Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Co-immunoprecipitation Assay voor het bestuderen van functionele interacties tussen receptoren en enzymen

Published: September 28, 2018 doi: 10.3791/58433

Summary

Hier presenteren we een protocol voor co-immunoprecipitation en een op-kraal enzymatische activiteit assay gelijktijdig het bestuderen van de bijdrage van specifieke proteïne domeinen van plasmamembraan receptoren aan zowel de enzym werving en de enzymactiviteit.

Abstract

Receptor-associated enzymen zijn de grote bemiddelaars van cellulaire activering. Deze enzymen zijn geregeld, ten minste gedeeltelijk, fysieke interactie met de cytoplasmatische staarten van de receptoren. De interacties die vaak optreden door middel van specifieke proteïne domeinen en leiden tot activering van de enzymen. Er zijn verschillende methoden om de studie van interacties tussen eiwitten. Hoewel co-immunoprecipitation wordt gebruikt bij het bestuderen van domeinen die vereist voor eiwit-eiwitinteractie zijn, zijn er geen testen dat document de bijdrage van specifieke domeinen naar activiteit van de enzymen van de aangeworven op hetzelfde moment. De hier beschreven methode combineert dienovereenkomstig, co-immunoprecipitation en een enzymatische activiteit op-kraal-assay voor gelijktijdige evaluatie van interacties tussen eiwitten en bijbehorende enzymatische activatie. Het doel van dit protocol is het identificeren van de domeinen die kritisch zijn voor de fysieke interactie tussen een eiwit en enzym en de domeinen die verplicht voor volledige activering van het enzym zijn. Het belang van deze bepaling wordt aangetoond, als bepaalde receptor eiwitten domeinen bijdragen aan de binding van het enzym aan de cytoplasmatische staart van de receptor, terwijl andere domeinen nodig zijn om te regelen van de functie van het zelfde enzym.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Katalytische receptoren en receptor tyrosine kinases zijn transmembraan eiwitten waarin binding van een extracellulaire ligand enzymatische activiteit op de intracellulaire kant1 veroorzaakt. Sommige receptoren bezitten zowel de receptor en de enzymatische functies, terwijl anderen specifieke enzymen zoals kinases en phosphatases aan hun cytoplasmatische staarten werven. Aanwerving van een enzym aan de receptor de staart en de daaropvolgende katalytische werking van dit enzym zijn twee afzonderlijke processen die niet altijd door de dezelfde eiwit domeinen2zijn geregeld. Helaas zijn er geen specifieke hulpmiddelen voor het beoordelen van zowel de interactie en de enzymatische activiteit tegelijkertijd. De bepaling van de functionele co-immunoprecipitation hier beschreven is een handige methode om te ontleden de aanwerving van een enzym aan de staart van een receptor van de activering. Deze test maakt gebruik van immunoprecipitation van tagged receptoren door antilichaam beklede kralen. Vervolgens worden een enzymatische activiteit assay zowel de westelijke vlekkenanalyse op parels uitgevoerd. Het algemene doel van deze methode is om te ontdekken welke domeinen eiwitten zijn nodig voor interacties tussen receptoren en enzymen (beoordeeld door westelijke vlekkenanalyse) en welke domeinen zijn verplicht voor volledige activering van de enzymen (gemeten door op-parel enzymatische activiteit assay). Het is belangrijk om instrumenten voor de studie van de afzonderlijke functies van receptor-associated enzymen als gevolg van hun betrokkenheid bij de pathogenese van ziekten bij de mens te ontwikkelen. Bovendien kan verder inzicht in de mechanismen van de actie van deze proteïnen helpen bij het ontwerp van nieuwe therapeutische interventies.

Geprogrammeerde dood-1 (PD-1) is een remmende receptor op het oppervlak van T-cellen en is vereist voor het beperken van excessieve T cel reacties. In de afgelopen jaren zijn anti-PD-1 antilichamen betrokken bij de behandeling van meerdere maligniteiten1,2. PD-1 afbinding weerhoudt talrijke T-cel-functies, met inbegrip van de proliferatie, hechting en secretie van meerdere cytokines3,-4,5. PD-1 is gelokaliseerd aan de immunologische SYNAPS, het raakvlak tussen T-cellen en antigeen-presenteren cellen6, waar het colocalizes met de T-cel-receptor (TCR)7. Vervolgens de tyrosine fosfatase SHP2 [Src homologie 2 (SH2) domein met tyrosine fosfatase 2] is gerekruteerd om de cytoplasmatische staart van PD-1, wat leidt tot dephosphorylation van belangrijke tyrosine residuen binnen de complexe TCR en de bijbehorende proximale signalering moleculen3,4,5,8,9. De cytoplasmatische staart van PD-1 bevat twee tyrosine motieven, een immunoreceptor op basis van tyrosine remmende motief (ITIM) en een immunoreceptor tyrosine gebaseerd-switch motief (ITSM)10. Beide motieven zijn phosphorylated op PD-1 afbinding9,10. Mutagenese studies is gebleken een primaire rol voor de ITSM in SHP2 werving, in tegenstelling tot de ITIM, waarvan de rol in PD-1 signalering en functie niet duidelijk is4.

SHP2 ofwel een gesloten (gevouwen) aanneemt, geremd conformatie of een open (extended), actieve conformatie11. De bijdrage van elk domein van de staart van PD-1 om SHP2 binding of activering is nog niet opgehelderd. Deze vraag te beantwoorden, ontwikkelden we een test waarmee parallelle testen van de aanwerving van SHP2 aan de staart van PD-1 en zijn activiteit12. Wij werkzaam co-immunoprecipitation en een op-kraal fosfatase activiteit assay voor het testen van zowel de interactie en de enzymatische activiteit in parallel. Met behulp van deze bepaling, laten we zien dat de ITSM van PD-1 volstaat om te werven van SHP2 aan de staart voor PD-1, terwijl de ITIM van PD-1 is nodig om volledig uit te breiden en activeren van het enzym.

Er zijn veel receptoren die meerdere aangrenzende domeinen in hun cytoplasmatische staarten hebben. De bepaling van de functionele co-immunoprecipitation kunt ontdekken de rol van specifieke domeinen die nodig voor het eiwit aanwerving of enzymatische activatie zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. de transfectie van cellen

  1. Beënt HEK 293T cellen in twaalf 10 cm platen (5 x 106 cellen per plaat), de dag vóór de transfectie (Figuur 1). De cel tellen met behulp van een hemocytometer uitvoeren Gebruik voor elke plaat, 10 mL van DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine. Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO2.
  2. Zodra de cellen 80-90% heuvels zijn, transfect 5 HEK 293T platen met behulp van een lipide gebaseerde transfectiereagens met een van de volgende plasmiden: een vector SHP2-uitdrukken, een vector van PD-1-GFP-uiten [een wild type (WT) versie van PD-1], een ITIM-gemuteerde versie (Y223F ) van een vector PD-1-GFP-uitdrukken, en een ITSM-gemuteerde versie (Y248F) van een vector van PD-1-GFP-uitdrukken (Figuur 1).
    Opmerking: Twee platen zal met de vector WT PD-1-GFP-uiting geven aan zijn transfected. Een extra plaat zal dienen als een besturingselement niet-transfected cellen (Figuur 1).
  3. De transfectie volgens protocol van de fabrikant voor Adherente cellen in 10 cm platen uitvoeren.
    Opmerking: In de gemuteerde versies van PD-1, de tyrosine (Y) in elk motief werd vervangen door fenylalanine (F) die niet kan worden phosphorylated.
  4. Transfect een tweede identieke set van vijf platen en een extra plaat fungeren als een besturingselement niet-transfected voor de meting van uitgedrukt eiwit bedrag [input; ook bekend als hele cel lysate (WVA)] vóór de immunoprecipitation (Figuur 1).
  5. Incubeer de transfected cellen voor 48 uur in 37 ° C, 5% CO2 in een incubator weefselkweek.
    Opmerking: Om ervoor te zorgen dat transfectie met succes opgetreden, onderzoeken de cellen voor GFP expressie met behulp van een fluorescente microscoop.

2. bevordering van fosforylering in Transfected cellen

  1. Na incubatie, bereid verse pervanadate door het mengen van 50 µL van natrium-orthovanadate (vanaf 100 mM voorraad) met 50 µL van 30% H2O2.
    Opmerking: Het mengsel moet veranderen in een gelige kleur. Pervanadate is een cel-permeabele fosfatase-remmer die fosforylatie van tyrosine residuen13 bevordert. In deze test, is het krachtig ertoe fosforylering van de staarten van PD-1 gebruikt.
  2. Als u wilt phosphorylate de gecodeerde versies van PD-1, verwijder het medium van de PD-1-GFP-transfected cellen en voeg 10 mL van de gewone DMEM (zonder serum of antibiotica) samen met 10 µL van pervanadate (stap 2.1) om elke 10 cm plaat (resulterend in acht platen uitdrukken verschillende versies van PD-1) (Figuur 1). Plaats de platen bij kamertemperatuur in het donker gedurende 15 minuten.
    Opmerking: De SHP2-transfected cellen (twee platen; Figuur 1) en de twee niet-transfected controle-platen zijn niet behandeld met pervanadate, aangezien deze platen als bron voor het actieve SHP2-enzym dienen zal.
  3. Wassen van de cellen met 5 mL ijskoud 1 x PBS. Herhaal deze stap tweemaal.

3. Immunoprecipitation

Opmerking: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd op ijs of bij 4 ° C.

  1. Een aanvulling op de lysis-buffermengsel (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 250 mM NaCl, 0.1% NP-40, 2 mM EDTA, 10% glycerol) met proteaseinhibitors (Los 1 tablet in 10 mL lysis-buffermengsel) en 1 mM natrium orthovanadate. 500 µL van ijskoude lysis buffer aan de cellen toevoegen en verwijderen en de cellen verzamelen van de platen onmiddellijk met behulp van een cel schraper.
    Opmerking: Het is belangrijk dat de natrium-orthovanadate alleen toevoegen aan de lysis buffer die wordt gebruikt voor de PD-1-GFP-transfected platen, omdat de SHP2-transfected platen en niet-transfected controle platen fosfatase activiteit moeten behouden.
  2. Breng de lysates in 1,5 mL koude buizen en 0,005 x g4 ° C gedurende 30 minuten draaien.
  3. Het verzamelen van de post kernen supernatant (PNS) uit de lysates, spin down de lysates gedurende 10 minuten bij 10.000 x g bij 4 ° C en breng het supernatant in nieuwe buizen. Gooi de pellet. Bewaar het supernatant van de tweede reeks van zes borden (Figuur 1) op het ijs voor latere analyse van de WVA.
  4. Voorbereiding van de anti-GFP parels voor immunoprecipitation van PD-1-GFP uit de PD-1-GFP-transfected lysates van de eerste instellen (vier platen) (Figuur 1).
    1. Om te voorkomen dat regelen voor de parels, zachtjes schud de fles met de kralen voor opening. 40 µL van de anti-GFP parels uit de Gier per elke voorwaarde verwijderen.
    2. Spin bij 500 x g gedurende 3 min bij 4 ° C en verwijder de bovendrijvende vloeistof om te wassen van de kralen.
      Opmerking: Het is belangrijk om te minimaliseren van het contact tussen de pipet kunststof tips en agarose kralen om verlies te voorkomen. Het is aanbevolen om de rand van een 200 µL tip vóór de overbrenging van de kralen aan een andere buis gesneden.
    3. Resuspendeer de kralen in 80 µL van lysis buffer (per monster).
  5. Voeg de gewassen kralen direct naar de cel lysate (PNS) uit de PD-1-GFP-uiting van cellen van de eerste reeks (vier platen) (stap 3.3). Draaien bij 0,005 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C tot immunoprecipitate het GFP-gelabelde proteïnen.
  6. Wassen van de kralen met 1 mL koude lysis-buffermengsel (zonder orthovanadate) 3 keer. Centrifugeer de buis bij 2.500 x g gedurende 10 s.
    Opmerking: Wanneer de lysis-buffermengsel toegevoegd aan de kralen, toevoegen het rechtstreeks op de kralen zonder ze aan te raken met de tips. Er is geen behoefte aan Pipetteer op en neer tijdens de wast.
  7. Even de lysate van de actieve SHP2 van de eerste reeks (één plaat; stap 3.3) verdelen en toe te voegen aan drie buizen van de gewassen PD-1-GFP-bevattende parels (de WT PD-1-GFP en de twee verschillende phosphdeficient mutaties, Y223F en Y248F). Een derde van het volume uit de lysate van de niet-transfected cellen toevoegen aan de tweede buis van de WT PD-1-GFP parels. Gooi de overige tweederde.
  8. Incubeer de kralen voor 4 uur bij 4 ° C met zachte rotatie (0,005 x g).
  9. Wassen de kralen tweemaal met 1 mL koude lysis-buffermengsel (zonder pervanadate of orthovanadate), zoals vermeld in stap 3.6.
  10. Voeg 80 µL van lysis buffer (zonder pervanadate of orthovanadate) per monster om ervoor te zorgen dat het totale volume in elke buis 100 µL (20 µL van parels) en 80 µL van lysis buffer. Meng voorzichtig en breng 50 µL van elke buis in twee verse 1,5 mL tubes.
    Opmerking: Na deze stap, zal er twee buizen gevuld met een mengsel met kralen en lysis-buffermengsel: één buis zal worden gebruikt voor het testen van de co-immunoprecipitated-SHP2 door het westelijke bevlekken, en de tweede zal worden gebruikt voor de fosfatase activiteit assay.

4. fosfatase activiteit Assay

  1. Wassen van de kralen eenmaal met fosfatase was buffer (30 mM Hepes bij pH 7.4 en 120 mM NaCl). Verwijder het supernatant volledig.
  2. Voeg 100 µL van assay buffer (30 mM Hepes bij pH 7.4, 120 mM NaCl, 5 mM DTT, 10 mM p-nitrophenylphosphate) aan de kralen en Incubeer bij 30 ° C gedurende 30 minuten onder zacht agitatie. Opmerking: Incubatietijd kan variëren, maar wachten tot de buffer omslaat naar geel op defosforylerings.
  3. Voor het verbreken van de reactie, voeg toe 50 µL van 1 M NaOH als de buffer omslaat naar geel.
  4. Spin down bij 2.500 x g gedurende 10 s en overdracht 50 µL van het supernatans dat aan twee putjes (duplicaten met 50 µL per putje) van half-ruimte in een 96-wells-plaat. Lees de absorptie bij 405 nm.
  5. Geefderesultaten relatieve optische dichtheid (OD) over de versie van de wild-type besturingselement van PD-1-GFP.

5. SHP2 Westelijke vlekkenanalyse

  1. Spin down de kralen en verwijder de bovendrijvende substantie.
  2. Voeg 20 µL van 2 x Laemmli buffer (Zie Materialen tabel) aan de kralen en kook bij 95 ° C gedurende 5 min.
  3. Meten van de eiwitconcentratie van de input controles (tweede set) met behulp van een BCA kit (Zie Materialen tabel). 30 µL van het meest verdunde monster overbrengen in een nieuwe buis. Verdun de rest van de input besturingselementen met lysis-buffermengsel aan dezelfde concentratie als de meest verdunde monster en 30 µL van elk van hen overbrengen in een nieuwe buis.
    Opmerking: Na deze stap, zal er 4 buizen met elk 30 µL aan soortgelijke proteïne concentraties, vertegenwoordigen de input controles lysates.
  4. Gelijke hoeveelheden van 2 x Laemmli buffer aan de lysates en kook bij 95 ° C gedurende 5 min. Spin down de kralen en laden van het supernatant op 4 – 20% gel SDS-pagina Tris gebaseerde toevoegen (Zie Materialen tabel) voor de westelijke analyse van de vlek. Daarnaast laden 50 µL van elk monster voor de tweede set.
  5. Blijven westelijke vlekkenanalyse volgens het protocol beschreven12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Terwijl de bijdrage van de ITSM van PD-1 om SHP2 bindend is gevestigd, is de rol van de ITIM van PD-1 is minder duidelijk. Omdat SHP2 beschikt over twee SH2 domeinen die zich aan twee opeenvolgende phosphotyrosines op PD-1 (één tyrosine in de ITSM) en een ander in de ITIM binden kunnen, we veronderstelde dat de ITSM van PD-1 SHP2 aan PD-1, verankert terwijl de ITIM van PD-1 SHP2 activiteit door het stabiliseren van vergemakkelijkt de Open conformationele staat11,14. Om dit te testen, ontwikkelden we een gecombineerde co-immunoprecipitation en enzymatische activiteit assay voor de parallelle beoordeling van receptor-enzym interacties en activering. Wild type GFP-PD-1, GFP-PD-1 Y223F (ITIM mutant), of GFP-PD-1 Y248F (ITSM mutant) werden uitgedrukt in HEK 293T cellen, die vervolgens werden behandeld met pervanadate (Figuur 1), wat leidt tot gefosforyleerd PD-1 staarten. PD-1 eiwitten werden verzameld met behulp van anti-GFP gecoat kralen. Deze parels werden gebruikt voor SHP2 co-immunoprecipitation van lysates van cellen overexpressing SHP2. De niveaus van SHP2 gebonden aan elke versie van PD-1 en zijn enzymatische activiteit werden geregistreerd.

Niet verwonderlijk dat SHP2 geen binding met de PD-1, wanneer de ITSM was gemuteerd (Y248F; Figuur 2A). Opmerkelijk is de mutant versie van de ITIM (Y223F) geremd SHP2 bindende slechts in beperkte mate (figuur 2B). Echter bleek de SHP2 fosfatase activiteit test dat de ITIM en ITSM even onmisbaar voor de enzymatische activiteit (figuur 2C). Aangezien PD-1 immunoprecipitates andere fosfatasen genaamd, naast SHP2 bevatten kan, gebruikten we een controle-voorwaarde waarin SHP2 werd niet overexpressie (figuur 2B en 2 C, blauw).

Vandaar, is een tweestaps activering model geopenbaard waarin SHP2 is gevouwen in een auto-geremd conformatie onder voorwaarden (figuur 2D, links) rusten. Na activatie van PD-1, is SHP2 aangeworven om de gefosforyleerd ITSM (figuur 2D, midden). De ITIM moet echter ook worden phosphorylated te ontvouwen van SHP2 in haar actieve conformatie (figuur 2D, rechts).

Figure 1
Figuur 1: strategie en proefomstandigheden. GFP-PD-1 WT (wild type), GFP-PD-1 Y223F (ITIM mutant), of GFP-PD-1 Y248F (ITSM mutant) werden uitgedrukt in HEK 293T cellen, die vervolgens werden behandeld met pervanadate. Gefosforyleerd GFP-PD-1 eiwitten verzameld door GFP immunoprecipitation waren gemengd met lysates uit cellen overexpressing SHP2, en de niveaus en de activiteit van SHP2 die gekoppeld is aan elke versie van PD-1 werden geregistreerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: The ITIM van PD-1 is noodzakelijk voor de activiteit van de SHP2. HEK 293T cellen werden transfected met de aangegeven versies van GFP-PD-1, gevolgd door pervanadate behandeling en immunoprecipitation met behulp van anti-GFP mAb-agarose (een). SHP2 niveaus gebonden aan geprecipiteerde GFP-PD-1 waren van gekwantificeerde (b) en onderworpen aan een fosfatase activiteit assay (c). Waarden van trok-down SHP2 waren genormaliseerd naar GFP expressie niveaus. Alle waarden zijn vouw-verandering in vergelijking met de intensiteit van geprecipiteerde SHP2 door de WT GFP-PD-1 (wild type). Fosfatase activiteit waarden zijn vouw-verandering in vergelijking met de activiteit van de co-immunoprecipitated SHP2 door de WT GFP-PD-1. RU = relatieve eenheden. (d) het model van de activering in twee stappen. Eerst SHP2 is gerekruteerd om de ITSM, en alleen dan bindt domein op het tweede SH2 tegen de ITIM van PD-1, die zich uitstrekt van het katalytische domein van SHP2 naar de volledig actief bevleesdheid. Gegevens worden gepresenteerd zoals gemiddelde ± SEM. sterretjes vertegenwoordigen aanzienlijke verschillen tussen de aangeduid door groep en de WT PD-1 (b en c): **p < 0,01, ***p < 0,001, ongepaarde t-test, n = 3. Toestemming voor het gebruik van gegevens uit Peled et al. (2018) 12 kreeg. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Receptor-enzym interacties zijn van cruciaal belang voor het intracellulaire signalering. Vele enzymen worden gerekruteerd voor receptoren via SH2 domeinen binden aan gefosforyleerd tyrosines dat van de staart van de dezelfde receptoren versieren. Echter enzymen zijn vaak gevouwen in gesloten inactief conformaties en activering vereist een conformationele verandering11 die door andere domeinen van de dezelfde receptor gemedieerde kan worden. Hier beschreven de test maatregelen de interacties tussen receptoren en enzymen, evenals de activiteit geïnduceerd door deze interacties.

We gebruikten een colorimetrische bepaling dat gebruik maakt van p-nitrophenylphosphate (pNPP) als substraat voor SHP2. pNPP is een niet-selectieve substraat en fosfor donor die door een breed aantal enzymen15wordt uitgebracht. Gefosforyleerd recombinante peptiden kunnen dienen als alternatieve substraten (bv., die vergelijkbaar is met die gebruikt in de bepaling van Malachiet groen). Deze peptiden zijn meer specifiek op het gebied van de fosfatase activiteit; echter het is duurder, en als gevolg van de gevoeligheid, kan het alleen worden uitgevoerd in fosfaatvrije oplossingen. Een andere benadering te omzeilen het gebrek aan specificiteit naar pNPP is het opnemen van een bedieningsleiding van de cel waarin de betrokken fosfatase is knock-out. In deze cellen, zal overexpressie van SHP2 de enige bron voor het enzym, en een toename van de fosfatase activiteit moet worden toegeschreven specifiek aan de overdreven uitgedrukt fosfatase. Een derde benadering is het gebruik van een gezuiverde epitoop-gelabeld SHP2 eiwit en gezuiverde epitoop-gelabeld PD-1 in plaats van de WVA aangevuld met phosphopeptides als het substraat. Een alternatief voor het gebruik van een phosphopeptide als het substraat is het gebruik van een phosphoprotein in plaats daarvan, en vervolgens de defosforylerings van het eiwit kan worden gedetecteerd door een phospho-specifieke antilichaam of phos-tag SDS-pagina.

Nog belangrijker is, kan de hier beschreven methode licht werpen op de biologie van andere interacties receptor-enzym. Bijvoorbeeld, kan het de functie van tyrosine residuen in SLAM familie receptoren, die bleken te verwaarlozen voor interacties met SHP216 maar eigenlijk nodig kunnen zijn voor activering van het zelfde enzym ontdekken. Deze methode kan ook worden toegepast op andere phosphatases evenals kinases receptor-interactie.

Hoewel deze methode relatief eenvoudig is, is het belangrijk op te merken wanneer phosphatase inhibitors moeten worden vermeden. Die zijn nodig in de eerste stap van fosforylering inductie van PD-1, maar ze moeten later worden verwijderd om te testen de fosfatase activiteit van SHP2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit project werd gefinancierd door de NIH Grants 1R01AI125640-01 en Reumatologie Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Lonza 17-516F Phosphate Buffered Saline
Microcentrifuge Eppendorf 5424-R 1.5 mL
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red Gibco 25200114
Heat Inactivated FBS Denville FB5001-H Fetal bovine serum
Penicillin / Streptomycin Fisher BP295950
DMEM high glucose without L-glutamine Lonza BE12-614F
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305
Anti-SHP2 Santa Cruz SC-280
Anti–GFP-agarose MBL D153-8
Anti-GFP Roche 118144600
Anti-Actin Santa Cruz SC-1616
HEK-293 cells ATCC CRL-1573
Orthovanadate Sigma S6508
H2O2 Sigma 216763 30%
Protease inhibitor cocktail Roche 11836170001 EDTA-free
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x) Invitrogen LC2676 Modified Laemmli buffer
4-20% Tris-Glycine Mini Gels Invitrogen XP04205BOX 15-well
Nitrocellulose membranes General Electric 10600004
NaCl Sigma S7653 Sodium chloride
HEPES Gibco 15630080 N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid
DTT Invitrogen D1532 Dithiothreitol
pNPP Sigma 20-106 p-Nitrophenyl Phosphate
NaOH Sigma S8045 Sodium hydroxide
BCA Fisher 23225 Bi Cinchoninic Acid assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17, (1), (2018).
  2. Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153, (1), 42-50 (2018).
  3. Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135, (2), 564-567 (2015).
  4. Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173, (2), 945-954 (2004).
  5. Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5, (230), 46 (2012).
  6. Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (45), (2007).
  7. Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209, (6), 1201-1217 (2012).
  8. Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355, (6332), 1428-1433 (2017).
  9. Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574, (1-3), 37-41 (2004).
  10. Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (24), 13866-13871 (2001).
  11. Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
  12. Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (3), E468-E477 (2018).
  13. Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28, (1), 25-30 (2009).
  14. Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270, (7), 2897-2900 (1995).
  15. McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 18, Unit18 18 (2010).
  16. Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166, (9), 5480-5487 (2001).
Co-immunoprecipitation Assay voor het bestuderen van functionele interacties tussen receptoren en enzymen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peled, M., Strazza, M., Mor, A. Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes. J. Vis. Exp. (139), e58433, doi:10.3791/58433 (2018).More

Peled, M., Strazza, M., Mor, A. Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes. J. Vis. Exp. (139), e58433, doi:10.3791/58433 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter