Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para co-imunoprecipitação e um ensaio de atividade enzimática em grânulo para estudar simultaneamente a contribuição de domínios da proteína específica dos receptores de membrana plasmática ao recrutamento de enzima e atividade enzimática.
Abstract
Receptores associados a enzimas são os principais mediadores de ativação celular. Estas enzimas são regulamentadas, pelo menos em parte, pelas interações físicas com cauda citoplasmática dos receptores de. As interações frequentemente ocorrem através de domínios da proteína específica e resultam em ativação das enzimas. Existem vários métodos para estudar as interações entre proteínas. Enquanto co-imunoprecipitação é comumente usado para estudar os domínios que são necessários para interações da proteína-proteína, existem ensaios sem esse documento a contribuição de domínios específicos para a atividade das enzimas recrutadas ao mesmo tempo. Por conseguinte, o método descrito aqui combina co-imunoprecipitação e um ensaio de atividade enzimática em grânulo para avaliação simultânea das interações entre proteínas e associado da ativação enzimática. O objetivo do presente protocolo é identificar os domínios que são críticos para interações físicas entre uma proteína e enzima e os domínios que são obrigatórios para a completa ativação da enzima. A importância deste teste é demonstrada, como receptor de certo domínios da proteína contribuem para a ligação da enzima para a cauda citoplasmática do receptor, enquanto outros domínios são necessários para regular a função da mesma enzima.
Introduction
Receptores catalíticos e quinase de tirosina do receptor é proteínas transmembrana, na qual a ligação de um ligante extracelular causa atividade enzimática no intracelular lado1. Alguns receptores possuem tanto receptor e funções enzimáticas, enquanto outros recrutam enzimas específicas tais como quinases e fosfatases para sua cauda citoplasmática. Recrutamento de uma enzima, a cauda do receptor e a subsequente ação catalítica desta enzima são dois processos separados que não são sempre regulados pela mesma proteína domínios2. Infelizmente, não há nenhum ferramentas específicas para avaliar a interação e a atividade enzimática em simultâneo. O ensaio funcional co-imunoprecipitação descrito aqui é um método útil para dissecar o recrutamento de uma enzima para a cauda de um receptor de sua ativação. Este ensaio utiliza imunoprecipitação de receptores marcados por grânulos revestidos de anticorpo. Posteriormente, um ensaio de atividade enzimática e análise ocidental do borrão em grânulos são executadas. O objectivo geral deste método é para descobrir quais domínios da proteína são necessários para interações entre receptores e enzimas (avaliadas pela análise ocidental do borrão) e os domínios são obrigatórios para a ativação completa das enzimas (medido por no grânulo ensaio de atividade enzimática). É significativo desenvolver ferramentas para estudar as funções separadas de enzimas associadas do receptor, devido ao seu envolvimento na patogênese de doenças humanas. Além disso, ainda mais, compreender os mecanismos de ação dessas proteínas pode ajudar a concepção de novas intervenções terapêuticas.
Morte programada-1 (PD-1) é um receptor inibitório na superfície de células T e é necessário para limitar a excessiva de células T respostas. Nos últimos anos, os anticorpos anti-PD-1 têm sido implicados no tratamento de várias neoplasias malignas1,2. PD-1 ligadura restringe várias funções de células T, incluindo a proliferação, adesão e secreção de várias citocinas3,4,5. PD-1 está localizada a sinapse imunológica, a interface entre as células T e apresentadoras células6, onde ele colocalizes com os receptores de células T (TCR)7. Posteriormente, a tirosina fosfatase SHP2 [Src homologia 2 (SH2) domínio contendo tirosina fosfatase 2] é recrutado para a cauda citoplasmática da PD-1, levando a dephosphorylation de resíduos tirosina chave dentro complexo TCR e seu associado proximais sinalização moléculas3,4,5,8,9. A cauda citoplasmática da PD-1 contém dois motivos de tirosina, um immunoreceptor baseada em tirosina inibitório do motivo (ITIM) e um immunoreceptor tirosina motivo baseado-switch (ITSM)10. Ambos os motivos são fosforilados sobre PD-1 ligadura9,10. Mutagênese estudos têm revelado um papel primordial para o ITSM no recrutamento, em oposição a ITIM, cujo papel na função e PD-1 sinalização não é claro. SHP24.
SHP2 adota qualquer um fechado (dobrado), inibiu a conformação ou aberto (estendido), conformação ativa11. A contribuição de cada domínio de cauda do PD-1 SHP2 vinculação ou ativação ainda não foi elucidada. Para responder a esta pergunta, nós desenvolvemos um ensaio que permite testar paralelo do recrutamento de SHP2 à cauda da PD-1 e sua atividade12. Utilizamos o co-imunoprecipitação e um ensaio de atividade de fosfatase em grânulo para testar a interação e a atividade enzimática em paralelo. Usando este ensaio, mostramos que o ITSM de PD-1 é suficiente para recrutar SHP2 à cauda da PD-1, enquanto o ITIM de PD-1 é necessária para totalmente estender e ativar a enzima.
Existem muitos receptores que possuem vários domínios adjacentes em sua cauda citoplasmática. O ensaio funcional co-imunoprecipitação pode descobrir o papel de domínios específicos que são necessárias para o recrutamento de proteína ou ativação enzimática.
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Protocol
1. transfecção de células
- Células de 293T HEK as sementes em doze placas de 10 cm (5 x 106 células por placa) na véspera do transfection (Figura 1). Realize a contagem de células usando um hemocytometer. Para cada placa, use 10 mL de DMEM suplementado com 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina. Incube a 37 ° C em 5% CO2células.
- Uma vez que as células são 80-90% de confluencia, transfect 5 placas HEK 293T, usando um reagente de Transfeccao de lipídios-baseado com um dos seguintes plasmídeos: um vetor de SHP2-expressando, um vetor de PD-1-GFP-expressando [um tipo selvagem (WT) versão do PD-1], uma versão ITIM-mutante (Y223F ) de um vetor de PD-1-GFP-expressando e uma versão de uma mutação de ITSM (Y248F) de um vetor de PD-1-GFP-expressando (Figura 1).
Nota: Duas placas serão transfected com o vetor WT PD-1-GFP-expressando. Uma placa adicional irá servir como um controle de células não-transfectadas (Figura 1). - Execute o transfection conforme o protocolo do fabricante para células aderentes em placas de 10 cm.
Nota: Nas versões mutantes do PD-1, a tirosina (Y) em cada motivo foi substituída por fenilalanina (F) que não pode ser fosforilada. - Transfect um segundo conjunto idêntico de cinco pratos e uma placa adicional, servindo como um controle de não-transfectadas para a medição da quantidade de proteína expressa [entrada; também conhecido como lisado celular (CMT)] antes da imunoprecipitação (Figura 1).
- Incube as celulas transfectadas para 48 h em 37 ° C, 5% de CO2 em uma incubadora de cultura de tecidos.
Nota: Para garantir que transfecção ocorreu com sucesso, examine as células para expressão de GFP, usando um microscópio fluorescente.
2. promover a fosforilação em células transfectadas
- Após incubação, prepare pervanadate fresco misturando-se 50 µ l de sódio-ortovanadato (do estoque de 100 mM) com 50 µ l de 30% H2O2.
Nota: A mistura deve mudar para uma cor amarelada. Pervanadate é um inibidor da fosfatase permeável ao celular que promove a fosforilação de resíduos de tirosina13. Neste ensaio, é usado para induzir robustamente fosforilação das caudas de PD-1. - Para fosforilar as versões etiquetadas de PD-1, remova a mídia a partir de células de PD-1-GFP-transfectadas e adicionar 10 mL de DMEM simples (sem o soro e antibióticos), juntamente com 10 µ l de pervanadate (passo 2.1) para cada placa de 10 cm (resultando em oito placas expressando diferentes versões do PD-1) (Figura 1). Coloca as placas à temperatura ambiente no escuro por 15 min.
Nota: As SHP2-transfectadas células (duas placas; A Figura 1) e as duas placas de controlo não-transfectadas não são tratadas com pervanadate, desde que estas placas servirá como fonte para a enzima SHP2 ativa. - Lave as células com 5 mL de PBS 1x gelada. Repita duas vezes.
3. imunoprecipitação
Nota: As seguintes etapas devem ser executadas no gelo ou a 4 ° C.
- Suplemento a lise (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 250 mM NaCl, 0,1% NP-40, 2 mM EDTA, 10% de glicerol) com inibidores de protease (dissolver 1 comprimido em 10 mL de tampão de Lise) e com 1 mM de sódio ortovanadato. Adicionar 500 µ l de tampão de Lise gelada para as células e remover e recolher as células das placas imediatamente com uma espátula de célula.
Nota: É importante adicionar o ortovanadato de sódio só para a Lise que será usado para as placas de PD-1-GFP-transfectadas, desde que as placas SHP2-transfectadas e placas de controlo não-transfectadas devem reter a atividade da fosfatase. - Transferir os lysates para tubos frio de 1,5 mL e girá-los a 0,005 x g, 4 ° C por 30 min.
- Para coletar os núcleos post sobrenadante (PNS) dos lysates, spin para baixo os lysates durante 10 minutos a 10.000 x g a 4 ° C e transferir os sobrenadantes para tubos novos. Descarte a pelota. Armazene os sobrenadantes do segundo conjunto de seis placas (Figura 1) no gelo para análise posterior WCL.
-
Preparação dos grânulos antiboas práticas agrícolas para a imunoprecipitação de PD-1-GFP dos PD-1-GFP-transfectadas lysates do primeiro conjunto (quatro placas) (Figura 1).
- Para evitar a sedimentação dos grânulos, agite a garrafa com as contas antes de abrir. Remova o chorume por cada condição 40 µ l dos grânulos anti-GFP.
- Girar a 500 x g durante 3 min a 4 ° C e remover o sobrenadante para lavar os grânulos.
Nota: É importante minimizar o contato entre as pontas de pipetas plásticas e grânulos de agarose para evitar a perda. Recomenda-se cortar a borda de uma dica de 200 µ l antes de transferir as contas para outro tubo. - Resuspenda as contas em 80 µ l de tampão de lise (por exemplo).
- Adicione as contas lavadas diretamente para o lisado celular (PNS) das células do primeiro conjunto (quatro placas) PD-1-GFP-expressando (passo 3.3). Gire a 0,005 x g durante 30 min a 4 ° C, a immunoprecipitate o GFP-etiquetado proteínas.
- Lave os grânulos com 1 mL de tampão de Lise fria (sem ortovanadato) 3 vezes. Centrifugar o tubo a 2.500 x g durante 10 s.
Nota: Ao adicionar a Lise aos talões, adicioná-lo diretamente sobre as contas sem tocá-los com as dicas. Não há nenhuma necessidade para Pipetar para cima e para baixo durante as lavagens. - Igualmente, dividir o lisado do SHP2 ativo do primeiro conjunto (uma placa; passo 3.3) e adicioná-lo aos três tubos dos lavados PD-1-GFP-contendo grânulos (a PD WT-1-GFP e as duas mutações diferentes phosphdeficient, Y223F e Y248F). Adicione um terço do volume do lisado das células não transfectadas para o segundo tubo dos grânulos WT PD-1-GFP. Elimine os dois terços restantes.
- Incube os grânulos por 4 h a 4 ° C, com suave rotação (0.005 x g).
- Lave os grânulos duas vezes com 1 mL de tampão de Lise fria (sem pervanadate ou ortovanadato), conforme relatado na etapa 3.6.
- Adicione 80 µ l de tampão de lise (sem pervanadate ou ortovanadato) por exemplo, assegurando que o volume total, em cada tubo é 100 µ l (20 µ l de grânulos) e 80 µ l de tampão de Lise. Misture delicadamente e transferir 50 µ l de cada tubo para dois tubos de fresco 1,5 mL.
Nota: Após esta etapa, haverá dois tubos enchidos com uma mistura que contém grânulos e lise: um tubo será usado para testar o SHP2 co-immunoprecipitated pela mancha ocidental, e a segunda será usada para o ensaio da atividade da fosfatase.
4. ensaio da atividade da fosfatase
- Lave os grânulos uma vez com tampão de lavagem fosfatase (30 mM Hepes pH 7,4 e 120 mm NaCl). Remova o sobrenadante completamente.
- Adicionar 100 µ l de buffer de ensaio (30 mM Hepes pH 7,4, 120 mM de NaCl, 5 mM DTT, p-nitrofenilfosfato de 10 mM) para as contas e incubar a 30 ° C por 30 min sob agitação suave. Nota: Tempo de incubação pode variar, mas esperar até que o buffer fica amarelo a desfosforilação.
- Para finalizar a reação, adicione 50 µ l de 1 M de NaOH, quando o buffer fica amarelo.
- Spin para baixo a 2.500 x g durante 10 s e transferência 50 µ l do sobrenadante para dois poços (duplicatas com 50 µ l por alvéolo) de meia-área em uma placa de 96 poços. Ler a absorbância em 405 nm.
- Exprimir os resultados em densidade óptica (OD) sobre a versão do selvagem-tipo de controle de PD-1-GFP.
5. SHP2 Análise de borrão ocidental
- Spin para baixo os grânulos e remover o sobrenadante.
- Adicionar 20 µ l de tampão de x Laemmli 2 (veja a Tabela de materiais) para os grânulos e ferver a 95 ° C por 5 min.
- Medir a concentração de proteína da entrada de controles (segundo set) usando um BCA kit (veja a Tabela de materiais). Transferi 30 µ l da amostra mais diluída para um tubo novo. Diluir o resto dos controles de entrada com tampão de lise na mesma concentração da amostra mais diluída e transferir 30 µ l de cada um para um novo tubo.
Nota: Após esta etapa, haverá 4 tubos com 30 µ l cada, em concentrações de proteína semelhante, que representa a entrada controla lisados. - Adicionar volumes iguais de 2 de x Laemmli de buffer para os lysates e ferver a 95 ° C por 5 min. Spin para baixo os grânulos e carregar o sobrenadante no 4 – 20% gel de SDS-PAGE Tris-baseada (veja a Tabela de materiais) para western blot-análise. Além disso, carrega 50 µ l de cada amostra do segundo conjunto.
- Continue a análise ocidental do borrão de acordo com o protocolo descrito anteriormente12.
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Representative Results
Enquanto a contribuição do ITSM de PD-1 para SHP2 ligação é estabelecida, o papel do ITIM de PD-1 é menos claro. Porque SHP2 tem dois domínios SH2 que podem ligar dois phosphotyrosines sequenciais em PD-1, (uma tirosina no ITSM) e outra no ITIM, formulamos a hipótese que o ITSM de PD-1 Ancora SHP2 PD-1, enquanto o ITIM de PD-1 facilita a atividade SHP2, estabilizando seu Abra o estado conformacional11,14. Para testar isso, desenvolvemos um combinado co-imunoprecipitação e ensaio de atividade enzimática para a avaliação paralela de interações do receptor-enzima e ativação. Tipo selvagem GFP-PD-1, GFP-PD-1 Y223F (mutante ITIM), ou GFP-PD-1 Y248F (mutante ITSM) manifestaram-se em células HEK 293T que foram posteriormente tratadas com pervanadate (Figura 1), levando a fosforilada caudas PD-1. PD-1 proteínas foram coletadas usando anti-GFP revestido grânulos. Estes grânulos foram utilizados para a SHP2 co-imunoprecipitação de lisados de células superexpressão SHP2. Os níveis de SHP2 limite para cada versão do PD-1 e sua atividade enzimática foram gravados.
Sem surpresa, SHP2 falha ao vincular a PD-1 quando o ITSM foi uma mutação (Y248F; Figura 2A). Notavelmente, a versão mutante do ITIM (Y223F) inibiu SHP2 ligação apenas de forma limitada (Figura 2B). No entanto, o ensaio da atividade da fosfatase SHP2 revelou que o ITIM e ITSM foram igualmente indispensável para a atividade enzimática (Figura 2). Desde que o PD-1 immunoprecipitates pode conter outras fosfatases, além SHP2, usamos uma condição de controle (Figura 2B e 2C, azul), em que SHP2 não era overexpressed.
Portanto, um modelo de ativação de duas etapas é revelado em que SHP2 é dobrada em uma conformação autoinibida sob condições (Figura 2D, à esquerda) a descansar. Após a ativação do PD-1, SHP2 é recrutado para o ITSM fosforilada (Figura 2D, médio). No entanto, a Yara também deve ser fosforilada para desdobrarem-se SHP2 em sua conformação ativa (Figura 2D, direita).
Figura 1: condições experimentais e estratégia. GFP-PD-1 WT (tipo selvagem), GFP-PD-1 Y223F (mutante ITIM), ou GFP-PD-1 Y248F (mutante ITSM) manifestaram-se em células HEK 293T que posteriormente foram tratadas com pervanadate. Fosforilada proteínas GFP-PD-1, coletadas por imunoprecipitação GFP foram misturadas com lysates de células superexpressão SHP2, e os níveis e a atividade de SHP2 limite para cada versão do PD-1 foram gravadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O ITIM de PD-1 é necessário para a atividade de SHP2. Células de 293T HEK foram transfectadas com as versões indicadas do GFP-PD-1, seguido de tratamento pervanadate e imunoprecipitação usando anti-GFP mAb-agarose (uma). Níveis de SHP2 limite a precipitada GFP-PD-1 foram quantificados (b) e submetido a um ensaio da atividade da fosfatase (c). Valores de SHP2 puxado para baixo foram normalizados para os níveis de expressão de GFP. Todos os valores são dobra-mudança em comparação com a intensidade do SHP2 precipitado pelo WT GFP-PD-1 (tipo selvagem). Valores de atividade de fosfatase são dobra-mudança em comparação com a atividade de co-immunoprecipitated SHP2 pelo WT GFP-PD-1. RU = unidades relativas. (d) o modelo de ativação de duas etapas. Em primeiro lugar, SHP2 é recrutado para o ITSM, e só então é que o segundo domínio SH2 vincular para o ITIM de PD-1, que se estende o domínio catalítico de SHP2 para a conformação totalmente ativo. Os dados são apresentados como média ± SEM. asteriscos representam diferenças significativas entre o grupo denotado por e o PD-1 WT (b e c): * *p < 0,01, * * *p < 0,001, unpaired t-teste, n = 3. Permissão para usar os dados de Peled et al (2018) 12 foi concedida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Receptor-enzima interações são cruciais para sinalização intracelular. Muitas enzimas são recrutadas aos receptores através de domínios SH2 vinculando a tyrosines fosforiladas que decoram as caudas dos mesmos receptores. No entanto, enzimas são muitas vezes dobradas em conformações inativas fechadas e ativação requer uma mudança conformacional11 que pode ser mediada por outros domínios do mesmo receptor. O ensaio descrito aqui medidas as interações entre receptores e enzimas, bem como a atividade induzidas por essas interações.
Nós usamos um ensaio colorimétrico que utiliza p-nitrofenilfosfato (pNPP) como substrato para a SHP2. pNPP é um doador não-seletivo de substrato e do fósforo que é liberado por um amplo número de enzimas15. Peptídeos recombinantes fosforilados podem servir como substratos alternativos (ex., aqueles semelhantes aos utilizados no ensaio de verde malaquita). Estes peptídeos são mais específicos em termos de atividade da fosfatase; no entanto, é mais caro, e devido à sua sensibilidade, só pode ser realizada em soluções livre de fosfato. Outra abordagem para contornar a falta de especificidade para pNPP é incluir uma linha de celular de controle no qual a fosfatase em questão é nocauteado. Nestas células, superexpressão de SHP2 será a única fonte para a enzima, e qualquer aumento na atividade de fosfatase deve ser atribuído especificamente a fosfatase over expressa. Uma terceira abordagem é usar uma proteína purificada de SHP2 epítopo-tag e purificado com tag epítopo PD-1 em vez de WCL completada por phosphopeptides como substrato. Uma alternativa ao uso de uma Fosfopeptida como o substrato é um phosphoprotein em vez de usar, e então a desfosforilação da proteína pode ser detectada por um anticorpo específico de phospho ou phos-marca SDS-PAGE.
Importante, o método descrito aqui pode lançar luz sobre a biologia de outras interações enzima-receptor. Por exemplo, ele pode descobrir a função dos resíduos de tirosina em receptores família SLAM, que foram encontrados para ser insignificante para interações com SHP216 , mas na verdade podem ser necessária para a ativação da mesma enzima. Esse método também pode ser aplicado a outras fosfatases, bem como a interação do receptor quinases.
Enquanto este método é relativamente simples, é importante observar quando inibidores da fosfatase devem ser evitados. Estas são necessárias na etapa inicial da indução de fosforilação do PD-1, mas mais tarde eles devem ser removidos a fim de testar a atividade da fosfatase do SHP2.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este projecto foi financiado pelo NIH bolsas 1R01AI125640-01 e a Fundação de pesquisa de Reumatologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
References
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