Summary
Vi præsenterer her, en protokol for co-immunoprecipitation og en på perle enzymatisk aktivitet assay samtidig undersøge specifikke protein domæner af plasmamembran receptorer for både enzym rekruttering og enzymaktivitet bidrag.
Abstract
Receptor-associerede enzymer er de store mediatorer af cellulære aktivering. Disse enzymer reguleres, i det mindste i en del, af fysiske interaktion med cytoplasmatisk hale af receptorer. Interaktioner ofte opstår gennem specifikke protein domæner og resultere i aktivering af enzymer. Der er flere metoder til at studere samspillet mellem proteiner. Mens co-immunoprecipitation er almindeligt anvendt til at studere domæner, der er nødvendige for protein-protein interaktioner, er der ingen assays dokumentet bidrag af bestemte domæner til aktiviteten af de rekrutterede enzymer på samme tid. Derfor, metoden beskrevet her kombinerer co-immunoprecipitation og en på perle enzymatisk aktivitet assay for samtidige vurdering af samspillet mellem proteiner og tilknyttede enzymatisk aktivering. Målet med denne protokol er at identificere de domæner, der er kritiske for fysiske samspil mellem et protein og enzym og de domæner, der er obligatorisk for komplet aktivering af enzymet. Betydningen af denne analyse er vist, som visse receptor protein domæner bidrage til binding af enzym til cytoplasmatisk hale af receptoren, mens andre domæner er nødvendigt at regulere funktionen af det samme enzym.
Introduction
Katalytisk receptorer og receptor tyrosin kinaser er transmembrane proteiner, hvor bindingen af en ekstracellulære ligand forårsager enzymatisk aktivitet på den intracellulære side1. Nogle receptorer besidder både receptor og enzymatiske funktioner, mens andre rekruttere specifikke enzymer kinaser og fosfataser til deres cytoplasmatisk hale. Rekruttering af et enzym til den receptor hale og den efterfølgende katalytiske virkning af dette enzym er to separate processer, der ikke altid er underlagt de samme protein domæner2. Desværre er der ingen særlige værktøjer til at vurdere både interaktion og enzymatisk aktivitet samtidigt. Funktionelle co-immunoprecipitation analysen beskrevet her er en nyttig metode til at dissekere ansættelse af et enzym til halen af en receptor fra sin aktivering. Denne analyse udnytter immunoprecipitation af mærket receptorer af antistof-perler. Efterfølgende udføres både en enzymatisk aktivitet assay og western blot analyse på perler. Det overordnede mål med denne metode er at afdække hvilke protein domæner er nødvendige for interaktioner mellem receptorer og enzymer (vurderet af western blot analyse) og hvilke domæner er obligatorisk for komplet aktivering af enzymer (målt på perle enzymatisk aktivitet assay). Det er væsentligt at udvikle værktøjer til at studere de separate funktioner af receptor-associerede enzymer som følge af deres deltagelse i patogenesen af sygdomme hos mennesker. Desuden kan yderligere forståelse virkningsmekanisme af disse proteiner hjælpe design af nye terapeutiske indgreb.
Programmerede død-1 (PD-1) er en hæmmende receptor på overfladen af T-celler og er nødvendigt for at begrænse overdreven T celle svar. I de seneste år, har anti-PD-1 antistoffer været impliceret i behandling af flere maligniteter1,2. PD-1 ligatur tilbageholder mange T-cellefunktioner, herunder spredning, vedhæftning og sekretion af flere cytokiner3,4,5. PD-1 er lokaliseret til de immunologiske synapse, grænsefladen mellem T-celler og antigen-præsenterer celler6, hvor det colocalizes med T-celle-receptor (TCR)7. Efterfølgende, tyrosin phosphatase SHP2 [Src homologi 2 (SH2) domæne, der indeholder tyrosin phosphatase 2] er rekrutteret til den cytoplasmatisk hale af PD-1, fører til dephosphorylation af centrale tyrosin restkoncentrationer i TCR kompleks og dens tilknyttede proksimale signalering molekyler3,4,5,8,9. Den cytoplasmatisk hale af PD-1 indeholder to tyrosin motiver, en immunoreceptor tyrosin-baserede hæmmende motiv (ITIM) og en immunoreceptor tyrosin baseret switch motiv (ITSM)10. Begge motiver er fosforyleret på PD-1 ligatur9,10. Mutagenese undersøgelser har afsløret en primær rolle for ITSM i SHP2 rekruttering, i modsætning til ITIM, hvis rolle i PD-1 signaling og funktion ikke er klar4.
SHP2 vedtager enten en lukket (foldet), hæmmet kropsbygning eller en åben (extended), aktive kropsbygning11. Bidraget fra hver hale domæne af PD-1 til SHP2 bindende eller aktivisering er endnu ikke klarlagt. For at besvare dette spørgsmål, udviklede vi en analyse, der gør det muligt for paralleltest af ansættelse af SHP2 til halen af PD-1 og dens aktivitet12. Vi ansat co-immunoprecipitation og en på perle fosfatase aktivitet assay at teste både interaktion og enzymatisk aktivitet parallelt. Ved hjælp af denne analyse, viser vi, at ITSM PD-1 er tilstrækkelige til at rekruttere SHP2 til halen af PD-1, mens ITIM PD-1 er nødvendigt at udvide og aktivere enzymet.
Der er mange receptorer, der har flere tilstødende domæner i deres cytoplasmatisk hale. Funktionelle co-immunoprecipitation analysen kan afdække bestemte domæner, der er nødvendige for enten protein ansættelse eller enzymatisk aktivering rolle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transfektion af celler
- Seed HEK 293T celler i tolv 10 cm plader (5 x 106 celler pr. plade) dagen før Transfektion (figur 1). Udføre celle optælling ved hjælp af en hemocytometer. For hver plade, der anvendes 10 mL af DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin. Inkuber celler ved 37 ° C i 5% CO2.
- Når cellerne er 80-90% sammenflydende, transfect 5 HEK 293T plader ved hjælp af et lipid-baserede Transfektion reagens med en af de følgende plasmider: en SHP2-udtrykker vektor, en PD-1-normal god landbrugspraksis-udtrykker vektor [en vildtype (WT) version af PD-1], en ITIM-muteret version (Y223F ) af en PD-1-normal god landbrugspraksis-udtrykker vektor og en ITSM-muteret version (Y248F) af en PD-1-normal god landbrugspraksis-udtrykker vektor (figur 1).
Bemærk: To plader vil være transfekteret med WT PD-1-normal god landbrugspraksis-udtrykker vektor. En ekstra plade vil tjene som en ikke-transfekteret celler kontrol (figur 1). - Udføre Transfektion som pr fabrikantens protokol for vedhængende celler i 10 cm plader.
Bemærk: I de muterede versioner af PD-1, tyrosin (Y) i hvert motiv blev erstattet af fenylalanin (F) der ikke kan blive fosforyleret. - Transfect en anden identisk sæt af fem plader og en ekstra plade der tjener som en ikke-transfekteret kontrol for måling af udtrykt protein beløb [input; også kendt som hele cellen lysate (WCL)] før immunoprecipitation (figur 1).
- Inkubér transfected cellerne for 48 h i 37 ° C, 5% CO2 i en vævskultur inkubator.
Bemærk: For at sikre, at Transfektion opstod med succes, undersøge celler for normal god landbrugspraksis udtryk ved hjælp af et mikroskop for fluorescerende.
2. at fremme fosforylering i transfekteret celler
- Efter inkubationen forberede friske pervanadate ved at blande 50 µL af natrium-orthovanadate (fra 100 mM lager) med 50 µL 30% H2O2.
Bemærk: Blandingen bør ændres til en gullig farve. Pervanadate er en celle-gennemtrængelige fosfatase hæmmer, der fremmer fosforylering af tyrosin restkoncentrationer13. I denne analyse, er det anvendes til at fremkalde håndfast fosforylering af haler af PD-1. - For at phosphorylate de tagged versioner af PD-1, fjerne medierne fra de PD-1-normal god landbrugspraksis-transfekteret celler og der tilsættes 10 mL af almindelig DMEM (uden serum eller antibiotika) sammen med 10 µL pervanadate (trin 2.1) til hver 10 cm plade (hvilket resulterer i otte plader at udtrykke forskellige versioner af PD-1) (figur 1). Læg pladerne ved stuetemperatur i mørke i 15 min.
Bemærk: De SHP2 transfekteret celler (to plader; Figur 1) og de to ikke-transfekteret kontrol plader er ikke behandlet med pervanadate, da disse plader vil tjene som kilde for den aktive SHP2 enzym. - Cellerne vaskes med 5 mL iskold 1 x PBS. Gentag dette trin to gange.
3. Immunoprecipitation
Bemærk: Følgende trin skal udføres på is eller ved 4 ° C.
- Supplere lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 250 mM NaCl, 0,1% NP-40, 2 mM EDTA, 10% glycerol) med proteasehæmmere (Opløs 1 tablet i 10 mL af lysisbuffer) og 1 mM natrium orthovanadate. Tilføje 500 µL af iskold lysisbuffer til cellerne og fjerne og indsamle cellerne fra pladerne straks ved hjælp af en celle skraber.
Bemærk: Det er vigtigt at tilføje natrium orthovanadate kun til den lysisbuffer, der skal bruges for de PD-1-normal god landbrugspraksis-transfekteret plader, da SHP2-transfekteret plader og ikke-transfekteret kontrol plader skal bevare fosfataseaktivitet. - Overførsel af lysates til 1,5 mL koldt rør og rotere dem på 0,005 x g, 4 ° C i 30 min.
- For at indsamle post kerner supernatanten (PNS) fra lysates, spin ned lysates i 10 min på 10.000 x g ved 4 ° C og overføre analysere i nye rør. Kassér pelleten. Gemme analysere af det andet sæt af seks plader (figur 1) på is til senere WCL analyse.
-
Udarbejdelsen af anti-normal god landbrugspraksis perler for immunoprecipitation af PD-1-normal god landbrugspraksis fra den PD-1-normal god landbrugspraksis-transfekteret lysates af først sæt (fire plader) (figur 1).
- For at forhindre, at afregning af perlerne, forsigtigt Ryst flasken med perler før åbning. Fjerne 40 µL af anti-normal god landbrugspraksis perler fra gylle pr. hver tilstand.
- Spin på 500 x g i 3 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten at vaske perlerne.
Bemærk: Det er vigtigt at minimere kontakten mellem pipette plastik tips og Agarosen perler til at forhindre tab. Det anbefales at skære kanten af en 200 µL tip før overførsel perlerne til et andet rør. - Resuspend perlerne i 80 µL af lysisbuffer (pr. prøve).
- Tilføj de vasket perler direkte til cellen lysate (PNS) fra PD-1-normal god landbrugspraksis-udtrykker cellerne i det første sæt (fire plader) (trin 3.3). Rotere på 0,005 x g i 30 min. ved 4 ° C til immunoprecipitate normal god landbrugspraksis-tagged proteiner.
- Vask perler med 1 mL koldt lysisbuffer (uden orthovanadate) 3 gange. Centrifugeres tube på 2.500 x g i 10 s.
Bemærk: Når du tilføjer lysisbuffer til perlerne, så Tilføj det direkte på perlerne uden at røre ved dem med tips. Der er ingen grund til pipetteres op og ned under vasker. - Lige så opdele den lysate af den aktive SHP2 i det første sæt (én plade, trin 3.3) og tilføje det til tre rør af de vasket PD-1-normal god landbrugspraksis-holdige perler (WT PD-1-NGL og de to forskellige phosphdeficient mutationer, Y223F og Y248F). Tilføje en tredjedel af mængden fra den lysate af de ikke-transfekteret celler til det andet rør af WT PD-1-normal god landbrugspraksis perler. Smid de resterende to tredjedele.
- Inkuber perler i 4 timer ved 4 ° C med blide rotation (0,005 x g).
- Vaske perlerne to gange med 1 mL koldt lysisbuffer (uden pervanadate eller orthovanadate), som rapporteret i trin 3.6.
- Tilsættes 80 µL af lysisbuffer (uden pervanadate eller orthovanadate) pr. prøve at sikre, at den samlede mængde i hver tube 100 µL (20 µL af perler) og 80 µL af lysisbuffer. Bland forsigtigt og overføre 50 µL af hver tube til to friske 1,5 mL rør.
Bemærk: Efter dette trin, vil der være to rør fyldt med en blanding, der indeholder perler og lysisbuffer: et rør vil blive brugt til afprøvning co-immunoprecipitated SHP2 ved western blotting, og andet vil blive brugt til fosfatase aktivitet assay.
4. fosfatase aktivitet Assay
- Vaske perlerne engang med fosfatase vaskebuffer (30 mM Hepes til pH 7,4 og 120 mM NaCl). Fjern supernatanten helt.
- Tilføje 100 µL af analysebuffer (30 mM Hepes ved pH 7,4, 120 mM NaCl, 5 mM DTT, 10 mM p-nitrophenylphosphate) til perlerne, og der inkuberes ved 30 ° C i 30 min. under blid agitation. Bemærk: Inkubationstiden kan variere, men vent indtil bufferen bliver gul på dephosphorylation.
- For at afslutte reaktionen, tilføje 50 µL 1 M NaOH når bufferen bliver gul.
- Spin ned på 2.500 x g i 10 s og overførsel 50 µL af supernatanten to brønde (dubletter med 50 µL pr. brønd) af halv-området i en 96-brønd plade. Læse absorbans ved 405 nm.
- Udtrykke resultaterne som relativ optisk densitet (OD) over kontrol vildtype version af PD-1-normal god landbrugspraksis.
5. SHP2 Western Blot analyse
- Spin ned perlerne og Fjern supernatanten.
- Tilføj 20 µL af 2 x Laemmli buffer (Se Materialer tabel) perler og kog ved 95 ° C i 5 min.
- Måle proteinkoncentration af input kontrol (det andet sæt) ved hjælp af en BCA kit (Se Materialer tabel). Overføre 30 µL af den mest fortyndede prøve til en ny tube. Fortynd resten af indgangskontrolmulighederne med lysisbuffer til den samme koncentration som den mest fortyndede prøve, og overføre 30 µL af hver af dem til en ny tube.
Bemærk: Efter dette trin, vil der være 4 rør med 30 µL hver, på lignende protein fusioner, der repræsenterer inputtet, der styrer lysates. - Tilføj lige store mængder af 2 x Laemmli buffer til lysates og kog ved 95 ° C i 5 min. Spin ned perlerne og indlæse supernatanten på 4-20% SDS-PAGE Tris-baseret gel (Se Materialer tabel) for western blot analyse. Derudover indlæse 50 µL af hver prøve af det andet sæt.
- Fortsætte med western blot analyse efter protokol tidligere beskrevet12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mens bidrag af ITSM PD-1 til SHP2 bindende er etableret, er rolle af ITIM PD-1 mindre klar. Fordi SHP2 har to SH2 domæner, der kan bindes til to sekventielle phosphotyrosines på PD-1 (ét tyrosin i ITSM) og en anden i ITIM, vi antager, at ITSM PD-1 forankrer SHP2 til PD-1, mens ITIM PD-1 letter SHP2 aktivitet ved at stabilisere sin Åbn konformationelle stat11,14. For at teste dette, udviklede vi en kombineret co-immunoprecipitation og enzymatisk aktivitet assay til parallel vurdering af receptor-enzym interaktioner og aktivering. Vildtype normal god landbrugspraksis-PD-1, normal god landbrugspraksis-PD-1 Y223F (ITIM mutant), eller normal god landbrugspraksis-PD-1 Y248F (ITSM mutant) blev udtrykt i HEK 293T celler, der blev efterfølgende behandlet med pervanadate (figur 1), fører til fosforyleres PD-1 haler. PD-1 proteiner blev indsamlet ved hjælp af anti-NGL belagte perler. Disse perler blev brugt til SHP2 co-immunoprecipitation fra lysates af celler overekspression SHP2. Niveauer af SHP2 bundet til hver version af PD-1 og RuBisCOs enzymaktivitet blev registreret.
Ikke overraskende, SHP2 kunne ikke binde til PD-1, når ITSM var muteret (Y248F; Figur 2A). Bemærkelsesværdigt, hæmmede det mutante version af ITIM (Y223F) SHP2 bindende kun i begrænset omfang (figur 2B). Ikke desto mindre viste SHP2 fosfatase aktivitet assay, ITIM og ITSM var lige så uundværlig for den enzymatiske aktivitet (figur 2 c). Da PD-1 immunoprecipitates kan indeholde andre fosfataser, ud over SHP2, brugte vi en kontrol tilstand (figur 2B og 2 C, blå), hvor SHP2 ikke var overexpressed.
Derfor, en to-trins aktivering model afsløres, hvor SHP2 er foldet ind i en auto-inhiberet kropsbygning under hvile betingelser (figur 2D, venstre). Ved aktivering af PD-1, er SHP2 rekrutteret til den fosforyleres ITSM (figur 2D, midten). Dog skal ITIM også blive fosforyleret for at udfolde sig SHP2 i sin aktive kropsbygning (figur 2D, højre).
Figur 1: strategi og forsøgsbetingelser. Normal god landbrugspraksis-PD-1 WT (vildtype), normal god landbrugspraksis-PD-1 Y223F (ITIM mutant), eller normal god landbrugspraksis-PD-1 Y248F (ITSM mutant) blev udtrykt i HEK 293T celler, der blev efterfølgende behandlet med pervanadate. Fosforyleres normal god landbrugspraksis-PD-1 proteiner indsamlet af normal god landbrugspraksis immunoprecipitation blev blandet med lysates fra celler overekspression SHP2, og de niveauer og aktivitet af SHP2 bundet til hver version af PD-1 blev registreret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: ITIM af PD-1 er nødvendig for SHP2 aktivitet. HEK 293T celler blev transfekteret med de angivne versioner af normal god landbrugspraksis-PD-1, efterfulgt af pervanadate behandling og immunoprecipitation ved hjælp af anti-normal god landbrugspraksis mAb-Agarosen (en). SHP2 niveauer bundet til udfældet normal god landbrugspraksis-PD-1 blev kvantificerede (b) og underkastes en fosfatase aktivitet assay (c). Værdier af trak-down SHP2 var normaliseret til normal god landbrugspraksis udtryk niveauer. Alle værdier er fold-ændring sammenlignet med intensiteten af udfældet SHP2 af WT NGL-PD-1 (vildtype). Fosfatase aktivitet værdier er fold-ændring sammenlignet med aktiviteten af co-immunoprecipitated SHP2 af WT NGL-PD-1. RU = relative enheder. (d) to-trins aktivering model. Første SHP2 er rekrutteret til ITSM, og først derefter binder den anden SH2 domæne til ITIM af PD-1, som udvider den katalytiske domæne af SHP2 til den fuldt aktiv kropsbygning. Data præsenteres som gennemsnit ± SEM. stjerner repræsenterer betydelige forskelle mellem gruppen betegnes og WT PD-1 (b og c): **p < 0,01, ***p < 0,001, uparret t-test, n = 3. Tilladelse til at bruge data fra Peled et al. (2018) 12 blev ydet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Receptor-enzym interaktioner er afgørende for intracellulær signalering. Mange enzymer er rekrutteret til receptorer gennem SH2 domæner bindende at fosforyleres tyrosines, at dekorere haler af de samme receptorer. Dog enzymer er ofte foldet ind i lukkede inaktive konformationer, og aktivering kræver en konformationel ændring11 , som kan være medieret af andre domæner af samme receptor. Analysen beskrives her foranstaltninger interaktioner mellem receptorer og enzymer samt aktiviteten induceret af disse interaktioner.
Vi brugte en kolorimetrisk assay, der bruger p-nitrophenylphosphate (pNPP) som substrat for SHP2. pNPP er en non-selektive substrat og fosfor donor, der er udgivet af en bred række enzymer15. Fosforyleres rekombinant peptider kan tjene som alternative substrater (fx., dem ligner dem brugt i Malakit grønt analysen). Disse peptider er mere specifik med hensyn til fosfataseaktivitet; men det er dyrere, og på grund af dens følsomhed, det kan kun udføres i fosfatfri løsninger. En anden metode til at omgå manglende specificitet mod pNPP er at inkludere en kontrol cellelinie, hvor den pågældende fosfatase er slået ud. I disse celler, overekspression af SHP2 vil være den eneste kilde til enzymet og en forøgelse af fosfataseaktivitet bør henføres specifikt til den over udtrykt fosfatase. En tredje metode er at anvende en renset epitop-markeret SHP2 protein og renset epitop-tagged PD-1 i stedet for WCL suppleret med phosphopeptides som substrat. Et alternativ til at bruge en phosphopeptide som substrat er at bruge en phosphoprotein i stedet, og derefter dephosphorylation af protein kan påvises ved en phospho-specifikke antistof eller billederne-tag SDS-PAGE.
Vigtigere, kan metoden beskrevet her kaste lys over biologi af andre interaktioner, receptor-enzymet. For eksempel kan det afsløre funktionen af tyrosin restkoncentrationer i SLAM familie receptorer, som har vist sig for at være ubetydelige for interaktioner med SHP216 men kan faktisk være nødvendigt for aktivering af det samme enzym. Denne metode kan også anvendes på andre fosfataser samt receptor-interagere kinaser.
Denne metode er relativt ligetil, er det vigtigt at bemærke, når fosfatase hæmmere bør undgås. Disse er nødvendige i den indledende trin i fosforylering induktion af PD-1, men senere skal de fjernes for at teste fosfataseaktivitet af SHP2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette projekt blev finansieret af NIH tilskud 1R01AI125640-01 og reumatologi Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
References
- Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17 (1), (2018).
- Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).
- Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).
- Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).
- Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).
- Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).
- Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
- Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
- Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).
- Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).
- Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
- Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).
- Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).
- Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).
- McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 18, Unit18 18 (2010).
- Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).
