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Immunology and Infection

수용 체와 효소 간의 기능 상호 작용을 공부에 대 한 분석 결과 Co-immunoprecipitation

Published: September 28, 2018 doi: 10.3791/58433

Summary

여기, 우리는 공동 immunoprecipitation과 동시에 효소 모집 및 효소 활동에 원형질 막 수용 체의 특정 단백질 도메인의 기여를 연구에 구슬 효소 활동 분석 결과 대 한 프로토콜을 제시.

Abstract

수용 체 관련 된 효소는 세포 활성화의 주요 중재자. 이 효소는 통제, 적어도 부분에서 수용 체의 세포질 꼬리와 물리적 상호 작용을 통해. 종종 상호 작용 특정 단백질 도메인을 통해 발생 하 고 효소의 활성화에 결과. 단백질 사이 상호 작용을 공부 하는 여러 방법이 있다. 공동-immunoprecipitation은 일반적으로 단백질 단백질 상호 작용에 필요한 도메인을 공부 하는 데 사용 됩니다, 있다 아무 분석 문서를 동시에 모집된 효소의 활동에 특정 도메인의 기여. 따라서 여기 설명 하는 방법을 결합 단백질과 관련된 효소 활성화 사이 상호 작용의 동시 평가 구슬 효소 활동 분석 결과 공동 immunoprecipitation. 이 프로토콜의 목표 단백질 및 효소와 효소의 완전 한 활성화에 대 한 의무는 도메인 간의 실제 상호 작용에 대 한 중요 한 도메인을 식별 하는 것입니다. 이 분석 결과의 중요성을 설명, 특정 수용 체로 단백질 도메인에 기여할 효소, 수용 체의 세포질 꼬리의 바인딩 다른 도메인은 동일한 효소의 기능을 조절 하는 데 필요한.

Introduction

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촉매 수용 체와 수용 체 티로신 kinases는 막 횡단 단백질에 extracellular ligand의 바인딩 세포내 측면1에 효소 활동을 하면. 다른 kinases와 그들의 세포질 꼬리를 가수분해 등 특정 효소를 모집 하는 동안 일부 수용 체 수용 체 및 효소 기능 보유. 수용 체의 꼬리를이 효소의 촉매 조치는 효소의 채용은 항상 동일한 단백질 도메인2에 의해 통제 되지 않는 두 개의 별도 프로세스. 불행 하 게도, 동시에 상호 작용 및 효소 활동을 평가 하기 위해 특정 도구가 있다. 여기에 설명 된 기능 공동-immunoprecipitation 분석 결과 정품 인증에서 수용 체의 꼬리에는 효소의 채용을 해 부하는 유용한 방법입니다. 이 분석 결과 항 체 코팅 구슬에 의해 태그 수용 체의 immunoprecipitation를 사용합니다. 그 후, 효소 활동 분석 결과 구슬에 서쪽 오 점 분석 수행 됩니다. 이 방법의 전반적인 목표는 단백질 도메인은 수용 체와 효소 (서쪽 오 점 분석에 의해 평가) 간의 상호 작용에 필요한 폭로 이며 도메인 (구슬에 의해 측정 하는 효소의 완전 한 활성화에 대 한 의무 효소 활동 분석 결과)입니다. 그것은 인간의 질병의 병 인에서 그들의 개입으로 인해 수용 체 관련 된 효소의 기능을 별도 공부를 위한 도구를 개발 하는 중요 한. 또한, 추가이 단백질의 행동의 메커니즘을 이해 하는 것은 소설 치료 개입의 디자인을 도울 수 있다.

프로그램 된 죽음-1 (PD-1) T 세포의 표면에는 금지 수용 체 이며, 과도 한 T 세포 응답을 제한 하는 데 필요한. 최근 몇 년 동안에서 안티-PD-1 항 체 여러 악성1,2의 치료에 연루 되었습니다. PD 1 결 찰 확산, 접착, 및 여러 cytokines3,,45의 분 비를 포함 하 여 다양 한 T 세포 기능을 멈출. PD 1은 면역학 시 냅 스, 그것은 T 세포 수용 체 (TCR)7colocalizes T 세포와 항 원 제시 세포6, 사이의 인터페이스를 지역화 됩니다. 그 후,는 티로신 인산 가수분해 효소 SHP2 [Src 상 동 2 (SH2) 도메인 티로신 인산 가수분해 효소 2] PD-1, 인접 복잡 한 TCR 및 그것의 관련 된 키 티로신 잔류물의 dephosphorylation로 이어지는 세포질 꼬리를 모집 신호 분자3,,45,,89. PD 1의 세포질 꼬리 두 티로신 모티프는 immunoreceptor 티로신 근거한 금지 주제 (ITIM), 및 immunoreceptor 티로신 기반 스위치 모티브 (ITSM)10에 포함 되어 있습니다. 두 모티프는 PD 1 결 찰9,10시 phosphorylated는. Mutagenesis 연구 SHP2 PD-1 신호 및 기능에 있는 그의 역할은 분명 ITIM 반대로 모집4ITSM에 대 한 기본 역할을 계시 했다.

SHP2 중 하나는 닫힌 (접혀) 채택, 구조 또는 오픈 (확장), 활성 구조11저해. SHP2 바인딩 또는 활성화 PD 1의 각 꼬리 도메인의 기여는 아직 해명 하지. 이 질문에 대답, 우리는 PD-1와 그것의 활동12의 꼬리에 SHP2의 채용의 병렬 테스트 수 있도록 분석 결과 개발 했다. 우리는 공동-immunoprecipitation와 동시에 상호 작용 및 효소 활동을 테스트 하는 구슬에 인산 가수분해 효소 활동 분석 결과 고용. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리는 PD 1의 ITSM PD 1의 ITIM 완벽 하 게 확장 하 고 효소를 활성화 하는 데 필요한 동안 PD-1, 꼬리 SHP2 모집 충분 한지 보여줍니다.

여러 인접 한 도메인 그들의 세포질 꼬리에 있는 많은 수용 체가 있다. 기능 공동-immunoprecipitation 분석 결과 단백질 모집 또는 효소 활성화에 필요한 특정 도메인의 역할을 파악할 수 있습니다.

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Protocol

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1입니다. 세포의 transfection

  1. 씨앗 HEK 293T 세포도 12 10 cm 접시 (접시 당 5 x 106 세포)는 전날 transfection (그림 1). 세포는 hemocytometer를 사용 하 여 계산을 수행 합니다. 각 접시에 대 한 10 %FBS 1% 페니실린/스 보충 DMEM의 10 mL을 사용 합니다. 5% CO2에서 37 ° C에서 세포를 품 어.
  2. 셀은 80-90% 합칠, 일단 transfect 5 HEK 293T 격판덮개 지질에 기초를 둔 transfection 시 약을 사용 하 여 다음 플라스 미드 중 하나: SHP2을 표현 하는 벡터, PD 1 GFP 표현 벡터 [PD 1의 야생 유형 (WT) 버전], ITIM 돌연변이 버전 (Y223F )의 PD 1 GFP 표현 벡터와는 ITSM 돌연변이 (Y248F)의 버전 PD 1 GFP 표현 벡터 (그림 1).
    참고: 두 접시 WT PD-1-GFP-표현 벡터와 페 될 것입니다. 한 추가 판 비 페 셀 컨트롤 (그림 1) 될 것입니다.
  3. 10 cm 번호판에 부착 세포에 대 한 제조 업체의 프로토콜에 의하여 transfection를 수행 합니다.
    참고: PD 1의 돌연변이 버전에 각 주제에 티로신 (Y) phosphorylated 수 없습니다 페닐알라닌 (F)에 의해 대체 되었다.
  4. 5 접시와 immunoprecipitation (그림 1) 전에 표현한 단백질 금액 [입력; 일컬어 전체 세포 lysate (WCL)]의 측정에 대 한 비 페 제어로 봉사 한 추가 접시의 두 번째 동일 집합 transfect
  5. 37 ° C에서 48 h, 5% CO2 조직 문화 인큐베이터에서 transfected 세포를 품 어.
    참고: 해당 transfection 성공적으로 발생 되도록 GFP 식 형광 현미경을 사용 하 여 셀을 검사 합니다.

2. 추진 Transfected 세포 인 산화

  1. 부 화, 다음 30% H2O2의 50 µ L와 신선한 pervanadate (100 m m 재고)에서 나트륨-orthovanadate의 50 µ L를 혼합 하 여 준비 합니다.
    참고: 혼합 노란 색으로 변경 해야 합니다. Pervanadate는 티로신 잔류물13의 인 산화를 촉진 하는 세포 투과성 인산 가수분해 효소 억제 물. 이 분석 결과에서 튼튼하게 PD 1의 꼬리의 인 산화를 유도 하기 위해 사용 됩니다.
  2. PD 1의 태그 버전 phosphorylate PD 1 GFP transfected 세포에서 미디어를 제거 하 고 각 10 cm 접시 (8 접시 표현 결과 10 µ L pervanadate (2.1 단계)의 함께 (하지 않고 혈 청 또는 항생제) 일반 DMEM의 10 mL를 추가 PD 1의 다른 버전) (그림 1). 15 분 동안 어둠 속에서 실 온에서 접시를 놓습니다.
    참고: SHP2 페 셀 (2 개의 격판덮개; 그림 1) 그리고 이후이 번호판 활성 SHP2 효소에 대 한 소스로 사용할 것입니다 두 비 페 제어 접시 pervanadate와 함께 처리 되지 않습니다.
  3. 얼음 처럼 차가운 1 x PBS의 5 mL로 세포 세척. 이 단계를 두 번 반복 합니다.

3입니다. Immunoprecipitation

참고: 다음 단계 수행 해야 또는 얼음에 4 ° c.에

  1. 세포의 용 해 버퍼 (50 m m Tris HCl pH 7.2, 250 mM NaCl, 0.1 %NP-40, 2 mM EDTA, 10% 글리세롤) protease 억제제 (세포의 용 해 버퍼의 10 mL에 녹 1 태블릿)와 1mm 나트륨 orthovanadate 보충. 셀에 500 µ L의 얼음 세포의 용 해 버퍼를 추가 및 제거 하 고 즉시 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 격판덮개에서 세포를 수집.
    참고: 그것은 SHP2 페 접시와 비 페 컨트롤 플레이트 인산 가수분해 효소 활동을 유지 해야 하므로 PD 1 GFP 페 번호판에 대 한 사용할 수 세포의 용 해 버퍼에만 나트륨 orthovanadate를 추가 하는 것이 중요.
  2. 1.5 mL 찬 튜브는 lysates 전송 및 0.005 x g, 30 분 동안 4 ° C에서 그들을 회전.
  3. lysates에서 포스트 핵 표면에 뜨는 (PNS)를 수집, 4 ° C에서 10000 x g 에서 10 분 동안 lysates 아래로 회전 하 고는 supernatants 새로운 튜브로 전송 합니다. 펠 릿을 삭제 합니다. 6 판 (그림 1)의 두 번째 세트의 supernatants 나중 WCL 분석을 위한 얼음에 저장 합니다.
  4. 첫 번째의 PD 1 GFP 페 lysates에서 PD-1-GFP의 immunoprecipitation에 대 한 안티-GFP 구슬의 준비 (4 판) 설정 (그림 1).
    1. 구슬의 침전을 방지 하기 위해 부드럽게 열기 전에 구슬 가진 병을 흔들어. 각 조건 마다 슬러리에서 안티-GFP 구슬의 40 µ L을 제거 합니다.
    2. 4 ° C에서 3 분 동안 500 x g 에서 회전 시키십시오 고 구슬 씻고 상쾌한을 제거 합니다.
      참고: 플라스틱 피 펫 팁 및 손실을 방지 하기 위해 agarose 구슬 사이의 접촉을 최소화 하기 위해 중요 하다. 다른 튜브에 비즈를 전송 하기 전에 200 µ L 팁의 가장자리를 잘라 하는 것이 좋습니다.
    3. (샘플) 당 세포의 용 해 버퍼의 80 µ L에 구슬 resuspend.
  5. 씻어 구슬 lysate 셀에 직접 (PNS) 첫 번째 세트 (4 판)의 PD 1 GFP 표현 세포에서 추가 (단계 3.3). GFP 태그 immunoprecipitate 단백질에 4 ° C에서 30 분 동안 0.005 x g 에서 회전 합니다.
  6. 워시 (orthovanadate) 없이 차가운 세포의 용 해 버퍼의 1 mL와 구슬 3 번. 2500 x g 10에서 튜브 원심 s.
    참고: 구슬에 세포의 용 해 버퍼를 추가 하는 경우 추가 구슬에 직접 팁 그들을 건드리지 않고. 아래로 세척 동안 플라스틱 필요가 있다.
  7. 똑같이 lysate 첫 세트 (한 접시; 단계 3.3)에서 활성 SHP2의 분할 하 고 씻어 PD 1 GFP 함유 구슬 (WT PD-1-GFP와 두 개의 서로 다른 phosphdeficient 돌연변이, Y223F 및 Y248F)의 3 관에 그것을 추가. 비 transfected 세포 lysate에서 WT PD-1-GFP 구슬의 두 번째 튜브에는 볼륨의 1 / 3를 추가 합니다. 나머지 2/3를 삭제 합니다.
  8. 부드러운 회전 (0.005 x g) 4 ° C에서 4 h 구슬을 품 어.
  9. 3.6 단계에서 보고 된 구슬 (pervanadate 또는 orthovanadate) 없이 차가운 세포의 용 해 버퍼의 1 mL로 두 번 세척.
  10. 80 µ L의 샘플 확인 각 관에서 총 볼륨 100 µ L (구슬의 20 µ L) 및 세포의 용 해 버퍼의 80 µ L 당 (하지 않고 pervanadate 또는 orthovanadate) 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 하 고 두 개의 신선한 1.5 mL 튜브 각 튜브에서 50 µ L를 전송.
    참고:이 단계에 따라 있을 것입니다 구슬 및 세포의 용 해 버퍼를 포함 하는 혼합물으로 채워진 2 개의 관: 1 개의 관 서쪽 blotting에 의해 co immunoprecipitated SHP2를 테스트 하는 데 사용 됩니다 및 두 번째 인산 가수분해 효소 활동 분석 결과 대 한 사용 됩니다.

4. 인산 가수분해 효소 활동 분석 결과

  1. 구슬 인산 가수분해 효소 워시 버퍼 (30mm Hepes pH 7.4와 120 m m NaCl)로 한 번 씻는 다. 상쾌한을 완전히 제거 합니다.
  2. 구슬를 분석 결과 버퍼 (30mm Hepes pH 7.4, 120 m m NaCl, 5mm DTT, 10 m m p-nitrophenylphosphate)의 100 µ L을 추가 하 고 부드러운 동요에서 30 분 동안 30 ° C에서 품 어. 참고: 보육 시간 다 수 있지만 버퍼 dephosphorylation 시 노란색으로 될 때까지 기다립니다.
  3. 반응 종료 때 버퍼 노란색 1 M NaOH의 50 µ L를 추가 합니다.
  4. 2500 x g 10 s 및 전송 50 µ L의 절반 영역의 두 웰 스 (잘 당 50 µ L와 중복) 상쾌한에 스핀 다운 96 잘 접시에. 405에서 흡 광도 읽고 nm.
  5. PD-1-GFP의 제어 야생-타입 버전 상대 광학 밀도 (OD)로 결과 표현 한다.

5. SHP2 서쪽 오 점 분석

  1. 구슬 아래로 회전 시키십시오 그리고 제거는 상쾌한.
  2. 2 x Laemmli 버퍼의 20 µ L 추가 ( 자료 표참조) 구슬 및 5 분 동안 95 ° C에 종 기.
  3. 입력의 단백질 농도 측정 컨트롤 (2) 사용 하 여 설정를 BCA 키트 ( 자료 표참조). 새로운 튜브에 가장 희석된 샘플의 30 µ L를 전송. 입력된 컨트롤과 가장 희석된 샘플으로 동일한 농도에 세포의 용 해 버퍼의 나머지 부분을 희석 하 고 그들의 각각에서 새로운 튜브 30 µ L를 전송.
    참고:이 단계에 따라 있을 것입니다 30 µ L 각각 4 튜브 비슷한 단백질 농도에서 lysates 제어 입력을 나타내는.
  4. 동등한 lysates와 95 ° C 5 분 스핀에서 종 2 x Laemmli 버퍼의 구슬 아래로 볼륨과 4-20 %SDS 페이지 트리 기반 젤에 상쾌한 로드 추가 ( 자료 표참조) 서 부에 대 한 분석 오 점. 또한, 두 번째 집합의 각 샘플에서 50 µ L를 로드 합니다.
  5. 서쪽 오 점 분석 프로토콜에 따라 이전12설명 계속.

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Representative Results

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기여의 ITSM의 PD-1 SHP2 바인딩을 설정 하는 동안 PD 1의 ITIM의 역할은 보다 적게 명확 하다. SHP2 두 SH2 도메인 PD-1 (한 티로신은 ITSM에서)와 다른은 ITIM 두 순차 phosphotyrosines 바인딩할 수 있기 때문에, 우리는 PD 1의 ITIM 안정화 여 SHP2 활동을 용이 하 게 하는 동안 PD 1의 ITSM PD-1, SHP2를 앵커 가설의 구조적 상태11,14을 엽니다. 이 테스트 하려면 우리는 결합 된 공동-immunoprecipitation 및 수용 체-효소의 상호 작용 및 활성화의 병렬 평가 대 한 분석 결과 효소 활동을 개발 했다. 강포한 유형 GFP-PD-1, GFP-PD-1 Y223F (ITIM 돌연변이), 또는 GFP-PD-1 Y248F (ITSM 돌연변이) 이후 pervanadate (그림 1), phosphorylated PD 1 꼬리 선도로 치료 했다 HEK 293T 세포에 표현 했다. PD-1 단백질 안티-GFP 코팅 비즈를 사용 하 여 수집 되었다. 이 구슬 SHP2 공동-immunoprecipitation SHP2 overexpressing 세포 lysates에서 사용 되었다. PD-1와 그것의 효소 활동의 각 버전에 바인딩된 SHP2의 수준은 기록 했다.

당연히, SHP2는 ITSM 돌연변이 이었다 때 PD 1에 바인딩할 실패 (Y248F; 그림 2A)입니다. 놀랍게도, ITIM (Y223F)의 돌연변이 체 버전 SHP2 바인딩 제한 된 범위 (그림 2B)에 억제. 그럼에도 불구 하 고, SHP2 인산 가수분해 효소 활동 분석 결과 밝혀 ITIM와 ITSM 효소 활동 (그림 2C)에 대 한 동등 하 게 불가결 했다. PD-1 immunoprecipitates SHP2, 뿐만 아니라 다른 가수분해 포함 될 수 있습니다 우리 SHP2 하지 overexpressed는 제어 상태 (그림 2B 2c, 파란색) 사용.

따라서, 2 단계 활성화 모델 SHP2 조건 (2D 그림, 왼쪽) 휴식 아래 자동 저해 나 란으로 접혀 있다 드러났습니다. PD 1의 활성화, SHP2은 phosphorylated ITSM (그림 2D, 중간)을 채용. 그러나,는 ITIM의 활성 구조 (그림 2D, 오른쪽)으로 SHP2를 펼쳐 phosphorylated도 해야 합니다.

Figure 1
그림 1: 실험 조건 및 전략. GFP-PD-1 WT (야생 타입), GFP-PD-1 Y223F (ITIM 돌연변이), 또는 GFP-PD-1 Y248F (ITSM 돌연변이) 이후 pervanadate로 치료 했다 HEK 293T 세포에 표현 했다. Phosphorylated GFP-PD-1 단백질 GFP immunoprecipitation에 의해 수집 된 SHP2, overexpressing 세포에서 lysates와 혼합 했다 그리고 수준 및 PD 1의 각 버전에 바인딩된 SHP2의 활동을 기록 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: ITIM의 PD-1 SHP2 활동에 필요한은. HEK 293T 세포 GFP-PD-1, pervanadate 처리 및 안티-GFP mAb-agarose ()를 사용 하 여 immunoprecipitation의 지정 된 버전으로 페 했다. SHP2 레벨 침전 된 GFP-PD-1에 바인딩된 정량된 (b) 그리고 인산 가수분해 효소 활동 분석 결과 (c)에 복종. 뽑아 다운 SHP2의 값은 GFP 식 수준으로 정규화 됩니다. 모든 값은 배-변경 WT GFP-PD-1 (야생 타입)에 의해 침전 된 SHP2의 강도 비해. 인산 가수분해 효소 활동 값은 배-변경 WT GFP-PD-1 공동 immunoprecipitated SHP2의 활동에 비해. RU = 상대 단위. (d) 2 단계 활성화 모델. 첫째, SHP2는 ITSM을 모집 하 고 그런 다음 두 번째 SH2 도메인은 ITIM의 PD-1, 완전 활성 구조를 SHP2의 촉매 도메인 확장를 바인딩할지 않습니다. 평균 ± SEM. 별표 표시 그룹과 WT PD-1 (b와 c) 사이의 중요 한 차이 나타내는 데이터 제시 됩니다: * *p < 0.01, * * *p < 0.001, 짝이 없는 t-검정, n = 3. Peled 그 외 여러분 에서 데이터 사용 권한 (2018) 12 . 을 부여 했다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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수용 체-효소의 상호 작용은 세포내 시그널링을 위한 중요 한. 많은 효소 SH2 도메인 동일한 수용 체의 꼬리를 장식 phosphorylated tyrosines에 바인딩 통해 수용 체에 채용 됩니다. 그러나, 효소는 종종 닫힌된 비활성 conformations 통합 하며 활성화 다른 도메인의 동일한 수용 체에 의해 중재 될 수 있는 구조적 변경11 . 분석 결과 설명 여기 측정 이러한 상호 작용에 의해 유도 된 활동 뿐 아니라 효소 및 수용 체 사이 상호 작용.

P-nitrophenylphosphate (pNPP)를 활용 하 여 SHP2를 기판으로 색도계 분석 결과 사용 했습니다. pNPP는 효소15의 광범위 한 번호를 공개한 비 선택적 기판 고 인 기증자. Phosphorylated 재조합 펩 티 드 대체 기판으로 사용할 수 있습니다 (., 그 공작 석 녹색 분석 결과에 사용 된 그들와 비슷한). 이러한 펩 티이 드는; 인산 가수분해 효소 활동의 측면에서 좀 더 구체적인 그러나, 그것은 costlier, 그리고 그것의 감도 때문에 그것만 수행할 수 인산 염-무료 솔루션. PNPP 향해 특이성의 부족을 우회 하는 또 다른 방법은 인산 가수분해 효소에 기 절은 제어 셀 라인을 포함 것입니다. 이 셀에 SHP2의 overexpression 효소에 대 한 유일한 소스 그리고 인산 가수분해 효소 활동의 증가-표현된 인산 가수분해 효소에 할당 한다. 세 번째 접근 WCL 기질으로 phosphopeptides에 의해 보충 대신 정화 피토 프 태그 SHP2 단백질 및 순화 된 피토 프 태그 PD-1을 사용 하는 것입니다. 기질으로는 phosphopeptide를 사용 하는 대신,는 phosphoprotein를 사용 하 고에 단백질의 dephosphorylation 인 특정 항 체 또는 포스-태그 SDS 페이지에서 검색 될 수 있습니다.

중요 한 것은, 여기에서 설명 하는 방법을 수 있습니다 다른 수용 체-효소 상호 작용의 생물학에 빛을 발산 하 고 있다. 예, 그것은 SHP216 와 상호 작용에 대 한 무시할 수 있을 발견 되었습니다 하지만 실제로 동일한 효소의 활성화에 필요한 수 있습니다 슬램 가족 수용 체의 티로신 잔류물의 기능을 파악할 수 있습니다. 이 방법은 또한 다른 가수분해로 kinases 수용 체 상호 작용에 적용할 수 있습니다.

이 메서드는 비교적 간단 하지만, 그것은 중요 때 인산 가수분해 효소 저 해제는 피해 야 한다입니다. 이들은 PD 1의 인 산화 유도의 초기 단계에서 필요 하지만 나중에 그들은 SHP2의 인산 가수분해 효소 활동을 테스트 하기 위해 제거 해야 합니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 프로젝트는 NIH 교부 금 1R01AI125640-01 '과 류 마티스 연구 재단에 의해 투자 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Lonza 17-516F Phosphate Buffered Saline
Microcentrifuge Eppendorf 5424-R 1.5 mL
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red Gibco 25200114
Heat Inactivated FBS Denville FB5001-H Fetal bovine serum
Penicillin / Streptomycin Fisher BP295950
DMEM high glucose without L-glutamine Lonza BE12-614F
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305
Anti-SHP2 Santa Cruz SC-280
Anti–GFP-agarose MBL D153-8
Anti-GFP Roche 118144600
Anti-Actin Santa Cruz SC-1616
HEK-293 cells ATCC CRL-1573
Orthovanadate Sigma S6508
H2O2 Sigma 216763 30%
Protease inhibitor cocktail Roche 11836170001 EDTA-free
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x) Invitrogen LC2676 Modified Laemmli buffer
4-20% Tris-Glycine Mini Gels Invitrogen XP04205BOX 15-well
Nitrocellulose membranes General Electric 10600004
NaCl Sigma S7653 Sodium chloride
HEPES Gibco 15630080 N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid
DTT Invitrogen D1532 Dithiothreitol
pNPP Sigma 20-106 p-Nitrophenyl Phosphate
NaOH Sigma S8045 Sodium hydroxide
BCA Fisher 23225 Bi Cinchoninic Acid assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17, (1), (2018).
  2. Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153, (1), 42-50 (2018).
  3. Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135, (2), 564-567 (2015).
  4. Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173, (2), 945-954 (2004).
  5. Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5, (230), 46 (2012).
  6. Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (45), (2007).
  7. Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209, (6), 1201-1217 (2012).
  8. Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355, (6332), 1428-1433 (2017).
  9. Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574, (1-3), 37-41 (2004).
  10. Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (24), 13866-13871 (2001).
  11. Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
  12. Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (3), E468-E477 (2018).
  13. Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28, (1), 25-30 (2009).
  14. Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270, (7), 2897-2900 (1995).
  15. McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 18, Unit18 18 (2010).
  16. Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166, (9), 5480-5487 (2001).
수용 체와 효소 간의 기능 상호 작용을 공부에 대 한 분석 결과 Co-immunoprecipitation
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Peled, M., Strazza, M., Mor, A. Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes. J. Vis. Exp. (139), e58433, doi:10.3791/58433 (2018).More

Peled, M., Strazza, M., Mor, A. Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes. J. Vis. Exp. (139), e58433, doi:10.3791/58433 (2018).

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