Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Co Иммунопреципитация Assay для изучения функционального взаимодействия между рецепторами и ферменты

Published: September 28, 2018 doi: 10.3791/58433

Summary

Здесь мы представляем собой протокол для co иммунопреципитация и ферментативную активность на шарик assay одновременно изучать вклад доменов конкретных протеина плазматической мембраны рецепторов фермента вербовки и активность фермента.

Abstract

Рецептор связанных ферментов являются основными посредниками клеточных активации. Эти ферменты, регулируются, по крайней мере в части, физических взаимодействий с хвостами цитоплазматических рецепторов. Взаимодействия часто происходят через конкретные белка доменов и привести к активации ферментов. Существует несколько методов для изучения взаимодействия белков. В то время как co иммунопреципитация обычно используется для изучения домены, которые требуются для взаимодействий протеин протеина, есть без анализов, этот документ вклад конкретных доменов на активность ферментов, набранных в то же время. Соответственно метод, описанный здесь сочетает в себе co иммунопреципитация и ферментативную активность на шарик assay для одновременной оценки взаимодействия белков и связанные ферментативной активации. Цель настоящего Протокола заключается в идентификации доменов, которые являются критическими для физических взаимодействий между белков и ферментов и домены, которые являются обязательными для полной активации фермента. Продемонстрировал важное значение этот assay, как некоторые рецептор доменов протеина вклад связывание фермента цитоплазматических хвост рецептора, в то время как другие домены необходимо регулировать функции же фермент.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Трансмембранные белки, в которых привязка внеклеточных лигандов вызывает ферментативную активность на внутриклеточную сторона1каталитического рецепторов и рецепторов тирозин киназы. Некоторые приемные устройства обладают рецепторов и ферментативные функции, в то время как другие набирать специфических ферментов как киназы и фосфатаз в их цитоплазматических хвосты. Набор фермента рецептор хвост и последующих каталитического действия этого фермента являются два отдельных процессов, которые не всегда регулируются же домены белка2. К сожалению Есть нет конкретных инструментов для оценки взаимодействия и ферментативную активность одновременно. Assay функциональные co иммунопреципитация, описанные здесь является полезным методом вскрыть вербовки фермента к хвосту рецепторов от ее активации. Этот assay иммунопреципитации тегами рецепторов использует антителами бисером. Впоследствии выполняются ферментативную активность пробирного и Западный анализ помаркой на бусины. Общая цель этого метода является выявить, какие домены белка, необходимые для взаимодействия между рецепторами и ферментов (оценены Западный анализ помаркой) и какие домены являются обязательными для полной активации ферментов (измеряется на шарик Ферментативная активность проба). Важно разработать инструменты для изучения отдельных функций рецептор связанных ферментов из-за их участие в патогенезе заболеваний человека. Кроме того дальнейшее понимание механизмов действий этих белков может помочь дизайн роман терапевтических вмешательств.

Запрограммированной смерти-1 (PD-1) является ингибирующее рецепторами на поверхности клеток T и требуется для ограничения чрезмерного Т-клеток ответов. В последние годы антитела анти PD-1 были вовлечены в лечении множественные злокачественные опухоли1,2. PD-1 перешнуровка сдерживает многочисленные функции Т-клеток, включая распространения, адгезии и секрецию несколько цитокинов3,,4-5. PD-1 локализован для иммунологических синапса, интерфейс между Т-клеток и антиген представляющих клеток6, где он colocalizes с Т клеточных рецепторов (TCR)7. Впоследствии, тирозин фосфатазы SHP2 [Src гомологии 2 (Ш2) домена, содержащие тирозин фосфатазы 2] набирается цитоплазматических хвост PD-1, приводит к dephosphorylation остатков ключевых тирозина в рамках комплекса TCR и его связанные проксимальной сигнальные молекулы3,4,5,8,9. Цитоплазматических хвост PD-1 содержит два мотивы тирозин, immunoreceptor на основе тирозин ингибирующее мотив (ITIM) и immunoreceptor тирозин основе переключатель мотив (ITSM)10. Обе мотивы фосфорилированных на PD-1 перешнуровка9,10. Мутагенез исследования показали основную роль для ITSM вербовка, в отличие от ITIM, чья роль в PD-1 сигнализации и функция не ясно SHP24.

SHP2 принимает либо закрытые (сложить), ингибирует конформации или открытой (расширенный), активной конформации11. Вклад каждого домена хвост PD-1 SHP2 привязки или активации пока не выяснены. Чтобы ответить на этот вопрос, мы разработали assay который позволяет параллельно тестирования набор SHP2 к хвосту PD-1 и его деятельность12. Мы использовали co иммунопреципитация и assay активности фосфатазы на шарик для тестирования взаимодействия и ферментативной активности параллельно. С помощью этого анализа, мы покажем, что ITSM PD-1 достаточно набрать SHP2 к хвосту PD-1, в то время как ITIM PD-1 необходимо в полной мере распространить и активировать энзим.

Есть много рецепторов, которые имеют несколько смежных доменов в их цитоплазматических хвосты. Функциональные co иммунопреципитация assay может раскрыть роль определенных доменов, которые необходимы для белка вербовки или ферментативной активации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. transfection клеток

  1. Семя ГЭС 293T клетки в двенадцать 10 см пластины (5 х 106 клеток на пластину) за день до трансфекции (рис. 1). Выполните подсчет клеток с помощью Горяева. Для каждой пластины используйте 10 мл DMEM дополнена 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина. Инкубируйте клетки при 37 ° C в 5% CO2.
  2. После того, как клетки притока 80-90%, transfect 5 ГЭС 293T плит с помощью реагент на основе липидов трансфекции с одним из следующих плазмидов: SHP2-выражая вектора, PD-1-GFP-выражая вектора [дикого типа (WT) версии PD-1], мутировал ITIM версия (Y223F ) PD-1-GFP-выражая вектора и ITSM-мутировал версия (Y248F) PD-1-GFP-выражая вектора (рис. 1).
    Примечание: Две пластины будет transfected с WT PD-1-GFP-выражая вектора. Одна дополнительная табличка будет служить в качестве элемента не transfected клеток (рис. 1).
  3. Выполните трансфекции согласно производителя протокол для адэрентных клеток в 10 см пластины.
    Примечание: В мутировавших версии PD-1, тирозина (Y) в каждый мотив был заменен фенилаланин (F), который не может быть фосфорилированных.
  4. Transfect второй идентичный набор из пяти плит и одна дополнительная пластина, выступающей в качестве не transfected контроля для измерения количества выраженным белком [ввод; также известен как клеточных lysate (ВКТ)] перед иммунопреципитации (рис. 1).
  5. Инкубируйте transfected клеток для 48 ч при 37 ° C, 5% CO2 в инкубатор культуры ткани.
    Примечание: Для обеспечения что трансфекции произошло успешно, изучите клетки для экспрессия гена GFP с помощью флуоресцентный Микроскоп.

2. содействие фосфорилирования в Transfected клеток

  1. После инкубации готовить свежие pervanadate, смешивая 50 мкл натрия Ортованадат (от 100 мм запас) с 50 мкл 30% H2O2.
    Примечание: Смеси следует изменить в желтоватый цвет. Pervanadate – это ингибитор клетки проницаемой фосфатазы, что способствует фосфорилирования тирозина остатков13. В этот assay он используется для решительно побуждать фосфорилирование хвосты PD-1.
  2. Фосфорилировать тегами версии PD-1, удалите СМИ от PD-1-GFP-transfected клеток и добавить 10 мл равнина DMEM (без сыворотки или антибиотики) вместе с 10 мкл pervanadate (шаг 2.1) к каждой табличке 10 см (в результате восьми пластины выражая различные версии PD-1) (рис. 1). Поместите пластины при комнатной температуре в темноте за 15 мин.
    Примечание: SHP2-transfected клеток (две пластины; Рисунок 1) и две пластины не transfected управления не относятся с pervanadate, так как эти пластины будет служить в качестве источника для активного SHP2 фермента.
  3. Вымойте клетки с 5 мл ледяной ПБС. Повторите этот шаг два раза.

3. иммунопреципитации

Примечание: Следующие шаги должны быть выполнены на льду или на 4 ° C.

  1. Дополнить буфера lysis (50 мм трис-HCl при рН 7,2, 250 мм NaCl, 0,1% NP-40, 2 мм ЭДТА, 10% глицерина) с ингибиторами протеаз (растворить 1 таблетка в 10 мл буфера lysis) и с Ортованадат натрия 1 мм. Добавьте 500 мкл буфера ледяной lysis клетки и удалить и собирать клетки от пластин, немедленно с помощью скребка ячейки.
    Примечание: Важно добавить Ортованадат натрия только литического буфера, который будет использоваться для PD-1-GFP-transfected пластины, так как SHP2-transfected плиты и плиты не transfected управления должны сохранять фосфатазы.
  2. Передача лизатов в 1,5 мл холодной трубы и повернуть их на 0,005 x g, 4 ° C на 30 мин.
  3. Чтобы собрать лизатов пост ядер супернатанта (ПНС), спин вниз лизатов 10 мин на 10000 x g при 4 ° C и передачи supernatants в новой трубы. Выбросите гранулы. Храните на льду для последующего анализа ВКТ supernatants второго набора из шести пластин (рис. 1).
  4. Подготовка анти GFP бусы для иммунопреципитации PD-1-GFP от PD-1-GFP-transfected лизатов первого набора (четыре пластины) (рис. 1).
    1. Чтобы предотвратить оседание бисер, осторожно встряхните бутылку с бисером перед открытием. Удаление 40 мкл анти GFP бусы из пульпы за каждое условие.
    2. Спина на 500 x g 3 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант мыть бисер.
      Примечание: Важно свести к минимуму контакт между пластиковые наконечники и бусы агарозы для предотвращения потери. Рекомендуется сократить края кончик 200 мкл до перевода бисер в другую трубу.
    3. Ресуспензируйте бисер в 80 мкл буфера lysis (на сэмпл).
  5. Добавить промытый бусины непосредственно в lysate клетки (ПНС) от PD-1-GFP-выражая клетки первого набора (четыре пластины) (шаг 3.3). Поворот на 0,005 x г за 30 мин при 4 ° C до immunoprecipitate GFP-тегами белков.
  6. Вымойте бусины с 1 мл холодного литического буфера (без Ортованадат) 3 раза. Центрифуга трубки на 2500 x g 10 s.
    Примечание: При добавлении буфера lysis бисер, добавьте непосредственно на бисер не касаясь их с советами. Существует не нужно Пипетка вверх и вниз во время мойки.
  7. Одинаково разделить lysate активной SHP2 из первого набора (одна пластина; шагу 3.3) и добавить его в три трубки промывают PD-1-GFP-содержащих бусины (WT PD-1-GFP и два разных phosphdeficient мутации, Y223F и Y248F). Добавьте одну треть объема от lysate не transfected клеток второй трубки WT PD-1-GFP бусины. Отменить оставшиеся две трети.
  8. Инкубируйте Бусины 4 ч при температуре 4 ° C с нежным вращения (0,005 x g).
  9. Вымойте бусины дважды с 1 мл холодного литического буфера (без pervanadate или Ортованадат), как сообщалось в шаге 3.6.
  10. 80 мкл буфера lysis (без pervanadate или Ортованадат) на примере обеспечения того, чтобы общий объем в каждой тюбике 100 мкл (20 мкл бусины) и 80 мкл буфера lysis. Осторожно перемешать и передача 50 мкл от каждой трубы в две свежие 1.5 мл пробирок.
    Примечание: После этого шага, будет существовать две трубки, наполненные смесью, содержащий бусы и буфера lysis: одна трубка будет использоваться для тестирования SHP2 co-immunoprecipitated, Западный blotting, а вторая будет использоваться для анализа активности фосфатазы.

4. фосфатазы деятельности пробирного

  1. Вымойте бусины с фосфатазы мыть буфера (30 мм Hepes на рН 7,4 и 120 мм NaCl). Полностью удалите супернатант.
  2. Добавьте 100 мкл аналитического буфера (30 мм Hepes на рН 7,4, 120 мм NaCl, 5 DTT, p-nitrophenylphosphate 10 мм) бисер и Инкубируйте на 30 ° C в течение 30 мин под нежным агитации. Примечание: Время инкубации могут отличаться, но ждать до тех пор, пока буфер желтеет на дефосфорилирование.
  3. Для завершения реакции, 50 мкл 1 M NaOH когда буфер желтеет.
  4. Спин вниз на 2500 x g для 10 s и передачи 50 мкл супернатант двух скважин (дубликаты с 50 мкл в колодец) половина-района в 96-луночных пластине. Читайте поглощения в 405 нм.
  5. Экспресс результаты как относительная оптической плотности (OD) управления одичал тип версии PD-1-GFP.

5. SHP2 Западный анализ помаркой

  1. Спин вниз бисер и удалить супернатант.
  2. 20 мкл буфера 2 x Laemmli (см. Таблицу материалов) бисер и кипятят на 95 ° C за 5 мин.
  3. Измерить концентрацию белка входного контроля (второй набор) с помощью BCA комплекта (см. Таблицу материалов). Передача 30 мкл наиболее разреженных образца к новой пробке. Разбавить остальные элементы управления вводом с буфера lysis же концентрации как наиболее разреженных образца и передачи 30 мкл от каждого из них новой трубки.
    Примечание: После этого шага, там будет 4 пробирки с 30 мкл каждого, на аналогичные концентрации белка, представляющие ввод контролирует лизатов.
  4. Добавить равных объемах 2 буфера x Laemmli лизатов и кипятят на 95 ° C за 5 мин спин вниз бисер и загрузить супернатант на 4 – 20% гель SDS-PAGE Tris-основе (см. Таблицу материалов) для западного анализа помаркой. Кроме того Загрузите 50 мкл от каждого образца из второго набора.
  5. Далее, что Западный анализ помаркой согласно протоколу описанных ранее12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Хотя вклад ITSM PD-1 SHP2 связывание устанавливается, роль ITIM PD-1 менее ясно. Поскольку SHP2 имеет два SH2 доменов, которые можно привязать к двум последовательным phosphotyrosines PD-1 (один тирозина в ITSM), а другой в ITIM, мы предположили, что ITSM PD-1 якорей SHP2 PD-1, в то время как ITIM PD-1 облегчает SHP2 деятельности по стабилизации ее Откройте конформационные состояния11,14. Чтобы проверить это, мы разработали комбинированных co иммунопреципитация и ферментативную активность assay для параллельной оценки взаимодействия рецепторов фермента и активации. Дикого типа GFP-PD-1, GFP-PD-1 Y223F (ITIM мутант), или Y248F GFP-PD-1 (ITSM мутант) были выражены в ГЭС 293T клетках, которые лечили впоследствии pervanadate (рис. 1), ведущих к фосфорилированных PD-1 хвосты. PD-1 белки были собраны с помощью анти GFP покрытая бисером. Эти бусины были использованы для SHP2 co иммунопреципитация от лизатов клеток, экспрессирующих SHP2. Уровни SHP2 привязан к каждой версии PD-1 и ее Ферментативная активность были записаны.

Неудивительно, что SHP2 не удалось выполнить привязку к PD-1 когда мутировал ITSM (Y248F; Рисунок 2A). Удивительно мутант версия ITIM (Y223F) препятствует SHP2 привязки только в ограниченной степени (рис. 2B). Тем не менее пробирного активности фосфатазы SHP2 показали, что ITIM и ITSM одинаково необходимы для ферментативной активности (рис. 2 c). Поскольку immunoprecipitates PD-1 может содержать другие фосфатаз, в дополнение к SHP2, мы использовали условие управления (Рисунок 2B и 2 C, синий), в котором не было оверэкспрессировали SHP2.

Следовательно модель активации двухэтапный раскрывается, в котором SHP2 складывается в авто тормозится конформации под отдыха условия (Рисунок 2D, слева). После активации PD-1 SHP2 набирается на Фосфорилированный ITSM (Рисунок 2D, средний). Однако ITIM также должны быть фосфорилированных разворачиваться SHP2 в его активной конформации (Рисунок 2D, право).

Figure 1
Рисунок 1: стратегии и экспериментальных условий. GFP-PD-1 Вт (дикий), GFP-PD-1 Y223F (ITIM мутант), или Y248F GFP-PD-1 (ITSM мутант) были выражены в ГЭС 293T клетках, которые лечили впоследствии pervanadate. Фосфорилированный GFP-PD-1 белки, собранные GFP иммунопреципитации были смешаны с лизатов из клеток, экспрессирующих SHP2, и уровень и активность SHP2 привязан к каждой версии PD-1 были записаны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: ITIM PD-1 необходим для деятельности SHP2. ГЭС 293T клетки были transfected в указанных версиях GFP-PD-1, после лечения pervanadate и иммунопреципитация, с использованием анти GFP МАБ агарозы (). SHP2 уровней обязаны осажденный GFP-PD-1 были количественных (b) и подвергается пробирного активности фосфатазы (c). Значения SHP2 потянул вниз были нормализованы в уровни выражения гена GFP. Все значения являются фолд изменение по сравнению с интенсивностью осажденный SHP2 WT GFP-PD-1 (дикий). Значения активности фосфатазы являются фолд изменение по сравнению с деятельностью co-immunoprecipitated SHP2 WT GFP-PD-1. RU = относительных единицах. (d) модель активации двухэтапный. Во-первых SHP2 набирается ITSM, и только тогда второй домен SH2 привязку к ITIM PD-1, который расширяет каталитического домен SHP2 для полностью активной конформации. Данные представлены как среднее ± SEM. звездочки представляют существенные различия между обозначается группы и WT PD-1 (b и c): **p < 0.01, ***p < 0,001, непарные t тест, n = 3. Разрешение на использование данных от пелядь и др. (2018) 12 был предоставлен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Рецептор фермента взаимодействия имеют решающее значение для внутриклеточная сигнализация. Многие ферменты набираются через SH2 доменов, привязка к фосфорилированных tyrosines, которые украшают хвосты же рецепторов рецепторы. Однако ферментов часто складывают в закрытых неактивной конформации и активации требует конформационные изменения11 , что может быть при посредничестве других доменов же рецептора. Assay описано здесь меры взаимодействия между рецепторами и ферменты, а также деятельность под воздействием этих взаимодействий.

Мы использовали колориметрические assay который использует p-nitrophenylphosphate (pNPP) как субстрат для SHP2. pNPP является неизбирательной субстрата и фосфора доноров, которая выпустила широкий ряд ферментов15. Фосфорилированный рекомбинантные пептиды могут служить в качестве альтернативной субстратов (например., тех, кто похож на тех, которые используются в assay Малахитовый зеленый). Эти пептиды являются более конкретными с точки зрения активности фосфатазы; Однако это дороже, и из-за своей чувствительности, она может быть выполнена только в фосфат свободных решений. Другой подход к обойти отсутствие конкретики в направлении pNPP должно включать строки ячейки управления, в котором выбит фосфатазы в вопросе. В этих клетках гиперэкспрессия SHP2 будет единственным источником фермента, и любое увеличение активности фосфатазы следует отнести непосредственно к чрезмерно выраженная фосфатазы. Третий подход заключается в использовании очищенная эпитопу меткой SHP2 белка и очищенная эпитопу тегами PD-1 вместо ВКТ, дополняется phosphopeptides как субстрат. Альтернативой использованию phosphopeptide как субстрат вместо этого использовать фосфоропротеид, и затем дефосфорилирование белка может быть обнаружен фосфо специфические антитела или ПУЗ тег SDS-PAGE.

Важно отметить, что метод, описанный здесь может пролить свет на биологии других рецепторов фермента взаимодействий. Например он может раскрыть функцию остатков тирозина в SLAM семьи рецепторов, которые были найдены незначительным для взаимодействия с SHP216 , но на самом деле могут быть необходимы для активации же фермента. Этот метод может также применяться другие фосфатаз, а также взаимодействия рецепторов киназы.

Хотя этот метод является относительно простым, важно отметить, когда битор фосфатазы следует избегать. Они необходимы в начальный шаг фосфорилирования индукции PD-1, но позже они должны быть удалены с целью проверки активности фосфатазы SHP2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Этот проект финансировался NIH грантов 1R01AI125640-01 и ревматологии исследовательский фонд.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Lonza 17-516F Phosphate Buffered Saline
Microcentrifuge Eppendorf 5424-R 1.5 mL
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red Gibco 25200114
Heat Inactivated FBS Denville FB5001-H Fetal bovine serum
Penicillin / Streptomycin Fisher BP295950
DMEM high glucose without L-glutamine Lonza BE12-614F
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305
Anti-SHP2 Santa Cruz SC-280
Anti–GFP-agarose MBL D153-8
Anti-GFP Roche 118144600
Anti-Actin Santa Cruz SC-1616
HEK-293 cells ATCC CRL-1573
Orthovanadate Sigma S6508
H2O2 Sigma 216763 30%
Protease inhibitor cocktail Roche 11836170001 EDTA-free
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x) Invitrogen LC2676 Modified Laemmli buffer
4-20% Tris-Glycine Mini Gels Invitrogen XP04205BOX 15-well
Nitrocellulose membranes General Electric 10600004
NaCl Sigma S7653 Sodium chloride
HEPES Gibco 15630080 N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid
DTT Invitrogen D1532 Dithiothreitol
pNPP Sigma 20-106 p-Nitrophenyl Phosphate
NaOH Sigma S8045 Sodium hydroxide
BCA Fisher 23225 Bi Cinchoninic Acid assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17, (1), (2018).
  2. Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153, (1), 42-50 (2018).
  3. Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135, (2), 564-567 (2015).
  4. Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173, (2), 945-954 (2004).
  5. Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5, (230), 46 (2012).
  6. Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (45), (2007).
  7. Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209, (6), 1201-1217 (2012).
  8. Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355, (6332), 1428-1433 (2017).
  9. Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574, (1-3), 37-41 (2004).
  10. Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (24), 13866-13871 (2001).
  11. Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
  12. Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (3), E468-E477 (2018).
  13. Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28, (1), 25-30 (2009).
  14. Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270, (7), 2897-2900 (1995).
  15. McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 18, Unit18 18 (2010).
  16. Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166, (9), 5480-5487 (2001).
Co Иммунопреципитация Assay для изучения функционального взаимодействия между рецепторами и ферменты
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peled, M., Strazza, M., Mor, A. Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes. J. Vis. Exp. (139), e58433, doi:10.3791/58433 (2018).More

Peled, M., Strazza, M., Mor, A. Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes. J. Vis. Exp. (139), e58433, doi:10.3791/58433 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter