Summary
ここでは、co 免疫沈降法及び酵素採用し酵素活性細胞膜受容体の特定のタンパク質ドメインの貢献を同時に勉強するビーズの酵素活性測定のためのプロトコルを提案する.
Abstract
受容器準の酵素は、細胞活性の主要な仲介人です。これらの酵素によって規制されて、少なくとも部分では、受容体の細胞質尾の物理的な相互作用。相互作用はしばしば特定の蛋白質のドメインを介して発生して酵素の活性化に 。タンパク質間相互作用を検討するいくつかの方法があります。Co 免疫沈降一般的に蛋白質蛋白質の相互作用に必要なドメインの研究に使われるがない試金同時に募集された酵素の活動に特定のドメインの寄与文書。したがって、ここで説明する方法は、co 免疫沈降法及び相互作用タンパク質と関連酵素活性の同時測定のためのビードの酵素活性アッセイを組み合わせたものです。このプロトコルの目的は、タンパク質と酵素の酵素の完全な活性化のための義務になっているドメインとの物理的相互作用にとって重要なドメインを識別するためにです。この試金の重要性を実証、他のドメインが同じ酵素の機能を調節する必要の酵素、受容体の細胞質テールへのバインディングにタンパク質ドメイン特定の受容体として貢献。
Introduction
触媒受容体と受容体チロシンキナーゼは、細胞外リガンドの結合が細胞内の側面1に酵素活性を引き起こす膜貫通蛋白質です。いくつかの受容体キナーゼや細胞質尾にホスファターゼなど特定の酵素を採用他、受容体と酵素の機能の両方を所有しています。受容体の尾とこの酵素の後続の触媒作用する酵素の募集は、同じタンパク質ドメイン2によって常に規制されていない、2 つの独立したプロセスです。残念ながら、同時に相互作用と酵素活性の両方を評価するために特定のツールはございません。ここで説明した機能 co 免疫沈降法ですその活性化から受容体の尾部に酵素の採用を分析する有用な方法です。この試金は、抗体をコートしたビーズでタグ受容体の免疫沈降を利用しています。その後、酵素活性アッセイとビーズの西部のしみの分析の両方が実行されます。タンパク質ドメインが受容体と酵素 (西部のしみの分析による評価) 間の相互作用の必要を明らかにするこのメソッドの全体的な目標は、どのドメインが (上ビーズを用いて酵素の完全な活性化のための義務酵素活性アッセイ)。ひと疾患の病態に関与による受容体酵素の別の関数を勉強するためのツールを開発する意義は大きい。また、さらにこれらの蛋白質の作用のメカニズムを理解することは、新しい治療的介入の設計を助けるかもしれない。
プログラムされた死-1 (PD-1) 表面 T 細胞の抑制性受容体であり過度の T 細胞の応答を制限するために必要です。近年、抗 PD 1 抗体は複数の悪性腫瘍1,2の治療に関与しています。PD 1 結紮は、増殖、接着、複数サイトカイン3,4、5の分泌など、多数の T 細胞機能を抑制します。PD 1 は免疫学のシナプスでは、T 細胞と抗原提示細胞の6日間、それは T 細胞受容体 (TCR)7colocalizes インターフェイスにローカライズされます。その後、チロシンホスファターゼ SHP2 [Src ホモロジー 2 (SH2) チロシン脱燐酸化酵素 2 を含むドメイン] PD 1、複雑な TCR とそれに関連付けられたキーのチロシン残基, 近位の dephosphorylation につながる細胞質テールを募集していますシグナリング分子3,4,5,8,9。PD 1 の細胞質テールには、2 つのチロシン モチーフ、細胞チロシン抑制モチーフ (ITIM) と細胞のチロシン基スイッチ モチーフ (ITSM)10が含まれています。両方のモチーフは PD 1 結紮9,10時にリン酸化します。部位特異的変異は、SHP2 PD 1 シグナリングとその機能の役割は不明、ITIM のではなく、募集4it サービスマネジメントの主な役割を明らかにしました。
SHP2 は、どちらか閉じた (折り返し) を採用、構造またはオープン (拡張) 活性コンフォメーション11禁じられます。PD 1 各テイル ドメイン SHP2 バインディングまたは活性化の貢献はまだ解明されていません。この質問に答える、PD 1 とその活動の12の尾に SHP2 の募集の並列テストを可能にするアッセイを開発しました。Co 免疫沈降法と並列で相互作用と酵素活性の両方をテストするビードのホスファターゼ活性の測定法を採用しました。この試金を使用して、PD 1 it サービスマネジメントが PD 1 ITIM が完全に拡張し、酵素を有効に必要ですが、PD 1 尾に SHP2 を募集するのに十分であることを示します。
いくつかの隣接するドメインは細胞質尾で多くの受容体があります。機能 co を免疫沈降法は、蛋白質の募集や酵素の活性化に必要な特定のドメインの役割を検出できます。
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Protocol
1. 細胞のトランスフェクション
- (図 1) のトランスフェクション前日 12 10 cm プレート (プレートごと 5 x 10 の6セル) に HEK 293 t 細胞を播きます。診断を使用してセルのカウントを実行します。各プレート 10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを DMEM の 10 mL を使用します。5% CO2の 37 ° C でセルを孵化させなさい。
- セルが 80-90% の合流と、transfect 脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いた次のプラスミッドの 1 つ 5 の HEK 293 t プレート: SHP2 表現のベクトル、PD 1 GFP 表現のベクトル [PD 1 の野生型 (WT) 版]、ITIM 変異バージョン (Y223F) の PD 1 GFP 発現ベクターと ITSM 変異バージョン (Y248F) の PD 1 GFP 表現のベクトル (図 1)。
注: 2 つのプレートは WT PD-1-gfp 発現するベクターを使用して導入されます。1 つの追加プレートは非トランスフェクト細胞制御 (図 1) となります。 - 10 cm のプレートに付着性のセルの製造元のプロトコルに従ってトランスフェクションを実行します。
注: PD 1 の変異のバージョン、各モチーフのチロシン (Y) はリン酸化ことはできませんフェニルアラニン (F) に置き換えられました。 - 5 つのプレートと免疫沈降法 (図 1) の前に表現された蛋白質量 [入力; として知られている全細胞ライセート (WCL)] の測定のための非 transfected 制御として 1 つの追加プレートの 2 番目の同じセットを transfect します。
- 37 ° C で 48 時間の培養のインキュベーターで 5% CO2 transfected セルを孵化させなさい。
注: そのトランスフェクションが正常に行われたことを確認するには、蛍光顕微鏡を用いた GFP 発現細胞を調べます。
2. Transfected セルのリン酸化の推進
- インキュベーション、以下 30% H2O2の 50 μ L でナトリウム-バナジン (100 mM 在庫) からの 50 μ L を混合することによって新鮮な pervanadate を準備します。
注: 混合物は黄色がかった色に変更する必要があります。Pervanadate は13チロシン残基のリン酸化を促進する細胞膜透過性のホスファターゼ阻害剤です。このアッセイでは、ロバスト PD 1 の尾のリン酸化を誘導するものです。 - PD 1 のタグ付きバージョンをリン酸化するには、PD 1 GFP transfected セルからメディアを削除して (表現する 8 つのプレートで、その結果各 10 cm プレートに一緒に pervanadate (ステップ 2.1) の 10 μ L (血清または抗生物質) なしプレーン DMEM の 10 mL を追加PD 1 の異なるバージョン) (図 1)。室温で 15 分間暗いプレートを配置します。
注: SHP2 transfected セル (2 つの版;図 1)2 つの非 transfected 制御板は pervanadate と扱われないのでこれらのプレートは、SHP2 酵素のソースとなります。 - 5 ml の氷冷 1x PBS のセルを洗浄します。この手順を 2 回繰り返します。
3. 免疫沈降
注: または 4 ° C で氷の上に次の手順が実行する必要があります。
- 換散バッファー (50 mM トリス塩酸で pH 7.2, 250 mM の NaCl、0.1 %np-40、2 ミリメートルの EDTA、10% グリセロール) プロテアーゼ阻害剤 (10 mL の溶解バッファーに溶解 1 タブレット) と 1 mM ナトリウム バナジンを補足します。セルに冷たい換散バッファーの 500 μ L を追加し削除し、細胞スクレーパーを使って直ちにプレートから細胞を収集します。
注: SHP2 transfected プレートおよび非 transfected 制御板はホスファターゼ活性を保持する必要がありますので、PD 1 GFP 導入板に適用する換散バッファーにのみナトリウム バナジンを追加することが重要です。 - 1.5 mL の冷たい管に lysates を転送し、0.005 × g、4 ° C、30 分でそれらを回転させます。
- Lysates からポスト核上清 (PNS) を収集、4 ° C で 10,000 x gで 10 分間の lysates スピンダウンし、培養上清を新しいチューブに移します。ペレットを破棄します。WCL 分析するため氷の上六つのプレート (図 1) の 2 番目のセットの培養上清を保存します。
-
最初の PD 1 GFP 導入 lysates から PD 1 GFP の免疫沈降用抗 GFP ビーズの作製セット (4 版) (図 1)。
- ビーズの沈降を防ぐため、開く前にビーズでボトルを軽く振る。各条件ごとのスラリーから抗 GFP ビーズ 40 μ L を削除します。
- 4 ° C で 3 分間 500 x gでスピンして、ビーズを洗浄する上清を除去します。
注: ピペット チップと損失を防ぐためのアガロース ビーズとの接触を最小限に抑えるために重要です。ビーズを別のチューブに移すまでに 200 μ L チップのエッジをカットすることをお勧めします。 - (サンプルごと) 換散バッファーの 80 μ L でビーズを再懸濁します。
- ビーズを追加、洗浄細胞ライセートに直接 (PNS) (4 版) の最初のセットの PD 1 GFP 発現細胞から (ステップ 3.3)。Immunoprecipitate GFP 付けられた蛋白質への 4 ° C で 30 分の 0.005 x gで回転します。
- 3 回 1 ml (バナジン) なしの冷たい換散バッファーのビードを洗います。10 2,500 x gでチューブを遠心分離機 s。
注: 換散バッファーをビーズに追加すると、追加ビーズに直接のヒントとそれらに触れることがなく。ピペットの洗浄中に上下する必要はありません。 - 同様に最初のセット (1 つのプレート; ステップ 3.3) からアクティブ SHP2 のライセートを分けるし、洗浄の PD 1 GFP 含有ビーズ (WT の PD 1 GFP と Y223F と Y248F は 2 つの異なる phosphdeficient 変異) の 3 つの管を追加します。WT PD-1-GFP ビーズの 2 番目の管に非トランスフェクション細胞ライセートからボリュームの 3 分の 1 を追加します。3 分の 2 を破棄します。
- 緩やかな回転 (0.005 x g) と 4 ° C で 4 h 用ビーズをインキュベートします。
- 手順 3.6 で報告された (pervanadate、バナジン有無)、冷たい換散バッファーの 1 つの mL で 2 回ビーズを洗います。
- サンプルを確実に各チューブの総量 (ビーズの 20 μ L) および換散バッファーの 80 μ L、100 μ L あたり (pervanadate バナジン有無) 換散バッファーの 80 μ L を追加します。穏やかに混合し、2 つの新しい 1.5 mL チューブに各チューブから 50 μ L を転送します。
注: この手順では、以下があるビーズと換散バッファーを含む混合物で満たされた 2 つの管: 1 つの管はウェスタンブロット法で co 沈澱 SHP2 をテストに使用する、2 番目はホスファターゼ活性測定法に使用されます。
4. ホスファターゼ活性測定法
- 一度脱燐酸化酵素洗浄バッファー (pH 7.4 と 120 mM の NaCl で 30 mM Hepes) とビーズを洗浄します。上清を完全に削除します。
- 、ビーズにアッセイバッファー (30 mM Hepes ph 7.4 では、120 mM の NaCl、5 mM 10 mM p nitrophenylphosphate DTT) の 100 μ L を追加し、30 ° C、穏やかな動揺の下で 30 分インキュベートします。注: インキュベーション時間が変わるが、バッファー脱燐酸化時に黄色に変わるまで待ちます。
- 反応を終了すると、バッファーが黄色に変わったら 1 M NaOH の 50 μ L を追加します。
- 2,500 x g半部の 2 つの井戸 (50 μ L/ウェルと重複) に清の 10 s と転送 50 μ L でスピンダウン 96 ウェル プレートで。405 で吸光度を読み nm。
- 相対的な光学濃度 (OD)、PD 1 GFP のコントロール野生型のバージョン以上結果を表現します。
5. SHP2 西部のしみの分析
- ビーズ スピンダウンし、上清を削除します。
- 2 x Laemmli バッファーの 20 μ L を追加 (材料表参照) ビーズと 95 ° C、5 分で沸騰します。
- 入力のタンパク質濃度の測定 (2) を使用して設定、BCA コントロール キット (材料表を参照してください)。最も希釈サンプルの 30 μ L を新しいチューブに転送します。最も希薄サンプルとして同じ濃度に換散バッファーの入力コントロールの残りの部分を希釈し、それらのそれぞれから 30 μ L を新しいチューブに転送。
注: この手順では、次がありますそれぞれ 30 μ L で 4 管同様のタンパク質濃度の lysates を制御入力を表します。 - Lysates と 95 ° c で 5 分間スピン沸騰 2 x Laemmli バッファーの平等なボリューム ダウン ビーズと 4-20 %sds ページ トリス ベースのジェルに上澄みをロードを追加 (材料表参照) 西部のしみの分析。また、2 番目のセットの各サンプルから 50 μ L を読み込みます。
- 西部のしみのプロトコルに従って解析前述12を続行します。
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Representative Results
SHP2 バインドに PD 1 の ITSM の貢献が確立されている間、ロール PD 1 ITIM は不明瞭です。PD 1 it サービスマネジメントが PD - 1、SHP2 を固定する PD 1 ITIM の安定化による SHP2 活動を容易にしながら我々 の仮説 SHP2 は PD-1 (1 つチロシン過剰投与、ITSM の) と、ITIM の別の 2 つのシーケンシャル phosphotyrosines にバインドすることができます 2 つの SH2 ドメインがあるので、構造状態11,14を開きます。これをテストするには、結合された co-免疫沈降法及び受容体酵素の相互作用と活性化の並列評価のための酵素活性測定法を開発しました。野生型 GFP-PD-1、GFP PD 1 Y223F (ITIM 変異)、または GFP PD 1 Y248F (ITSM 変異) pervanadate (図 1)、リン酸化の PD 1 尾に至ると扱われた後 HEK 293 t 細胞に表現されました。PD 1 蛋白質は、抗 GFP コーティングされたビーズを使用して収集されました。これらのビードは、SHP2 co - SHP2 を過剰発現細胞の lysates から免疫沈降に使用されました。SHP2 行きの各バージョンの PD 1 およびその酵素活性のレベルを記録しました。
当然、SHP2 は、ITSM が変異したとき PD 1 にバインドする失敗 (Y248F;図 2 a)。著しく、ITIM (Y223F) の変異のバージョンは、SHP2 バインディングのみに限られた範囲内 (図 2 b) を阻害しました。それにもかかわらず、ITIM と ITSM 酵素活性 (図 2) の均等に不可欠であった SHP2 ホスファターゼ活性が明らかに。PD 1 免疫沈降物 SHP2、に加えて、他のホスファターゼを含めることができますので、SHP2 はない過剰発現制御条件 (図 2 bおよび2 C、青) を使用しました。
したがって、2 段階活性化モデルは、SHP2 安静時の条件 (図 2 D、左) の自動抑制構造に折られている明らかです。PD 1 の活性化 (図 2 D中間) のリン酸化の ITSM に SHP2 を募集しています。ただし、ITIM もその活性コンフォメーション (図 2 D右) に SHP2 を展開するリン酸化される必要があります。
図 1: 実験条件と戦略します。GFP PD 1 WT (野生型)、GFP PD 1 Y223F (ITIM 変異)、または GFP PD 1 Y248F (ITSM 変異) pervanadate で処理した後 HEK 293 t 細胞に表現されました。リン酸化 GFP PD 1 タンパク質 GFP 免疫沈降によって収集された、SHP2 を過剰発現細胞から溶解液と混合し、レベルと PD 1 の各バージョンにバインド SHP2 の活動を記録した.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: PD 1、ITIM SHP2 活動のために必要です。HEK 293 t 細胞が GFP-PD - 1、続いて pervanadate 治療と免疫沈降抗 GFP mAb-アガロース (、) を使用して指定されたバージョンを導入させた。沈殿した GFP PD-1 にバインドされている SHP2 レベル定量化 (b)、ホスファターゼ活性測定法 (c) を受けます。プル ダウン SHP2 の値は、GFP 発現レベルを正規化されました。すべての値が倍変更 WT GFP PD 1 (野生型) によって沈殿した SHP2 の強度と比較します。脱燐酸化酵素活性値は、WT GFP PD 1 co 沈澱 SHP2 の活動と比較して倍変更です。RU の相対的な単位を =。(d) 2 段階活性化モデル。まず、SHP2 が、it サービスマネジメントに募集し、2 番目の SH2 ドメインのみにする、ITIM の PD-1、完全にアクティブなコンフォメーションに SHP2 の触媒ドメインを拡張するがバインドします。平均 ± SEM. アスタリスク印グループと WT PD-1 (b と c) 間に有意差を表すようにデータが表示されます: * *p < 0.01 * * *p < 0.001、対になっていない t 検定、n = 3。Peled ているらからのデータを使用するアクセス許可(2018)12は.を付与されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
受容体酵素の相互作用は、細胞内シグナル伝達のために重要です。多くの酵素は、SH2 ドメインの同じ受容体の尾を飾るリン酸化チロシンに結合受容体を募集しています。しかし、酵素は多くの場合、閉じるの使用頻度の低い構造に折り畳まし、活性化同じ受容体の他のドメインによって仲介することができます構造変化11が必要です。アッセイは、受容体、酵素、活動間の相互作用はこれらの相互作用により誘起される対策を紹介します。
SHP2 の基板として p nitrophenylphosphate (同時) を利用して比色定量法を使いました。同時は酵素15の広い数によって解放される非選択的基板と蛍光体ドナーです。遺伝子組換えペプチドのリン酸化は、代替基板として使用できる (e.g。、マラカイト グリーンの試金で使用されるものに類似したそれら)。これらのペプチドはホスファターゼ活性の観点から具体的にしかし、それはより高価な、その感受性のために、リン酸塩フリー ソリューションで実行できるだけ。同時に特異性の欠如を回避するために別のアプローチは、問題のホスファターゼをノックアウトする制御セルラインを含めることです。これらの細胞における SHP2 の過剰発現、酵素の唯一のソースとなるし、ホスファターゼ活性の増加は、過剰発現の脱燐酸化酵素に特に起因するべき。3 番目のアプローチは、WCL 基板としてリン酸化ペプチドによって補われる代わりにタグ付きのエピトープ SHP2 蛋白質の精製と精製タグ付きのエピトープの PD 1 を使用します。基質として、リン酸化ペプチドを使用する代わりに、リン蛋白質を代わりに、使用する、タンパク質の脱燐酸化をリン酸化型特異抗体またはフォスタグ SDS-PAGE による検出ことがありますし。
重要なは、ここで説明する方法は、他の受容体酵素の相互作用の生物学に光を当てることができます。たとえば、SHP216との相互作用を無視できることがわかったが、同じ酵素の活性化のために必要があります実際にスラムの家族受容体のチロシン残基の機能が明らかに。このメソッドは、他の脱燐酸化酵素キナーゼ受容体相互作用と同様にも適用できます。
この方法は比較的簡単です、ホスファターゼの抑制剤は避けるべきであるときに注意することが重要です。これらは PD - 1 リン酸化誘導の最初のステップに必要なが、後で SHP2 のアルカリホスファターゼ活性をテストするために削除する必要があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、NIH の補助金 1R01AI125640-01 とリウマチ研究財団の資金を供給されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
References
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