Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Co-immunoprecipitation analysmetod för att studera funktionella interaktioner mellan receptorer och enzymer

Published: September 28, 2018 doi: 10.3791/58433

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för co-immunoprecipitation och en på-pärla enzymatisk aktivitet assay att samtidigt studera bidrag specifikt protein domäner av plasma membranreceptorer både enzym rekrytering och enzymaktivitet.

Abstract

Receptor-associerade enzymer är de stora medlarearna av cellulär aktivering. Dessa enzymer regleras, åtminstone delvis, fysiska interaktioner med cytoplasmiska svansar av receptorer. Samspelet ofta uppstå genom specifika protein domäner och leda till aktivering av enzymer. I området i närheten finns det flera metoder för att studera interaktioner mellan proteiner. Även co-immunoprecipitation används vanligen för att studera domäner som krävs för protein-protein interaktioner, finns inga analyser dokumentet specifika domäner till aktiviteten hos enzymerna som rekryterade bidrag samtidigt. Följaktligen kombinerar den metod som beskrivs här co-immunoprecipitation och på-pärla enzymaktivitet test för samtidig utvärdering av interaktioner mellan proteiner och associerade enzymatisk aktivering. Målet med detta protokoll är att identifiera de domäner som är kritiska för fysiska interaktioner mellan ett protein och enzym och domäner som är obligatoriska för slutföra aktiveringen av enzymet. Vikten av denna analys framgår, som vissa receptor protein domäner bidrar till bindningen av enzymet till cytoplasmiska svans av receptor, medan andra domäner är nödvändigt att reglera funktionen av samma enzym.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Katalytisk receptorer och receptortyrosinkinaser är transmembrana proteiner som orsakar bindningen av en extracellulär ligand enzymatisk aktivitet på intracellulära sida1. Vissa receptorer besitter både receptor och enzymatiska funktioner, medan andra rekrytera specifika enzymer såsom kinaser och fosfataser till deras cytoplasmiska svansar. Rekrytering av ett enzym till receptorns tail och det efterföljande katalys av detta enzym är två separata processer som inte alltid regleras av samma protein domäner2. Tyvärr finns det inga särskilda verktyg för att bedöma både interaktion och enzymatisk aktivitet samtidigt. Funktionella co-immunoprecipitation analysen beskrivs här är en användbar metod att dissekera rekrytering av ett enzym till svansen på en receptor från dess aktivering. Denna analys använder tredjeparts immunoprecipitation av märkta receptorer av antikroppsbelagda pärlor. Därefter utförs både en enzymatisk aktivitet assay och western blot analys på pärlor. Det övergripande målet med denna metod är att avslöja vilka protein domäner är nödvändiga för interaktioner mellan receptorer och enzymer (bedömd med western blot analys) och vilka domäner är obligatoriska för fullständig aktivering av enzymer (mätt på-pärla enzymatisk aktivitet assay). Det är betydelsefullt att utveckla verktyg för att studera de separata funktionerna av receptor-associerade enzymer på grund av sin inblandning i patogenesen av mänskliga sjukdomar. Dessutom kan ytterligare förstå verkningsmekanismer av dessa proteiner hjälpa utformningen av nya terapeutiska interventioner.

Programmerad död-1 (PD-1) är en hämmande receptor på ytan av T-celler och krävs för att begränsa överdriven T-cell svar. Under de senaste åren har anti-PD-1 antikroppar varit inblandade i behandlingen av flera maligniteter1,2. PD-1 ligatur hindrar många T-cellfunktioner, inklusive spridning, adhesion och sekretion av flera cytokiner3,4,5. PD-1 är lokaliserad till immunologisk synaps, gränssnittet mellan T-celler och antigen-presenterande celler6, där det colocalizes med T-cells-receptorn (TCR)7. Därefter den tyrosin fosfatas SHP2 [Src homologi 2 (SH2) domänen som innehåller tyrosin fosfatas 2] rekryteras till den cytoplasmiska svansen av PD-1, vilket leder till dephosphorylation av nyckel tyrosin rester inom komplexa TCR och dess associerade proximala Signaling molekyler3,4,5,8,9. Den cytoplasmiska svansen av PD-1 innehåller två tyrosin motiv, en immunoreceptor tyrosin-baserade hämmande motiv (svart) och en immunoreceptor tyrosin baserat-switch motiv (ITSM)10. Både motiv är fosforyleras vid PD-1 ligatur9,10. Mutagenes studier har visat en primär roll i ITSM SHP2 rekrytering, i motsats till den svart, vars roll i PD-1 signalering och funktion inte är klart4.

SHP2 antar antingen ett stängt (flertrådigt), inhiberad konformation eller öppen (extended), aktiv konformation11. Bidraget från varje svans domän av PD-1 SHP2 bindande eller aktiveringen är ännu inte klarlagd. För att besvara den frågan har utvecklat vi en analysmetod som möjliggör parallella testning av rekrytering av SHP2 till svansen av PD-1 och dess aktivitet12. Vi anställd co-immunoprecipitation och en på-pärla fosfatas aktivitet assay att testa både interaktion och enzymatisk aktivitet parallellt. Med denna analys, visar vi att den ITSM av PD-1 är tillräcklig för att rekrytera SHP2 till svansen av PD-1, medan den svart av PD-1 krävs att fullt förlänga och aktivera enzymet.

I området i närheten finns det många receptorer som har flera intilliggande domäner i deras cytoplasmiska svansar. Funktionella co-immunoprecipitation analysen kan avslöja rollen av specifika domäner som är nödvändiga för antingen protein rekrytering eller enzymatisk aktivering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. transfection celler

  1. Utsäde HEK 293T celler i tolv 10 cm plattor (5 x 106 celler per platta) dagen innan transfection (figur 1). Utföra den cell som räknar med en hemocytometer. För varje platta, använda 10 mL DMEM kompletteras med 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin. Inkubera cellerna vid 37 ° C i 5% CO2.
  2. När cellerna är 80-90% konfluenta, transfect 5 HEK 293T plattor med ett lipid-baserade transfection reagens med en av de följande plasmidsna: en SHP2-uttryckande vektor, en PD-1-GFP-uttryckande vektor [en vildtyp (WT) version av PD-1], en svart-muterade version (Y223F ) av en PD-1-GFP-uttryckande vektor och en ITSM-muterade version (Y248F) av en PD-1-GFP-uttryckande vektor (figur 1).
    Obs: Två plattor kommer vara transfekterade med WT PD-1-GFP-uttryckande vektorn. En extra platta kommer att fungera som en icke-transfekterade celler kontroll (figur 1).
  3. Utföra transfection enligt tillverkarens protokoll för vidhäftande celler i 10 cm plattor.
    Obs: I de muterade versionerna av PD-1 ersattes tyrosin (Y) i varje motiv av fenylalanin (F) som inte kan vara fosforyleras.
  4. Transfect en andra identisk uppsättning av fem plattor och en extra plåt som fungerar som en icke-transfekterade kontroll för mätning av uttryckta proteinet belopp [input; kallas även hela cell lysate (WCL)] före immunoprecipitation (figur 1).
  5. Inkubera transfekterade cellerna för 48 h i 37 ° C, 5% CO2 i en vävnadskultur inkubator.
    Obs: För att säkerställa att transfection framgångsrikt har inträffat, undersöka cellerna för god Jordbrukarsed uttryck med fluorescerande Mikroskop.

2. främja fosforylering i transfekterade celler

  1. Efter inkubation, förbereda färska pervanadate genom att blanda 50 µL av natrium-orthovanadate (från 100 mM lager) med 50 µL av 30% H2O2.
    Obs: Blandningen bör ändras till en gulaktig färg. Pervanadate är en cell-permeable fosfatas-hämmare som främjar fosforylering av tyrosin rester13. I denna analys brukade det kraftfullt inducera fosforylering av svansar av PD-1.
  2. För att fosforylera märkta versionerna av PD-1, ta bort mediet från PD-1-GFP-transfekterade cellerna och tillsätt 10 mL av vanligt DMEM (utan serum eller antibiotika) tillsammans med 10 µL pervanadate (steg 2.1) till varje 10 cm platta (resulterar i åtta plattor att uttrycka olika versioner av PD-1) (figur 1). Placera plåtarna vid rumstemperatur i mörkret i 15 min.
    Obs: SHP2-transfekterade cellerna (två plåtar. Figur 1) och de två icke-transfekterade kontrollplattor behandlas inte med pervanadate, eftersom dessa plattor kommer att fungera som källa för aktiva SHP2 enzymet.
  3. Tvätta cellerna med 5 mL iskallt 1 x PBS. Upprepa detta steg två gånger.

3. Immunoprecipitation

Obs: Följande steg bör utföras på is eller vid 4 ° C.

  1. Komplettera lyseringsbuffert (50 mM Tris-HCl vid pH 7,2, 250 mM NaCl, 0.1% NP-40, 2 mM EDTA, 10% glycerol) med proteashämmare (lös 1 tablett i 10 mL lyseringsbuffert) och 1 mM natrium orthovanadate. Tillsätt 500 µL iskall lyseringsbuffert till cellerna och ta bort och samla cellerna från plattorna omedelbart med en cell skrapa.
    Obs: Det är viktigt att lägga den natrium orthovanadate endast till de lyseringsbuffert som kommer att användas för PD-1-GFP-transfekterade plattorna, eftersom SHP2-transfekterade tallrikar och icke-transfekterade kontrollplattor måste behålla fosfatasaktiviteten.
  2. Överför lysates i 1,5 mL kallt rör och rotera dem vid 0,005 x g, 4 ° C i 30 min.
  3. Samla in inlägget atomkärnor supernatant (PNS) från lysates, snurra ner lysates i 10 min vid 10 000 x g vid 4 ° C och överför supernatanterna till nya rör. Kassera pelleten. Lagra supernatanterna av de andra sex tallrikar (figur 1) på is för senare WCL analys.
  4. Förberedelse av anti-GFP pärlor för immunoprecipitation av PD-1-GFP från det PD-1-GFP-transfekterade lysates av första ange (fyra plåtar) (figur 1).
    1. För att förhindra reglerandet av pärlor, försiktigt skaka flaskan med pärlor innan öppning. Ta bort 40 µL anti-GFP pärlorna från slam per varje villkor.
    2. Snurra på 500 x g under 3 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten för att tvätta pärlorna.
      Obs: Det är viktigt att minimera kontakten mellan pipettspetsarna plast och agaros pärlor att förhindra förlust. Det rekommenderas att skära kanten av ett 200 µL tips innan du överför pärlorna till en annan tube.
    3. Återsuspendera pärlorna i 80 µL lyseringsbuffert (per prov).
  5. Lägg de tvättade pärlorna direkt till cell lysate (PNS) från PD-1-GFP-uttrycker cellerna i den första uppsättningen (fyra plåtar) (steg 3.3). Rotera vid 0,005 x g i 30 minuter vid 4 ° C till immunoprecipitate i GFP-märkta proteiner.
  6. Tvätta pärlorna med 1 mL kall lyseringsbuffert (utan orthovanadate) 3 gånger. Centrifugera röret vid 2500 x g i 10 s.
    Obs: När du lägger lyseringsbuffert till pärlor, lägga till den direkt på pärlorna utan att vidröra dem med tips. Det finns ingen anledning att Pipettera upp och ner under tvättarna.
  7. Lika delar den lysate av den aktiva SHP2 från den första uppsättningen (en tallrik; steg 3.3) och lägga till tre rör av tvättade PD-1-GFP-innehållande pärlor (WT PD-1-GFP och de två olika phosphdeficient mutationerna, Y223F och Y248F). Lägga till en tredjedel av volymen från den lysate av icke-transfekterade cellerna i det andra röret av WT PD-1-GFP pärlor. Kassera de återstående två tredjedelarna.
  8. Inkubera pärlorna i 4 h vid 4 ° C med varsam rotering (0,005 x g).
  9. Tvätta pärlorna två gånger med 1 mL kall lyseringsbuffert (utan pervanadate eller orthovanadate), som rapporterats i steg 3.6.
  10. Tillsätt 80 µL lyseringsbuffert (utan pervanadate eller orthovanadate) per prov garanterar att den totala volymen i varje tub 100 µL (20 µL av pärlor) och 80 µL lyseringsbuffert. Blanda försiktigt och överföra 50 µL från varje rör i två färska 1,5 mL rör.
    Obs: Efter detta steg, kommer det att finnas två rör fyllda med en blandning som innehåller pärlor och lyseringsbuffert: en tub kommer att användas för provning av co-immunoprecipitated SHP2 med western blotting och andra kommer att användas för fosfatas verksamhet analysen.

4. fosfatas aktivitet Assay

  1. Tvätta pärlorna en gång med fosfatas tvättbuffert (30 mM Hepes pH 7,4 och 120 mm NaCl). Ta bort supernatanten helt.
  2. Tillsätt 100 µL analysbuffert (30 mM Hepes vid pH 7.4, 120 mM NaCl, 5 mM DTT, 10 mM p-nitrophenylphosphate) i pärlor och inkubera vid 30 ° C under 30 minuter under försiktig skakning. Obs: Inkubationstiden kan variera, men vänta tills bufferten blir gul vid Defosforylering.
  3. Till avsluta reaktionen, tillsätt 50 µL av 1 M NaOH när bufferten blir gul.
  4. Snurra ner vid 2500 x g i 10 s och överföring 50 μl av supernatanten till två brunnar (dubbletter med 50 µL per brunn) av halv-område i en plattan med 96 brunnar. Läs av absorbansen vid 405 nm.
  5. Uttryck resultatet som relativ optiska densitet (OD) över den kontroll vildtyps-versionen av PD-1-GFP.

5. SHP2 Western Blot analys

  1. Snurra ner pärlorna och avlägsna supernatanten.
  2. Tillsätt 20 µL av 2 x Laemmli buffert (se Material tabell) till pärlor och koka vid 95 ° C i 5 min.
  3. Mätning av protein koncentrationen av ingående kontroller (andra uppsättningen) använder en BCA kit (se Material tabell). Överföra 30 µL av det mest utspädda provet till en ny tub. Späd ut resten av de ingående kontrollerna med lyseringsbuffert samma koncentration som det mest utspädda provet och överföra 30 µL från var och en av dem till en ny tub.
    Obs: Efter detta steg, kommer det att finnas 4 rör med 30 µL varje, vid liknande protein koncentrationer, som representerar indata styr lysates.
  4. Lägg till lika stora volymer av 2 x Laemmli buffert i lysates och koka vid 95 ° C i 5 min. snurra ner pärlorna och ladda supernatanten på 4 – 20% SDS-PAGE Tris-baserade gel (se Material tabell) för western blot analys. Dessutom lasta 50 µL från varje prov av andra set.
  5. Fortsätt western blot analys enligt protokollet tidigare beskrivits12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Medan bidraget av ITSM av PD-1 till SHP2 bindande är etablerad, är rollen av svart av PD-1 mindre tydlig. Eftersom SHP2 har två SH2-domäner som kan binda till två sekventiella phosphotyrosines på PD-1 (en tyrosin i ITSM) och en annan i svart, vi hade en hypotes att den ITSM av PD-1 ankare SHP2 till PD-1, medan den svart av PD-1 underlättar SHP2 aktivitet genom att stabilisera sin öppna konfirmerande stat11,14. För att testa detta, har vi utvecklat en kombinerad co-immunoprecipitation och enzymatisk aktivitet assay för parallella bedömningen av receptor-enzym interaktioner och aktivering. Vildtyp GFP-PD-1, GFP-PD-1 Y223F (svart mutant), eller GFP-PD-1 Y248F (ITSM mutant) uttrycktes i HEK 293T celler som behandlades därefter med pervanadate (figur 1), leder till fosforylerade PD-1 svansar. PD-1 proteiner samlades in med hjälp av anti-GFP belagda pärlor. Dessa pärlor användes för SHP2 co-immunoprecipitation från lysates av celler överuttryck SHP2. Nivåerna av SHP2 bundna till varje version av PD-1 och dess enzymatiska aktivitet registrerades.

Föga förvånande SHP2 gick inte att binda till PD-1 när ITSM var muterad (Y248F; Figur 2A). Anmärkningsvärt är inhiberad den muterade versionen av svart (Y223F) SHP2 bindande endast i begränsad omfattning (figur 2B). SHP2 fosfatas aktivitet analysen avslöjade dock att svart och ITSM var lika oumbärlig för den enzymatiska aktiviteten (figur 2 c). Eftersom PD-1 immunoprecipitates kan innehålla andra fosfataser, förutom SHP2, använde vi en kontroll skick (figur 2B och 2 C, blå) där SHP2 inte var i ökad utsträckning.

Därför, en två-stegs aktiveringen modell avslöjas där SHP2 viks in i en auto-hämmade konformation under vila villkor (figur 2D, vänster). Vid aktivering av PD-1 rekryteras SHP2 till den fosforylerade ITSM (figur 2D, mitten). SVART måste dock också vara fosforyleras att veckla ut SHP2 till dess aktiv konformation (figur 2D, höger).

Figure 1
Figur 1: strategi och försöksbetingelser. GFP-PD-1 WT (vildtyp), GFP-PD-1 Y223F (svart mutant), eller GFP-PD-1 Y248F (ITSM mutant) uttrycktes i HEK 293T celler som behandlades därefter med pervanadate. Fosforyleras GFP-PD-1 proteiner som samlas in av GFP immunoprecipitation blandades med lysates från celler överuttryck SHP2 och nivåer och aktiviteten av SHP2 bundna till varje version av PD-1 spelades in. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: The svart av PD-1 är nödvändigt för SHP2 aktivitet. HEK 293T celler var transfekterade med de angivna versionerna av GFP-PD-1, följt av pervanadate behandling och immunoprecipitation använder anti-GFP mAb-agaros (en). SHP2 nivåer bunden till utfällda GFP-PD-1 var kvantifierade (b) och utsätts för ett fosfatas aktivitet assay (c). Värden av drog ner SHP2 var normaliserade till GFP uttryck nivåer. Alla värden är jämfört med intensiteten av utfällda SHP2 av WT GFP-PD-1 (vildtyp)-faldig förändring. Fosfatas aktivitet värden är jämfört med aktiviteten av co-immunoprecipitated SHP2 av WT GFP-PD-1-faldig förändring. RU = relativa enheter. (d) två-stegs aktiveringen modellen. Först SHP2 rekryteras till ITSM, och först då binder den andra SH2-domänen till den svart av PD-1, som sträcker sig den katalytiska domänen av SHP2 till fullt aktiv konformation. Data presenteras som medelvärde ± SEM. asterisker representerar betydande skillnader mellan gruppen betecknas och WT PD-1 (b och c): **p < 0,01, ***p < 0,001, oparat t-test, n = 3. Tillåtelse att använda data från Peled o.a. (2018) 12 beviljades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Receptor-enzym interaktioner är avgörande för Intracellulär signalering. Många enzymer rekryteras till receptorer genom SH2 domäner bindande till fosforylerade tyrosines som pryder svansar av samma receptorer. Men enzymer är ofta vikta till stängda inaktiva konformationer och aktiveringen kräver en conformationaländring11 som kan medlas av andra domäner i samma receptor. Analysen beskrivs här åtgärder interaktioner mellan receptorer, enzymer samt aktivitet induceras av dessa interaktioner.

Vi använde en kolorimetrisk test som använder p-nitrophenylphosphate (pNPP) som substrat för SHP2. pNPP är en icke-selektivt substrat och fosfor givare som frigörs genom ett stort antal enzymer15. Fosforyleras rekombinanta peptider kan fungera som alternativa substrat (t.ex., de liknar de används i malakitgrönt analysen). Dessa peptider är mer specifika när det gäller fosfatasaktiviteten; dock är det dyrare, och på grund av dess känslighet, den kan endast utföras i fosfatfria lösningar. En annan metod att kringgå bristande specificitet mot pNPP är att inkludera en kontroll cellinje där den ifrågavarande fosfatas är utslagen. Överuttryck av SHP2 kommer att vara den enda källan för enzymet i dessa celler, och varje ökning av fosfatasaktiviteten bör tillskrivas specifikt den alltför uttryckt fosfatas. En tredje metod är att använda ett renat epitop-taggade SHP2 protein och renat epitop-taggade PD-1 istället för WCL kompletteras med phosphopeptides som substrat. Ett alternativ till att använda en phosphopeptide som substrat är att använda en phosphoprotein istället, och sedan Defosforylering av protein kan upptäckas av en phospho-specifika antikroppar eller phos-tag SDS-PAGE.

Ännu viktigare, kan den metod som beskrivs här belysa andra receptor-enzym interaktioner biologi. Det kan exempelvis avslöja funktionen av tyrosin rester i SLAM familj receptorer, som har befunnits vara försumbar för interaktioner med SHP216 men kan faktiskt vara krävs för aktivering av samma enzym. Denna metod kan också tillämpas på andra fosfataser samt receptor-interagera kinaser.

Även denna metod är relativt enkelt, är det viktigt att notera när fosfatas-hämmare bör undvikas. Dessa är nödvändiga i det inledande steget i fosforylering induktion av PD-1, men senare de måste tas bort för att testa SHP2 fosfatas verksamhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta projekt har finansierats av NIH Grants 1R01AI125640-01 och reumatologi Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Lonza 17-516F Phosphate Buffered Saline
Microcentrifuge Eppendorf 5424-R 1.5 mL
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red Gibco 25200114
Heat Inactivated FBS Denville FB5001-H Fetal bovine serum
Penicillin / Streptomycin Fisher BP295950
DMEM high glucose without L-glutamine Lonza BE12-614F
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305
Anti-SHP2 Santa Cruz SC-280
Anti–GFP-agarose MBL D153-8
Anti-GFP Roche 118144600
Anti-Actin Santa Cruz SC-1616
HEK-293 cells ATCC CRL-1573
Orthovanadate Sigma S6508
H2O2 Sigma 216763 30%
Protease inhibitor cocktail Roche 11836170001 EDTA-free
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x) Invitrogen LC2676 Modified Laemmli buffer
4-20% Tris-Glycine Mini Gels Invitrogen XP04205BOX 15-well
Nitrocellulose membranes General Electric 10600004
NaCl Sigma S7653 Sodium chloride
HEPES Gibco 15630080 N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid
DTT Invitrogen D1532 Dithiothreitol
pNPP Sigma 20-106 p-Nitrophenyl Phosphate
NaOH Sigma S8045 Sodium hydroxide
BCA Fisher 23225 Bi Cinchoninic Acid assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17, (1), (2018).
  2. Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153, (1), 42-50 (2018).
  3. Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135, (2), 564-567 (2015).
  4. Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173, (2), 945-954 (2004).
  5. Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5, (230), 46 (2012).
  6. Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (45), (2007).
  7. Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209, (6), 1201-1217 (2012).
  8. Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355, (6332), 1428-1433 (2017).
  9. Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574, (1-3), 37-41 (2004).
  10. Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (24), 13866-13871 (2001).
  11. Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
  12. Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (3), E468-E477 (2018).
  13. Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28, (1), 25-30 (2009).
  14. Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270, (7), 2897-2900 (1995).
  15. McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 18, Unit18 18 (2010).
  16. Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166, (9), 5480-5487 (2001).
Co-immunoprecipitation analysmetod för att studera funktionella interaktioner mellan receptorer och enzymer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peled, M., Strazza, M., Mor, A. Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes. J. Vis. Exp. (139), e58433, doi:10.3791/58433 (2018).More

Peled, M., Strazza, M., Mor, A. Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes. J. Vis. Exp. (139), e58433, doi:10.3791/58433 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter