Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Co-immunoprecipitation analysen for å studere funksjonell samhandling mellom reseptorer og enzymer

Published: September 28, 2018 doi: 10.3791/58433

Summary

Her presenterer vi en protokoll for co-immunoprecipitation og på-perle enzymatisk aktivitet analysen samtidig studere bidrag av bestemt protein domener av plasma membran reseptorer både enzym rekruttering og enzym aktivitet.

Abstract

Reseptor-assosiert enzymer er store meklere av aktivering. Disse enzymene er regulert, minst delvis av fysisk interaksjon med cytoplasmiske hale av reseptorer. Samhandlinger som ofte oppstår gjennom bestemt protein domener og føre aktivering av enzymer. Det finnes flere metoder til å studere samspillet mellom proteiner. Mens co-immunoprecipitation brukes vanligvis til å studere domener som kreves for protein-protein interaksjoner, er det ingen analyser dokumentet bidraget fra bestemte domener til aktivitet av rekruttert enzymer samtidig. Følgelig kombinerer metoden beskrevet her co-immunoprecipitation og på-perle enzymatisk aktivitet analysen for samtidige evaluering av samspillet mellom proteiner og tilknyttede enzymatisk aktivisering. Målet med denne protokollen er å identifisere domenene som er kritiske for fysisk interaksjon mellom et protein enzym og domenene som er obligatorisk for full aktivering av enzym. Betydningen av denne analysen er demonstrert, som enkelte reseptor protein domener bidrar til binding av enzymet til cytoplasmiske hale av reseptoren, mens andre domener er nødvendig å regulere funksjon av det samme enzymet.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Katalytisk reseptorer og receptor tyrosine kinaser er transmembrane proteiner som forårsaker binding av en ekstracellulære ligand enzymatisk aktivitet på intracellulær siden1. Noen reseptorer har både reseptor og enzymatiske funksjoner, mens andre rekruttere spesielle enzymer som kinaser og phosphatases til cytoplasmiske halen. Rekruttering av et enzym reseptorens halen og påfølgende katalytiske handlingen av dette enzymet er to separate prosesser som ikke alltid er regulert av den samme protein domener2. Dessverre er det ingen spesifikke verktøy å vurdere både samhandling og enzymatiske aktiviteten samtidig. Funksjonell co-immunoprecipitation analysen beskrevet her er en nyttig metode for å analysere rekruttering av et enzym på halen av en reseptor fra aktivering sin. Denne analysen benytter immunoprecipitation av merket reseptorer av antistoff perler. Deretter utføres en enzymatisk aktivitet analysen og western blot analyse på perler. Det overordnede målet med denne metoden er å avdekke hvilke protein domener er nødvendig for kommunikasjon mellom reseptorer og enzymer (vurdert ved western blot analyse) og hvilke domener er obligatorisk for full aktivering av enzymer (målt ved på-perle enzymatisk aktivitet analysen). Det er viktig å utvikle verktøy for å studere de separate funksjonene av reseptor-assosiert enzymer på grunn av deres engasjement i patogenesen av menneskelige sykdommer. Videre kan videre forståelse virkningsmekanismer av disse proteinene bidra til utformingen av romanen terapeutisk intervensjon.

Programmert død-1 (PD-1) er en hemmende reseptor på overflaten av T-celler og er nødvendig for å begrense overdreven T celle svar. De siste årene, har anti-PD-1 antistoffer vært medvirkende i behandlingen av flere malignitet1,2. PD-1 ligation begrenser tallrike T celle-funksjoner, inkludert spredning, vedheft og sekresjon av flere cytokiner3,4,5. PD-1 er lokalisert til immunologiske synapse, grensesnittet mellom T celler og antigen-presentasjon celler6, der det colocalizes med T-celle reseptor (TCR)7. Deretter tyrosin fosfatase SHP2 [Src homologi 2 (SH2) domenet som inneholder tyrosin fosfatase 2] rekruttert til cytoplasmiske hale av PD-1, fører til dephosphorylation av viktige tyrosin rester TCR komplekset og assosierte proksimale signalnettverk molekyler,3,,4,,5,,8,,9. Cytoplasmiske halen av PD-1 inneholder to tyrosin motiver, en immunoreceptor tyrosin-baserte hemmende motiv (svart) og en immunoreceptor tyrosin basert-bryteren motiv (ITSM)10. Både motiver er fosforylert på PD-1 ligation9,10. Mutagenese undersøkelser avdekket en primær rolle for ITSM i SHP2 rekruttering, i motsetning til svart, hvis rolle i PD-1 signalering og funksjon ikke er klart4.

SHP2 vedtar enten en lukket (kastet), hemmet conformation eller en åpen (utvidet), aktiv konformasjon11. Bidraget fra hver hale domenet av PD-1 SHP2 binding eller aktivisering har ennå ikke utredet. For å besvare dette spørsmålet, utviklet vi en analyse som gjør parallelle testing av rekrutteringen av SHP2 på halen av PD-1 og dens aktivitet12. Vi ansatt co-immunoprecipitation og på-perle fosfatase aktivitet analysen å teste både samhandling og enzymatiske aktiviteten i parallell. Bruker denne analysen, viser vi at ITSM av PD-1 er tilstrekkelig å rekruttere SHP2 på halen av PD-1, mens svart av PD-1 er nødvendig å fullt utvide og aktiverer enzymet.

Det er mange reseptorer som har flere tilstøtende domener i cytoplasmiske halen. Funksjonell co-immunoprecipitation analysen kan avdekke rollen til bestemte domener som er nødvendige for protein rekruttering eller enzymatisk aktivisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. hva celler

  1. Frø HEK 293T celler i tolv 10 cm plater (5 x 106 celler per plate) dagen før transfection (figur 1). Utføre celle tellingen bruker en hemocytometer. For hver plate, kan du bruke 10 mL av DMEM med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin. Inkuber cellene på 37 ° C i 5% CO2.
  2. Når cellene er 80-90% confluent, transfect 5 HEK 293T plater med ett av følgende plasmider en lipid-baserte transfection reagens: en SHP2-uttrykke vektor, en PD-1-GFP-uttrykke vektor [en vill-type (WT) versjon av PD-1], en svart-mutert versjon (Y223F ) en PD-1-GFP-uttrykke vektor og en ITSM-mutert versjon (Y248F) av en PD-1-GFP-uttrykke vektor (figur 1).
    Merk: To plater vil bli transfected med WT PD-1-GFP-uttrykke vektoren. En ekstra plate vil tjene som en ikke-transfekterte celler (figur 1).
  3. Utføre hva som produsentens protokollen for tilhenger celler i 10 cm plater.
    Merk: I mutert versjoner av PD-1, tyrosin (Y) i hvert motiv ble erstattet av fenylalanin (F) som ikke kan bli fosforylert.
  4. Transfect et annet identiske sett med fem plater og en ekstra plate som en ikke-transfekterte kontroll for måling av uttrykt protein beløp [inngang; også hele cellen lysate (WCL)] før immunoprecipitation (figur 1).
  5. Inkuber transfekterte celler for 48 h i 37 ° C, 5% CO2 i en vev kultur inkubator.
    Merk: For å sikre at transfection oppstod vellykket, undersøke celler for GFP uttrykk med fluorescerende mikroskop.

2. fremme fosforylering i transfekterte celler

  1. Etter inkubasjon forberede frisk pervanadate ved å blande 50 µL av natrium-orthovanadate (fra 100 mM lager) med 50 µL av 30% H2O2.
    Merk: Blandingen bør endre til en gulaktig farge. Pervanadate er en celle-permeable fosfatase inhibitor som fremmer fosforylering tyrosin rester13. I denne analysen, er det brukt til robust induserer fosforylering hvoster PD-1.
  2. For å phosphorylate de kodede versjonene av PD-1, Fjern media fra PD-1-GFP-transfekterte cellene og tilsett 10 mL av ren DMEM (uten serum eller antibiotika) sammen med 10 µL av pervanadate (trinn 2.1) til hver 10 cm plate (som fører til åtte plater uttrykke forskjellige versjoner av PD-1) (figur 1). Plass platene i romtemperatur i mørket i 15 min.
    Merk: SHP2-transfekterte cellene (to plater; Figur 1) og to ikke-transfekterte kontroll platene behandles ikke med pervanadate, siden disse platene skal fungere som kilden for aktive SHP2 enzymet.
  3. Vask cellene med 5 mL av iskalde 1 x PBS. Gjenta dette trinnet to ganger.

3. Immunoprecipitation

Merk: Følgende trinn skal utføres på isen eller på 4 ° C.

  1. Supplere lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 250 mM NaCl, 0,1% NP-40, 2 mM EDTA, 10% glyserol) med proteasehemmere (oppløses 1 tablett i 10 mL lyseringsbuffer) og 1 mM natrium orthovanadate. Legge til 500 µL av iskalde lyseringsbuffer til cellene og fjerner og samle cellene fra platene umiddelbart med en celle skraper.
    Merk: Det er viktig å legge natrium orthovanadate bare til lyseringsbuffer som skal brukes for PD-1-GFP-transfekterte platene, siden den SHP2-transfekterte og ikke-transfekterte kontroll plater må beholde fosfatase aktivitet.
  2. Overføre til lysates til 1,5 mL kaldt rør og roterer dem 0.005 x g, 4 ° C i 30 min.
  3. For å hente post kjerner supernatant (PNS) fra lysates, spinne ned lysates for 10 min 10 000 x g på 4 ° C og overføre supernatants i nye rør. Kast pellet. Lagre supernatants av det andre settet med seks plater (figur 1) på is WCL analyseformål.
  4. Utarbeidelse av anti-GFP perler for immunoprecipitation av PD-1-GFP fra den PD-1-GFP-transfekterte lysates av først sett (fire plater) (figur 1).
    1. For å unngå bosetting av perler, forsiktig riste flasken med perler før åpningen. Fjern 40 µL av anti-GFP perler fra slurry per hver betingelse.
    2. Spinn på 500 x g i 3 minutter på 4 ° C og fjerne nedbryting å vaske perler.
      Merk: Det er viktig å minimere kontakten mellom pipette plast tips og agarose perler å hindre tap. Det anbefales å kutte kanten av et 200 µL tips før du overfører perler til en annen tube.
    3. Resuspend perler i 80 µL av lyseringsbuffer (per eksempel).
  5. Legge til vasket perlene direkte til lysate-cellen (PNS) fra PD-1-GFP-uttrykke cellene i det første settet (fire plater) (trinn 3.3). Rotere 0.005 x g i 30 min på 4 ° C immunoprecipitate GFP-merket proteiner.
  6. Vask perler med 1 mL kaldt lyseringsbuffer (uten orthovanadate) 3 ganger. Sentrifuge røret på 2500 x g for 10 s.
    Merk: Når du legger til lyseringsbuffer perler, legge det direkte på perlene uten å berøre dem med tips. Det er ikke nødvendig å Pipetter opp og ned under vasker.
  7. Like deler av lysate av den aktive SHP2 i første sett (én plate, trinn 3.3) og legge det til tre rør av vasket PD-1-GFP-inneholder perler (WT PD-1-GFP og to forskjellige phosphdeficient mutasjoner, Y223F og Y248F). Legge til en tredjedel av volumet fra lysate av ikke-transfekterte cellene i den andre tuben WT PD-1-GFP perler. Kast de resterende to-tredjedeler.
  8. Inkuber perlene 4 h på 4 ° C med mild rotasjon (0.005 x g).
  9. Vask perlene to ganger med 1 mL kaldt lyseringsbuffer (uten pervanadate eller orthovanadate), som rapportert i trinn 3.6.
  10. Legge til 80 µL av lyseringsbuffer (uten pervanadate eller orthovanadate) per eksempel slik at det totale volumet i hver tube er 100 µL (20 µL av perler) og 80 µL av lyseringsbuffer. Bland forsiktig og overføre 50 µL fra hver rør inn to friske 1,5 mL rørene.
    Merk: Etter dette trinnet, vil det være to rør fylt med en blanding som inneholder perler og lyseringsbuffer: en tube brukes for testing co-immunoprecipitated SHP2 av vestlige blotting og andre brukes for fosfatase aktivitet analysen.

4. fosfatase aktivitet analysen

  1. Vask perlene gang med fosfatase vaskebuffer (30 mM Hepes på pH 7.4 og 120 mM NaCl). Fjerne nedbryting helt.
  2. Legg 100 µL av analysebuffer (30 mM Hepes ved pH 7.4, 120 mM NaCl, 5 mM DTT, 10 mM p-nitrophenylphosphate) til perlene, og ruge på 30 ° C i 30 min under mild agitasjon. Merk: Inkubasjonstiden kan variere, men vente til bufferen blir gul på dephosphorylation.
  3. For å avslutte reaksjonen, Legg 50 µL av 1 M NaOH når bufferen gulner etterhvert.
  4. Nedspinning 2500 x g for 10 s og overføre 50 µL av nedbryting to brønner (dubletter med 50 µL per brønn) av halv-området i en 96-brønns plate. Lese absorbansen ved 405 nm.
  5. Uttrykke resultatene som relativ optisk tetthet (OD) over kontrollen vill-type versjonen av PD-1-GFP.

5. SHP2 Western Blot analyse

  1. Nedspinning perler og fjerne nedbryting.
  2. Legge til 20 µL av 2 x Laemmli buffer (se Materialer tabell) til perler og kok til 95 ° C i 5 minutter.
  3. Måle protein konsentrasjonen av input kontroller (andre satt) bruker en BCA kit (se Materialer tabell). Overføring 30 µL av mest utvannet utvalget til en ny tube. Tynn ut resten av input kontrollene med lyseringsbuffer til samme konsentrasjonen som mest utvannet prøven, og overføre 30 µL fra hver av dem til en ny tube.
    Merk: Etter dette trinnet, vil det bli 4 rør med 30 µL hver, i lignende protein konsentrasjoner som representerer input styrer lysates.
  4. Legge like volum av 2 x Laemmli buffer til lysates og kok til 95 ° C i 5 min. spinn ned perler og laste nedbryting på 4-20% SDS side Tris-basert gel (se Materialer tabell) for western blot analyse. I tillegg laste 50 µL fra hvert utvalg av det andre settet.
  5. Fortsette western blot analyse i henhold til protokollen beskrevet tidligere12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mens bidraget av ITSM PD-1 SHP2 zbindowanie opprettes, er rollen av svart PD-1 mindre klart. Fordi SHP2 har to SH2 domener som kan binde til to sammenhengende phosphotyrosines på PD-1 (ett tyrosin i ITSM) og en annen i svart, vi hypotesen at ITSM av PD-1 forankrer SHP2 PD-1, mens svart av PD-1 forenkler SHP2 aktivitet ved å stabilisere sin Åpne conformational stat11,14. For å teste dette, utviklet vi en kombinert co-immunoprecipitation og enzymatiske aktiviteten analysen for parallell vurdering av reseptor-enzym interaksjoner og aktivisering. Wild type GFP-PD-1, GFP-PD-1 Y223F (svart mutant), eller GFP-PD-1 Y248F (ITSM mutant) ble uttrykt i HEK 293T celler som ble senere behandlet med pervanadate (figur 1), fører til fosforylert PD-1 haler. PD-1 proteiner ble samlet med anti-GFP belagt perler. Disse perler ble brukt for SHP2 co-immunoprecipitation fra lysates celler overexpressing SHP2. Nivåene av SHP2 bundet til hver versjon av PD-1 og den enzymatiske aktiviteten ble registrert.

Ikke overraskende, SHP2 kan ikke binde PD-1 når ITSM ble mutert (Y248F; Figur 2A). Bemerkelsesverdig, hemmet mutant versjonen av svart (Y223F) SHP2 binding bare i begrenset grad (figur 2B). Likevel viste SHP2 fosfatase aktivitet analysen at svart og ITSM var like uunnværlig for den enzymatiske aktiviteten (figur 2C). Siden PD-1 immunoprecipitates kan inneholde andre phosphatases, i tillegg til SHP2, brukte vi en kontroll tilstand (figur 2B og 2 C, blå) der SHP2 ikke var overexpressed.

Derfor er en totrinns aktivisering modell avslørt som SHP2 kastet inn i en auto-hemmet konformasjon under hvile forhold (figur 2D, venstre). Ved aktivering av PD-1, er SHP2 rekruttert til den phosphorylated ITSM (figur 2D, midten). Men må svart også bli fosforylert å utfolde seg SHP2 i sin aktive konformasjon (figur 2D, høyre).

Figure 1
Figur 1: eksperimentelle forhold og strategi. GFP-PD-1 WT (wild type), GFP-PD-1 Y223F (svart mutant), eller GFP-PD-1 Y248F (ITSM mutant) ble uttrykt i HEK 293T celler som ble senere behandlet med pervanadate. Fosforylert GFP-PD-1 proteiner samlet av GFP immunoprecipitation ble blandet med lysates fra celler overexpressing SHP2, og nivåene og aktiviteten til SHP2 bundet til hver versjon av PD-1 ble registrert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: The svart av PD-1 er nødvendig for SHP2 aktivitet. HEK 293T celler var transfekterte med de angitte versjonene av GFP-PD-1, etterfulgt av pervanadate behandling og immunoprecipitation med anti-GFP mAb-agarose (en). SHP2 nivåer bundet til utfelt GFP-PD-1 ble kvantifisert (b) og utsatt for en fosfatase aktivitet analysen (c). Verdiene for trakk ned SHP2 var normalisert GFP uttrykk nivåer. Alle verdier er fold-endring sammenlignet med intensiteten av utfelt SHP2 av WT GFP-PD-1 (wild type). Fosfatase aktivitet verdier er fold-endring sammenlignet med aktiviteten til co-immunoprecipitated SHP2 av WT GFP-PD-1. RU = relative enheter. (d) to-trinns aktivisering modellen. Først SHP2 er rekruttert til ITSM, og bare da andre SH2 domenet binder til den svart av PD-1, som strekker seg katalytisk domenet SHP2 til fullt aktive konformasjon. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. stjerner representerer betydelige forskjeller mellom gruppen kalt og WT PD-1 (b og c): **p < 0,01, ***p < 0,001, hender t-test, n = 3. Tillatelse til å bruke data fra Peled et al. (2018) 12 ble gitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Reseptor-enzym interaksjoner er avgjørende for intracellulær signalering. Mange enzymer er rekruttert til reseptorer gjennom SH2 domener binding til fosforylert tyrosines som dekorerer haler av samme reseptorer. Imidlertid er enzymer ofte i lukket inaktive konformasjonen, og aktivering krever en conformational endring11 som kan være formidlet av andre domener av samme reseptoren. Analysen beskrevet her tiltak samspillet mellom reseptorer og enzymer som aktiviteten indusert av disse interaksjoner.

Vi brukte en kolorimetrisk analysen som bruker p-nitrophenylphosphate (pNPP) som substrat for SHP2. pNPP er ikke-selektive substrat og fosfor giver som utgitt av en bred rekke enzymer15. Fosforylert rekombinant peptider kan tjene som alternativ underlag (f.eks., de ligner som brukes i malakitt grønne analysen). Disse peptider er mer spesifikke i fosfatase aktivitet. men det er dyrere, og på grunn av sin følsomhet, det kan bare utføres i fosfat-free løsninger. En annen metode å omgå mangel på spesifisitet mot pNPP er å inkludere en kontroll cellen linje der fosfatase i spørsmålet er slått ut. Overuttrykte SHP2 vil være den eneste kilden til enzymet i disse cellene, og noen økning i fosfatase aktivitet bør spesielt tilskrives den over uttrykt fosfatase. En tredje tilnærming er å bruke en renset epitope-merket SHP2 protein og renset epitope-merket PD-1 i stedet for WCL supplert med phosphopeptides som underlaget. Et alternativ til å bruke en phosphopeptide som underlaget er å bruke en fosfoprotein som i stedet, og deretter dephosphorylation av protein kan være oppdaget av phospho-spesifikke antistoffer eller phos-tag SDS-side.

Viktigere, kan metoden beskrevet her kaste lys over biologi andre reseptor-enzym interaksjoner. Det kan for eksempel avdekke funksjonen av tyrosin rester i SLAM familie reseptorer, som har blitt funnet for å være ubetydelig for samhandling med SHP216 , men kan faktisk være nødvendig for aktivering av det samme enzymet. Denne metoden kan også brukes til andre phosphatases i tillegg til reseptor-samspill kinaser.

Denne metoden er relativt ukomplisert, er det viktig å være oppmerksom når fosfatase hemmere bør unngås. Dette er nødvendig i det første trinnet i fosforylering induksjon av PD-1, men senere de må fjernes for å teste fosfatase aktiviteten til SHP2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette prosjektet ble finansiert av NIH tilskudd 1R01AI125640-01 og Rheumatology Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Lonza 17-516F Phosphate Buffered Saline
Microcentrifuge Eppendorf 5424-R 1.5 mL
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red Gibco 25200114
Heat Inactivated FBS Denville FB5001-H Fetal bovine serum
Penicillin / Streptomycin Fisher BP295950
DMEM high glucose without L-glutamine Lonza BE12-614F
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305
Anti-SHP2 Santa Cruz SC-280
Anti–GFP-agarose MBL D153-8
Anti-GFP Roche 118144600
Anti-Actin Santa Cruz SC-1616
HEK-293 cells ATCC CRL-1573
Orthovanadate Sigma S6508
H2O2 Sigma 216763 30%
Protease inhibitor cocktail Roche 11836170001 EDTA-free
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x) Invitrogen LC2676 Modified Laemmli buffer
4-20% Tris-Glycine Mini Gels Invitrogen XP04205BOX 15-well
Nitrocellulose membranes General Electric 10600004
NaCl Sigma S7653 Sodium chloride
HEPES Gibco 15630080 N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid
DTT Invitrogen D1532 Dithiothreitol
pNPP Sigma 20-106 p-Nitrophenyl Phosphate
NaOH Sigma S8045 Sodium hydroxide
BCA Fisher 23225 Bi Cinchoninic Acid assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17, (1), (2018).
  2. Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153, (1), 42-50 (2018).
  3. Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135, (2), 564-567 (2015).
  4. Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173, (2), 945-954 (2004).
  5. Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5, (230), 46 (2012).
  6. Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (45), (2007).
  7. Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209, (6), 1201-1217 (2012).
  8. Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355, (6332), 1428-1433 (2017).
  9. Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574, (1-3), 37-41 (2004).
  10. Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (24), 13866-13871 (2001).
  11. Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
  12. Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (3), E468-E477 (2018).
  13. Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28, (1), 25-30 (2009).
  14. Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270, (7), 2897-2900 (1995).
  15. McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 18, Unit18 18 (2010).
  16. Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166, (9), 5480-5487 (2001).
Co-immunoprecipitation analysen for å studere funksjonell samhandling mellom reseptorer og enzymer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peled, M., Strazza, M., Mor, A. Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes. J. Vis. Exp. (139), e58433, doi:10.3791/58433 (2018).More

Peled, M., Strazza, M., Mor, A. Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes. J. Vis. Exp. (139), e58433, doi:10.3791/58433 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter