图 1: 实验条件和策略.GFP-PD-1 (野生型)、GFP-PD-1 Y223F (ITIM 突变体) 或 GFP-PD-1 Y248F (ITSM 突变体) 在 HEK 293T 细胞中表达, 随后用 pervanadate 处理。GFP 免疫沉淀采集的磷酸化 GFP-PD-1 蛋白与裂解物 overexpressing SHP2 的细胞混合, 记录 SHP2 的水平和活性。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: PD-1 的 ITIM 是 SHP2 活动所必需的.HEK 293T 细胞被转染的 GFP-PD-1 的指示版本, 其次是 pervanadate 治疗和免疫沉淀使用抗 GFP 抗体-琼脂糖 (a)。SHP2 水平与沉淀 GFP-PD-1 的定量 (b) 和服从磷酸酶活性测定 (c)。将下拉 SHP2 的值规范化为 GFP 表达水平。所有值均与 GFP-PD-1 (野生型) 的沉淀 SHP2 强度相比有折变。与 immunoprecipitated SHP2 的活性相比, 磷酸酶活性值是折变的, GFP-PD-1。汝 = 相对单位。(d) 两步激活模型。首先, SHP2 被招募到 ITSM, 然后第二 SH2 域绑定到 PD-1 ITIM, 这将 SHP2 的催化领域扩展到完全活性的构象。数据显示为平均值 "电子扫描电镜". 星号代表了表示组与 PD-1 (b 和 c) 之间的显著差异: **p < 0.01, **p < 0.001, 未配对 t 检验, n = 3。允许使用佩莱德等数据。(2018)12被授予了.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
受体-酶相互作用是细胞内信号的关键。许多酶被招募到受体通过 SH2 域绑定到磷酸化酪氨酸, 装饰的尾巴相同的受体。然而, 酶通常被折叠成闭合的非活性构象, 激活需要构象变化11 , 可以由同一受体的其他领域介导。这里描述的化验测量受体和酶之间的相互作用以及这些相互作用引起的活动。
我们使用了一种比色测定法, 利用 p-硝基苯磷酸 (pNPP) 作为基质的 SHP2。pNPP 是一种非选择性的基质和磷捐献者, 它是由广泛的酶15释放。磷酸化重组肽可作为替代基质 (e., 类似于孔雀石绿法中使用的)。这些肽在磷酸酶活性方面更具体;然而, 它是昂贵的, 由于它的敏感性, 它只能在无磷酸盐解决方案中进行。另一种规避对 pNPP 缺乏特异性的方法是包括控制细胞线, 其中的磷酸酶被淘汰。在这些细胞中, SHP2 的过度表达将是酶的唯一来源, 磷酸酶活性的任何增加都应专门归因于过量表达的磷酸酶。第三种方法是使用纯化的表位标记的 SHP2 蛋白和纯化的表位标记的 PD-1, 而不是以磷酸肽持作为基体补充的劳联。替代使用磷酸作为基质是使用具有磷蛋白, 然后除磷的蛋白质可以检测到磷特定的抗体或磷标记 SDS 页。
重要的是, 这里描述的方法可以揭示其他受体-酶相互作用的生物学。例如, 它可以揭示的功能, 在满贯家庭受体的酪氨酸残留, 这已经被发现是微不足道的互动与 SHP216 , 但实际上可能是必要的激活相同的酶。这种方法也可以应用于其他磷酸和受体相互作用的激酶。
虽然这种方法相对简单, 但重要的是应注意何时应避免磷酸酶抑制剂。这些在 PD-1 磷酸化诱导的初始步骤中是必要的, 但以后必须去除, 以测试 SHP2 的磷酸酶活性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
该项目由 NIH 赠款1R01AI125640-01 和风湿病研究基金会资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
References
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