Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Co-immunoprecipitation Assay ללמוד אינטראקציות פונקציונלי בין קולטנים ואנזימים

Published: September 28, 2018 doi: 10.3791/58433

Summary

כאן, אנו מציגים עבור co-immunoprecipitation ואת וזמינותו של פעילות אנזימטי על חרוזי ללמוד בו זמנית את התרומה של חלבון ספציפי דומיינים של קולטני ממברנה פלזמה אנזים הגיוס והן פעילות אנזים פרוטוקול.

Abstract

אנזימים הקשורים קולטן הם המתווכים העיקריים של הפעלה סלולרית. אנזימים אלה מוסדרים, לפחות בחלקו, על ידי אינטראקציות גופניות עם זנבות cytoplasmic של קולטני. האינטראקציות לעיתים קרובות להתרחש דרך חלבון ספציפי תחומים, לגרום ההפעלה של האנזימים. ישנן מספר שיטות ללמוד אינטראקציות בין חלבונים. בעוד co-immunoprecipitation משמש בדרך כלל כדי ללמוד תחומים הנדרשים עבור אינטראקציות חלבון-חלבון, ישנם מבחני אין מסמך זה התרומה של תחומים ספציפיים לפעילות של אנזימים מגויסים באותו זמן. בהתאם לכך, השיטה המתוארת כאן משלב co-immunoprecipitation וזמינותו פעילות אנזימטי על חרוזי להערכה סימולטני של אינטראקציות בין חלבונים והפעלה אנזימטי המשויך. המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות את התחומים הם קריטיים עבור אינטראקציות גופניות בין חלבון לבין האנזים על התחומים שאינם חובה להפעלה מלאה של האנזים. הוכח את החשיבות של זה וזמינותו, בתור קולטן מסוים חלבון תחומים לתרום הכריכה של האנזים ועד הזנב cytoplasmic של הקולטן, בעוד תחומים אחרים נדרשים להסדיר את הפונקציה של אותו אנזים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

קולטנים קטליטי קולטן טירוזין kinases חלבונים transmembrane שבו איגוד של ליגנד חוץ-תאית גורמת פעילות אנזימטי הצד תאיים1בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. קולטנים מסוימים בעלי קולטן והן פונקציות אנזימטיות, בעוד אחרים לגייס אנזימים מסוימים כגון kinases ו- phosphatases כדי cytoplasmic הזנבות שלהם. גיוס של אנזים הזנב הקולטן ואת הפעולה קטליטי עוקבות של האנזים הזה הם שני תהליכים נפרדים שמווסתים לא תמיד על-ידי אותו חלבון תחומים2. למרבה הצער, אין כלים ספציפיים כדי להעריך את האינטראקציה ואת פעילות אנזימטי בו זמנית. וזמינותו פונקציונלי co-immunoprecipitation המתוארים כאן היא שיטה שימושית לנתח הגיוס של אנזים ועד הזנב של קולטן מהפעלה שלה. זה וזמינותו מנצל immunoprecipitation של קולטני שתייגת על ידי חרוזים מצופים נוגדן. לאחר מכן, מבוצעות assay אנזימטי פעילות והן תספיג ניתוח על חרוזים. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לחשוף אילו תחומים חלבון הכרחיות עבור אינטראקציות בין קולטנים ואנזימים (מוערך על ידי ניתוח תספיג), אילו תחומים הם חובה הפעלה מלאה של האנזימים (נמדדת בחרוז assay אנזימטי פעילות). היא משמעותית לפתח כלי לימוד הפונקציות נפרדים של אנזימים הקשורים קולטן בשל מעורבותם בפתוגנזה של מחלות אנושיות. יתר על כן, עוד יותר להבין את מנגנוני הפעולה של חלבונים אלו עשוי לסייע בעיצוב של הרומן התערבויות טיפוליות.

מוות מתוכנת-1 (PD-1) הוא קולטן המעכבת על פני השטח של תאי T והוא נדרש עבור הגבלת תגובות תא T מוגזמת. בשנים האחרונות, היו מעורבים נוגדנים anti-PD-1 בטיפול של ממאירות מספר1,2. PD-1 מצדו ומרסן פונקציות תא T רבים, לרבות הפצה, הדבקה הפרשת ציטוקינים מספר3,4,5. PD-1 הוא מקומי כדי הסינפסה חיסוניות, הממשק בין תאי T אנטיגן תאים6, איפה זה colocalizes עם תא T-קולטן (TCR)7. לאחר מכן, טירוזין phosphatase SHP2 [Src הומולוגיה 2 (SH2) תחום המכיל טירוזין phosphatase 2] הוא גויס אל זנב cytoplasmic PD-1, המוביל dephosphorylation של שאריות טירוזין מפתח בתוך TCR את מורכבות, המשויך צינתור איתות מולקולות3,4,5,8,9. זנב cytoplasmic PD-1 מכיל שני מוטיבים טירוזין immunoreceptor המבוסס על טירוזין מעכבות מוטיב (עתים), מבוסס-switch מוטיב (ITSM) של טירוזין immunoreceptor10. שני מוטיבים הם phosphorylated על PD-1 מצדו9,10. מוטגנזה מכוונת מחקרים גילו לתפקיד הראשי עבור ITSM גיוס, בניגוד עתים, שתפקידו PD-1 איתות ומתפקדים לא ברור SHP24.

SHP2 מאמצת או מסוגרת (מקופל), עכבות קונפורמציה או פתוח (מורחב), פעיל קונפורמציה11. לא הובהר כבר התרומה של כל תחום הזנב של PD-1 SHP2 מחייב או הפעלה. כדי לענות על שאלה זו, פיתחנו וזמינותו המאפשרת בדיקה מקבילה של הגיוס של SHP2 אל זנב PD-1 ושלה פעילות12. אנחנו מועסקים co-immunoprecipitation ואת וזמינותו פעילות בחרוז פוספטאז לבחון את האינטראקציה ואת פעילות אנזימטי במקביל. שימוש assay הזה, אנו מראים כי ITSM של PD-1 מספיקה לגייס SHP2 אל זנב PD-1, בעוד עתים של PD-1 יש צורך להרחיב ולהפעיל את האנזים באופן מלא.

ישנם רצפטורים רבים שיש להם מספר תחומים סמוכים באזור הזנבות cytoplasmic שלהם. וזמינותו פונקציונלי co-immunoprecipitation יכול לחשוף את התפקיד של תחומים ספציפיים הנחוצים עבור גיוס חלבון או הפעלת אנזימטיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. תרביות תאים תאים

  1. זרע תאים 293T HEK 10 ס מ 12 לוחות (5 x 106 תאים לכל צלחת) יום לפני תרביות תאים (איור 1). לבצע ספירת תאים באמצעות hemocytometer. לשימוש בכל צלחת, 10 מ של DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.
  2. ברגע שהתאים 80-90% confluent, transfect 5 צלחות HEK 293T באמצעות ריאגנט ליפיד המבוסס על תרביות תאים עם אחד פלסמידים הבאים: וקטור לבטא SHP2, וקטור PD-1-GFP-ביטוי [גירסה מסוג בר (WT) של PD-1], גירסה מוטציה-עתים (Y223F ) של וקטור PD-1-GFP-לבטא, מוטציה-ITSM גירסה (Y248F) של וקטור PD-1-GFP-לבטא (איור 1).
    הערה: שתי צלחות להיות transfected עם וקטור WT PD-1-GFP-לבטא. לוח נוסף אחד ישמש פקד תאים שאינם transfected (איור 1).
  3. לבצע תרביות של תאים לפי הפרוטוקול של היצרן עבור תאים חסיד צלחות 10 ס מ.
    הערה: בגירסאות מוטציה של PD-1, טירוזין (Y) בכל מוטיב הוחלף על ידי פנילאלנין (נ) זה לא יכול להיות phosphorylated.
  4. Transfect ערכה זהה שניה של חמישה לוחות, לוח נוסף אחד משמש פקד ללא transfected לשקילת כמות חלבון ביטוי [קלט; ידוע גם lysate התא כולו (WCL)] לפני immunoprecipitation (איור 1).
  5. דגירה התאים transfected 48 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מגשים תרביות רקמה.
    הערה: כדי להבטיח שאת תקנים בהצלחה אירעה, לבחון את התאים עבור הביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

2. קידום זרחון בתאים Transfected

  1. בעקבות דגירה, להכין טרי pervanadate על ידי ערבוב 50 µL של נתרן-orthovanadate (במלאי 100 מ מ) עם 50 µL של 30% H2O2.
    הערה: צריך לשנות התערובת לתוך צבע צהבהב. Pervanadate הוא מעכב פוספטאז תא חדיר המקדם זרחון טירוזין שאריות13. זה assay, הוא משמש כדי לגרום robustly זרחון של זנבות PD-1.
  2. כדי phosphorylate את גרסאות מתויג PD-1, מסיר את המדיה מתאי PD-1-GFP-transfected ולהוסיף 10 מ"ל של DMEM רגיל (ללא סרום או אנטיביוטיקה) יחד עם 10 µL של pervanadate (שלב 2.1) כל צלחת 10 ס מ (וכתוצאה שמונה צלחות לבטא גרסאות שונות של PD-1) (איור 1). מקם את הצלחות בטמפרטורת החדר בחושך למשך 15 דקות.
    הערה: SHP2 transfected התאים (שתי צלחות; איור 1) שני לוחות בקרה שאינם transfected שאינם מטופלים עם pervanadate, מאז הצלחות האלה ישמש מקור האנזים SHP2 פעיל.
  3. לשטוף את התאים עם 5 מ של PBS קר כקרח 1 x. חזור על שלב זה פעמיים.

3. Immunoprecipitation

הערה: השלבים הבאים יש לבצעו על קרח או ב- 4 מעלות צלזיוס.

  1. תוספת למאגר פירוק (50 מ מ טריס-HCl ב pH 7.2, 250 מ מ NaCl, 0.1% NP-40, 2 מ מ EDTA, 10% גליצרול) עם מעכבי פרוטאז (להמיס 1 טבלית 10 מ"ל של פירוק מאגר) ועם orthovanadate נתרן 1 מ מ. להוסיף 500 µL של המאגר הקר פירוק תאים, להסיר ולאסוף את התאים מן הלוחות מיידי באמצעות המגרד של התא.
    הערה: חשוב להוסיף את orthovanadate נתרן רק למאגר פירוק שישמש עבור לוחות PD-1-GFP-transfected, מאז הצלחות SHP2 transfected ואת לוחות בקרה שאינם transfected חייב לשמור על פעילות פוספטאז.
  2. להעביר את lysates לתוך צינורות קר 1.5 mL ולסובב אותם ב 0.005 x g, 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. איסוף גרעינים פוסט supernatant (מערכת העצבים ההיקפית) lysates, ספין למטה lysates 10 דקות ב x 10,000 g ב 4 ° C ולהעביר את supernatants לתוך צינורות חדשים. להתעלם בגדר. אחסן את supernatants של הסט השני של שש צלחות (איור 1) על הקרח לניתוח WCL בשלב מאוחר יותר.
  4. הכנה של חרוזים אנטי-GFP immunoprecipitation של PD-1-GFP מן lysates PD-1-GFP-transfected הראשונים להגדיר (ארבעה לוחות) (איור 1).
    1. כדי למנוע שיקוע של החרוזים, לנער בעדינות את הבקבוק עם החרוזים לפני הפתיחה. הסר µL 40 של חרוזים אנטי-GFP slurry לפי כל תנאי.
    2. ספין-x 500 g למשך 3 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע לשטוף את החרוזים.
      הערה: חשוב למזער את הקשר בין טיפים פלסטיק פיפטה חרוזים agarose למניעת אובדן. מומלץ לחתוך את הקצה של טיפ µL 200 לפני העברת את החרוזים צינור אחר.
    3. Resuspend את החרוזים ב- 80 µL פירוק מאגר (לכל דגימה).
  5. הוסף את שטף החרוזים ישירות לתא lysate (מערכת העצבים ההיקפית) מתאי PD-1-GFP-לבטא הסט הראשון (ארבעה לוחות) (שלב 3.3). סובב ב x 0.005 גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C immunoprecipitate ה-GFP מתויג חלבונים.
  6. לשטוף את החרוזים עם 1 מ"ל של פירוק קר מאגר (ללא orthovanadate) 3 פעמים. Centrifuge את הצינור ב x 2,500 g 10 s.
    הערה: בעת הוספת המאגר פירוק החרוזים, הוסף אותו ישירות על גבי החרוזים מבלי לגעת בהם עם העצות. יש צורך פיפטה למעלה ולמטה במהלך שוטף.
  7. במידה שווה לחלק את lysate של SHP2 הפעיל מהסט הראשון (לוח אחד; שלב 3.3) ולהוסיף אותו שלושה צינורות של חרוזים PD-1-GFP-המכיל שטף (את WT PD-1-GFP, שתי מוטציות שונות phosphdeficient, Y223F ו- Y248F). להוסיף שליש אחד של אמצעי האחסון של lysate של תאים שאינם transfected הצינור השני של חרוזים WT PD-1-GFP. להתעלם הנותרים של שני שלישים.
  8. דגירה החרוזים במשך 4 שעות ב 4 ° C עם סיבוב עדין (0.005 x g).
  9. לשטוף את החרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של פירוק קר מאגר (ללא pervanadate או orthovanadate), כפי שדווח בשלב 3.6.
  10. מוסיפים 80 µL מאגר פירוק (ללא pervanadate או orthovanadate) לכל דגימה שהייתך הנפח הכולל של כל שפופרת 100 µL (20 µL של חרוזים) ו- 80 µL מאגר פירוק. לערבב בעדינות, להעביר 50 µL מהצינור כל שני צינורות mL 1.5 טריים.
    הערה: לאחר שלב זה, יהיו שני צינורות ממולא בתערובת המכילה חרוזים ומאגר פירוק: שפופרת אחת תשמש עבור בדיקות של SHP2 co-immunoprecipitated על ידי סופג המערבי, ואת השני ישמש עבור פעילות פוספטאז וזמינותו.

4. פוספטאז פעילות Assay

  1. לשטוף את החרוזים פעם אחת עם מאגר שטיפת פוספטאז (30 מ מ Hepes pH 7.4 ו- 120 מ"מ NaCl). הסר את תגובת שיקוע לחלוטין.
  2. להוסיף 100 µL assay מאגר (30 מ מ Hepes ב- pH 7.4, 120 מ"מ NaCl, 5 מ מ DTT, 10 מ מ p-nitrophenylphosphate) החרוזים, דגירה ב 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תחת עצבנות עדין. הערה: זמן הדגירה עלול להשתנות, אלא להמתין עד המאגר לצהוב על dephosphorylation.
  3. לסיום התגובה, להוסיף 50 µL של 1 M NaOH כאשר המאגר לצהוב.
  4. ספין למטה ב 2,500 x g עבור 10 s והעברת 50 µL של תגובת שיקוע על שתי בארות (כפילות עם µL 50 לכל טוב) של חצי-אזור בצלחת 96-ובכן. לקרוא את ספיגת-405 ננומטר.
  5. לבטא את התוצאות כמו צפיפות אופטית היחסי (OD) על פני גירסת פראי-סוג הבקרה PD-1-GFP.

5. SHP2 תספיג ניתוח

  1. ספין למטה החרוזים ולהסיר את תגובת שיקוע.
  2. הוסף 20 µL מאגר x Laemmli 2 (ראה טבלת חומרים) חרוזים, לרתיחה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  3. למדוד את ריכוז חלבון הקלט פקדים (סט שני) באמצעות BCA קיט (ראה טבלת חומרים). µL 30 המדגם מדולל ביותר להעביר צינור חדש. לדלל את שאר הפקדים קלט עם פירוק מאגר לריכוז אותו כמו הדגימה מדולל ביותר ולאחר להעביר 30 µL של כל אחד מהם צינור חדש.
    הערה: לאחר שלב זה, יהיו 4 צינורות עם 30 µL כל אחד, בריכוזים חלבון דומה, המייצג את הקלט שולטת lysates.
  4. להוסיף נפחים שווים של מאגר x Laemmli 2 ה lysates ל לרתיחה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דק ספין למטה את החרוזים ולטעון את תגובת שיקוע על 4 – 20% ג'ל המבוסס על טריס מרחביות-דף (ראה טבלת חומרים) המערבי כתם ניתוח. בנוסף, טען 50 µL מ כל דגימה של הסט השני.
  5. המשך ניתוח תספיג לפי הפרוטוקול שתואר קודם לכן12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בעוד התרומה של ITSM PD-1 עד SHP2 האיגוד נוצר, התפקיד של עתים PD-1 הוא פחות ברור. מכיוון SHP2 יש שני תחומים SH2 שאינם יכולים לאגד שני phosphotyrosines רציפים ב- PD-1 (אחד טירוזין ב ITSM) ובחודש עתים, שיערנו כי ITSM של PD-1 עוגנים SHP2 ל- PD-1, בעוד עתים של PD-1 מקלה על פעילות SHP2 על-ידי ייצוב שלה פתח את המדינה הסתגלותי11,14. כדי לבדוק את זה, פיתחנו co-immunoprecipitation בשילוב עם assay אנזימטי פעילות להערכה מקבילים של קולטן-אנזים אינטראקציות והפעלה. פראי סוג GFP-PD-1, Y223F GFP-PD-1 (עתים מוטציה), או ה-GFP-PD-1 Y248F (מוטציה ITSM) שבאו לידי ביטוי בתאים HEK 293T טופלו עם pervanadate (איור 1), המוביל אל phosphorylated זנבות PD-1. PD-1 חלבונים נאספו באמצעות אנטי-GFP מצופה חרוזים. אלה חרוזים שימשו SHP2 co-immunoprecipitation של lysates של תאים overexpressing SHP2. הרמות של SHP2 חייב כל גירסה של PD-1 ופעילותה אנזימטי נרשמו.

באופן לא מפתיע, SHP2 נכשלה לאגד PD-1 כאשר ITSM היתה מוטציה (Y248F; איור 2A). למרבה הפלא, גירסת מוטציה עתים (Y223F) מעוכבים SHP2 מחייב רק במידה מוגבלת (איור 2B). למרות זאת, וזמינותו פעילות פוספטאז SHP2 גילה כי עתים של ITSM היו הכרחית עבור הפעילות האנזימטית מתרחשת (איור 2C). מאז PD-1 immunoprecipitates עשויים להכיל phosphatases אחרים, בנוסף SHP2, השתמשנו תנאי הבקרה (איור 2B ו- 2 C, כחול) שבו SHP2 לא היה overexpressed.

לכן, מודל הפעלת שני שלבים מתגלה בו SHP2 מקופלת של קונפורמציה עכבות אוטומטית תחת נח תנאים (איור דו-ממדי, משמאל). בעת הפעלה של PD-1, SHP2 הוא מגויס ITSM phosphorylated (איור דו-ממדי, התיכון). עם זאת, עליך גם phosphorylated את עתים להתגלות SHP2 לתוך שלו קונפורמציה פעיל (איור דו-ממדי, נכון).

Figure 1
איור 1: אסטרטגיה ותנאים ניסיוני. WT GFP-PD-1 (סוג בר), ה-GFP-PD-1 Y223F (עתים מוטציה), או ה-GFP-PD-1 Y248F (מוטציה ITSM) שבאו לידי ביטוי בתאים HEK 293T טופלו עם pervanadate. Phosphorylated חלבונים GFP-PD-1 שנאסף על-ידי GFP immunoprecipitation היו מעורבבים עם lysates מתאי overexpressing SHP2, רמות של פעילות של SHP2 חייב כל גירסה של PD-1 נרשמו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: עתים של PD-1 הוא הכרחי עבור פעילות SHP2. תאים 293T HEK היו transfected עם הגירסאות המצוין של GFP-PD-1, ואחריו טיפול pervanadate, immunoprecipitation באמצעות אנטי-GFP mAb-agarose (). רמות SHP2 קשור זירז GFP-PD-1 כימות (b), נתון assay פעילות פוספטאז (c). ערכי משך-למטה SHP2 היו מנורמל רמות ביטוי GFP. כל הערכים הם מקפלים-שינוי לעומת עוצמת זירז SHP2 על ידי ה WT GFP-PD-1 (סוג הפרוע). ערכים פעילות פוספטאז הם מקפלים-שינוי לעומת הפעילות של co-immunoprecipitated SHP2 על ידי ה WT GFP-PD-1. RU = יחידות היחסי. (ד) מודל הפעלת שני שלבים. ראשית, SHP2 הוא מגויס ITSM, רק אז התחום השני SH2 לאגד עתים של PD-1, אשר מרחיב את התחום קטליטי של SHP2 בו קונפורמציה פעיל מלא. הנתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± ב- SEM כוכביות מייצגים הבדלים משמעותיים בין הקבוצה denoted ה WT PD-1 (b ו- c): * *p < 0.01, * * *p < 0.001, אינטראקצית מבחן t, n = 3. הרשאה לשימוש נתונים מ. פלד ואח (2018) 12 הוענק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

קולטן-אנזים אינטראקציות מכריעים עבור מערכת אזעקה תאיים. אנזימים רבים גייסו לקולטנים באמצעות תחומים SH2 מחייב את tyrosines phosphorylated המעטרים זנבות של קולטני אותו. עם זאת, אנזימים מקופלים לעתים קרובות לתוך הייצורים החיים לא פעיל סגור, ודורש הפעלה לשינוי הסתגלותי11 זה יכול להיות מתווכת על-ידי מחשבים אחרות של הקולטן באותו. וזמינותו המתוארים כאן אמצעים האינטראקציות בין רצפטורים, אנזימים, כמו גם הפעילות הנגרמת על ידי אינטראקציות אלה.

השתמשנו assay ערכי צבע מוחלטים מנצל p-nitrophenylphosphate (pNPP) כמו המצע של SHP2. pNPP הוא לא בררניים המצע, פוספור תורם הוא שוחרר על-ידי מספר רחב של אנזימים15. פפטידים רקומביננטי phosphorylated יכול לשמש סובסטרטים אלטרנטיביים (למשל., אלה דומה אלה המשמשים וזמינותו מלכיט ירוק). פפטידים אלה הם ספציפיים יותר מבחינת פעילות פוספטאז; עם זאת, זה costlier, בשל הרגישות שלה, זה רק יכול לבצע בפתרונות פירות טריים. גישה אחרת לעקוף את חוסר ירידה לפרטים לכיוון pNPP היא לכלול קו תא שליטה בו פוספטאז המדובר הוא הפיל. בתאים אלה, ביטוי של SHP2 יהיה רק מקור האנזים, כל גידול בפעילות פוספטאז צריך לייחס באופן ספציפי פוספטאז ביטוי יתר. גישה שלישית היא להשתמש א מטוהרים מתויג epitope SHP2 חלבון מטוהרים מתויג epitope PD-1 במקום WCL בתוספת phosphopeptides כמו המצע. קיימת חלופה לשימוש של phosphopeptide כמו המצע היא להשתמש phosphoprotein במקום זאת, ואז dephosphorylation של החלבון עשוי להתגלות על ידי נוגדנים ספציפיים פוספו או תג phos מרחביות-דף.

חשוב לציין, השיטה המתוארת כאן יכול לשפוך אור על הביולוגיה של האינטראקציות האחרות קולטן-אנזים. לדוגמה, זה יכול לחשוף את הפונקציה של שאריות רצפטורים משפחה סלאם, אשר נמצאו להיות זניח עבור אינטראקציות עם SHP216 אבל בפועל עשוי להיות נחוץ לצורך הפעלה של האנזים טירוזין. בשיטה זו ניתן להחיל גם phosphatases אחרים, כמו גם kinases אינטראקציה-קולטן.

בעוד ששיטה זו היא פשוטה יחסית, חשוב לשים לב כאשר מעכבי פוספטאז להימנע. אלה הכרחי בשלב הראשוני של זרחון אינדוקציה של PD-1, אבל מאוחר יותר הם יש להסיר על מנת לבחון את פעילות פוספטאז SHP2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

הפרויקט מומן על ידי מענקים NIH 1R01AI125640-01 ושל קרן מחקר ראומטולוגיה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Lonza 17-516F Phosphate Buffered Saline
Microcentrifuge Eppendorf 5424-R 1.5 mL
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red Gibco 25200114
Heat Inactivated FBS Denville FB5001-H Fetal bovine serum
Penicillin / Streptomycin Fisher BP295950
DMEM high glucose without L-glutamine Lonza BE12-614F
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305
Anti-SHP2 Santa Cruz SC-280
Anti–GFP-agarose MBL D153-8
Anti-GFP Roche 118144600
Anti-Actin Santa Cruz SC-1616
HEK-293 cells ATCC CRL-1573
Orthovanadate Sigma S6508
H2O2 Sigma 216763 30%
Protease inhibitor cocktail Roche 11836170001 EDTA-free
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x) Invitrogen LC2676 Modified Laemmli buffer
4-20% Tris-Glycine Mini Gels Invitrogen XP04205BOX 15-well
Nitrocellulose membranes General Electric 10600004
NaCl Sigma S7653 Sodium chloride
HEPES Gibco 15630080 N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid
DTT Invitrogen D1532 Dithiothreitol
pNPP Sigma 20-106 p-Nitrophenyl Phosphate
NaOH Sigma S8045 Sodium hydroxide
BCA Fisher 23225 Bi Cinchoninic Acid assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17, (1), (2018).
  2. Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153, (1), 42-50 (2018).
  3. Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135, (2), 564-567 (2015).
  4. Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173, (2), 945-954 (2004).
  5. Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5, (230), 46 (2012).
  6. Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (45), (2007).
  7. Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209, (6), 1201-1217 (2012).
  8. Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355, (6332), 1428-1433 (2017).
  9. Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574, (1-3), 37-41 (2004).
  10. Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (24), 13866-13871 (2001).
  11. Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
  12. Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (3), E468-E477 (2018).
  13. Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28, (1), 25-30 (2009).
  14. Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270, (7), 2897-2900 (1995).
  15. McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 18, Unit18 18 (2010).
  16. Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166, (9), 5480-5487 (2001).
Co-immunoprecipitation Assay ללמוד אינטראקציות פונקציונלי בין קולטנים ואנזימים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peled, M., Strazza, M., Mor, A. Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes. J. Vis. Exp. (139), e58433, doi:10.3791/58433 (2018).More

Peled, M., Strazza, M., Mor, A. Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes. J. Vis. Exp. (139), e58433, doi:10.3791/58433 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter