Summary
Macropinocytosis, store uspecifikke væske optagelse, er vigtige i mange områder af klinisk biologi herunder immunologi, infektion, kræft og neurodegenerative sygdomme. Her, er eksisterende teknikker blevet tilpasset til at give høj overførselshastighed, encellede opløsning måling af macropinocytosis i macropinocytosis model organisme Dictyostelium discoideum benytter flow flowcytometri.
Abstract
Store ikke-specifikke væske optagelsen af macropinocytosis er vigtig for spredningen af visse kræftceller, antigen prøveudtagning, vært celle invasion og spredning af neurodegenerative sygdomme. De almindeligt anvendte laboratorium stammer af amoeba Dictyostelium discoideum har ekstremt høje væske optagelse priser når der dyrkes i næringsstof medium, over 90% der er på grund af macropinocytosis. Derudover findes mange af de kendte kernekomponenter af pattedyr macropinocytosis også, hvilket gør det en fremragende modelsystem for at studere macropinocytosis. Her, er den standard teknik til at måle internaliseret væske ved hjælp af fluorescerende dextran som en etiket, der tilpasset en 96-brønd plade format, med prøverne analyseres ved flowcytometri ved hjælp af en høj overførselshastighed prøveudtagning (HTS) vedhæftet fil.
Celler er fodret ikke-quenchable fluorescerende dextran for et forud fastsat tidsrum, vaskes ved nedsænkning i iskold buffer og adskilt ved hjælp af 5 mM natriumazid, som også stopper exocytose. Celler i hver brønd er derefter analyseret ved flowcytometri. Metoden kan også tilpasses måle membran optagelse og fagocytose af fluorescerende perler eller bakterier.
Denne metode var designet til at tillade måling af væske optagelse af Dictyostelium i en høj overførselshastighed, arbejdskraft og ressource effektivt. Det giver mulighed for samtidige sammenligning af flere stammer (f.eks knockout mutanter af et gen) og betingelser (fx celler i forskellige medier eller behandlet med forskellige koncentrationer af inhibitor) parallelt og forenkler tid-kurser.
Introduction
Store ikke-specifikke væske optagelsen af macropinocytosis er vigtige i flere biologiske sammenhænge1, herunder antigen prøveudtagning af immun celler2, patogen ibrugtagning vært celler3, kræft celle spredning4 og den spredning af prion sygdomme5. I pattedyr og Dictyostelium celler, actin6,7, PI (3,4,5) P38,9,10 (selv om den nøjagtige karakter af lipid adskiller sig mellem de to11), aktiveret RAS12,13, og aktiveret Rac14,15 er vigtige for effektiv væske optagelsen af macropinocytosis, selv om der stadig er mange ubesvarede spørgsmål om, hvordan macropinocytic patch er dannet, organiseret og i sidste ende internaliseret. At opdage mere protein vigtige for macropinocytosis, og efterfølgende bestemmelse af hvordan de er vigtige i de forskellige biologiske sammenhænge, vil give en mere omfattende forståelse af macropinocytosis og potentielt giver mulighed for udvikling af målrettede behandlinger for en række betingelser.
Dictyostelium er en ideel modelsystem for at studere macropinocytosis. Det høje niveau af konstituerende macropinocytosis i standard laboratorium stammer betyder, at væske optagelsen er over 90% på grund af macropinocytosis6. Dette giver mulighed for macropinocytosis skal måles alene ved at bestemme væske optagelse, i modsætning til pattedyrceller, hvor andelen af flydende udbredelse på grund af macropinocytosis er meget lavere. At macropinocytosis er så veldefineret og let visualiseret12 i dette system ligeledes tilbyder forskellige fordele for at undersøge kerne bevarede komponenter af macropinosome over andre systemer hvor der kan være flere regulerende signaler 16 , 17.
Standard teknik, der anvendes til at måle macropinocytosis af pattedyrceller indebærer fastsættelse af celler efter pulserende med dextran for en kort periode efterfulgt af mikroskopi til at bestemme området af en celle, der er besat af dextran-positive vesikler18. Denne teknik tager dog ikke højde for muligheden for macropinosomes faldende ved ankomsten til den celle, der er blevet rapporteret i Dictyostelium19, og kun tager hensyn til enkelt fly af den celle, hvilket betyder den mængde internaliseret er uklart. En alternativ teknik, tælle antallet af macropinosomes internaliseret i en given tid, har den samme ulemper20. Ved hjælp af Dictyostelium undgår disse problemer; eksisterende teknikker til at måle væske optagelsen af Dictyostelium er dog relativt arbejdsintensive, ved hjælp af en stor mængde af både celler og dextran21. Celler er rystet på høj tæthed i fluorescerende dextran og prøver fjernet på forskellige tidspunkter for bestemmelse af den internaliseret fluorescens ved hjælp af en fluorimeter. Celler tilberedt på denne måde kan analyseres ved flowcytometri at få enkelt celle, i stedet for befolkningsniveau, opløsning22, selv om dette stadig lav-overførselshastighed.
Her, er den standard teknik til at måle internaliseret væske ved hjælp af fluorescerende dextran som en etiket, der tilpasset en 96-brønd plade format, med prøverne analyseres ved flowcytometri ved hjælp af en høj overførselshastighed prøveudtagning (HTS) vedhæftet fil. Celler er fodret ikke-quenchable fluorescerende dextran for et forud fastsat tidsrum, vaskes ved nedsænkning i iskold buffer og adskilt ved hjælp af 5 mM natriumazid, som også stopper exocytose. Celler i hver brønd er derefter analyseret ved flowcytometri. Denne metode var designet til at overvinde begrænsningerne af de ovenfor nævnte metoder og tillade samtidige sammenligning af væske optagelsen af et stort antal stammer/betingelser samtidig ved hjælp af færre ressourcer og reducere arbejdskraft involveret.
Protocol
1. forberedelse af celler og materialer
- Dyrke celler enten på SM agar plader sammen med bakterier såsom Klebsiella aerogenes, eller i næringsstof medie som HL5 som beskrevet23.
Bemærk: Voksende knockout mutanter, der er defekt i macropinocytosis på bakterier hjælper med at forhindre ophobning af sekundære mutationer, der kan øge hastigheden af macropinocytosis. Holde nedenstående 4 nummer/passage efter plating celler fra bestande for optimale resultater. Mutanter skal opbevares som frosne bestande hurtigst muligt efter isolation. - For at dyrke celler på SM agar plader, vokse K. aerogenes til sammenløbet i SM medium. Tilsæt 200 – 300 μL af bakterier på en SM agar plade og spredes. Tage en steril loop af celler (ved overførsel fra en anden bakteriel plade) og fordelt på kanten af pladen. Inkuber ved 22 ° C i op til en uge.
- Opløse Tetra-methyl-rodamin isothiocyanat (TRITC-) dextran til 50 mg/mL i vand, filter med 0,22 μm filtre i 1 mL alikvoter og opbevares ved-20 ° C. Delprøver kan opbevares på ubestemt tid.
Bemærk: 155 kDa er typisk størrelse bruges sammen med denne metode, som det kan købes billigt i bulk, men mindre dextrans måle macropinocytosis lige så effektivt i Dictyostelium24. Forskellige ikke-quenchable dextrans, såsom cascade blå eller Alexa-647, er alternativer, hvis forskellige fluorophores er påkrævet.
2. konvertere kvalitative målinger i kvantitative (valgfri)
-
Udføre en flydende optagelse assay ved hjælp af celler i suspension.
- Pellet axenically voksende celler ved 300 x g i 3 min, supernatanten og resuspend i næringsstof medium til 1 x 107 celler/mL. Tilføj TRITC-dextran til 0,5 mg/mL og omrystes på 180 rpm, 22 ° C.
- Fortynd 0,8 mL prøver til 0,7 mL iskold KK2 på 0, 30, 60, 90, 120 min. vask en gang i 1,5 mL iskold KK2 buffer23 i en benchtop centrifuge, resuspend til 1 mL i den samme buffer og opbevares på is.
Bemærk: vask straks eller når alle prøver er blevet indsamlet giver tilsvarende resultater.
-
Bestemme mængden af væske internaliseret af celler.
- Sæt fluorimeter til at måle fluorescens ved hjælp af en excitation boelgelaengden 544 nm og emission bølgelængde af 574 nm med en 10 nm slids. Oprettet en fortyndingsrække af TRITC-dextran og bruge det til at måle fluorescens for bestemte mængder af dextran. Oprette en kalibreringskurve.
- Måle fluorescens internaliseret af celler i afsnit 2.1 med 0,9 mL cellesuspension. Beregne mængden af væske internaliseret pr. celle ved hjælp af kalibrering kurve24.
- Fortynd den resterende del af celler fra hvert tidspunkt separat i 0,5 mL is kold KK2. Der filtreres gennem et 70 µm celle si i 5 mL polystyren flow flowcytometri rør. Angive flow forskellige, så celler fra hvert tidspunkt adskiller sig fra hinanden og optage deres fluorescens (Se afsnit 3.4 og 3.5).
- Måle fluorescens af kalibrering perler i flow Flowcytometret ved hjælp af indstillingerne og optage den.
Bemærk: Dette er reference for alle fremtidige fluorescens målinger på flow-Flowcytometret: før du bruger igen køre perlerne og justere indstillingerne, så de har den samme fluorescens. Dette vil give et meget snævert definerede peak. At sætte en gate omkring fluorescens peak kan gøre dette lettere. - Gentag tre gange og plot celle fluorescens oplysningerne i punkt 2.2 og 2.3 mod hinanden. Afbilde en linje af bedste pasform og bruge ligningen til at konvertere de kvalitative data fra flowcytometri til kvantitative enheder.
3. måling af væske optagelse
Figur 1: skematisk af høj overførselshastighed måling af macropinocytosis. (A) Grow Dictyostelium på en SM plade seedede med K. aerogenes bakterier (gul). Høste celler fodring forfra (orange), at undgå celler, der er allerede udviklet (grøn), i 25 mL af KK2 buffer. Vortex at adskille, pellet ved 3 min centrifugering ved 300 x g, så vask 3 gange i 50 mL af KK2 buffer, udsmid supernatanten hver gang. Resuspend til 1 x 105 celler/mL i HL5 vækstmediet og tilsæt 50 µL i tre brønd pr. stikprøve af en flad bund 96-brønd plade. Der inkuberes ved 22 ° C til 24 h. (B) fortyndet TRITC-dextran til 1 mg/mL i HL5 vækstmediet fra en stamopløsning i 50 mg/mL. Tilsæt 50 µL til hver prøve (undtagen 0 min optagelse kontrol wells), og Inkuber ved 22 ° C i 1 h, efter som tilføjes 0 min optagelse kontrol af dextran. (C) øjeblikkeligt dekanteres medierne, klappe plade på en væv til at fjerne overskydende medium og nedsænkes i et bad af iskold KK2 buffer, fylde brøndene at vaske. Dekanteres bufferen og dup tør igen. Tilsæt 100 µL af 5 mM natriumazid opløst i KK2MC Adskil celler. Tage til at flyde forskellige for måling af internaliseret fluorescens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
-
Oprette en fladbundet 96-brønd vævskultur plade (figur 1A). Bruge celler dyrkes på bakterier og at overføre dem til HL5 medium (indeholdende 100 µg/mL dihydrostreptomycin, 100 µg/mL ampicillin og 50 µg/mL kanamycin) 24 h før analysen; Dette gør det muligt for macropinocytosis at være upregulated fra lavt set i celler dyrket på bakterier24. Alternativt, fortyndes celler direkte fra axenic kultur, inkubation i 24 timer før analysen, at reducere antallet af fejl på grund af cellerne bliver fortyndet fra forskellige tætheder.
- Høst celler fra fodring forsiden til 25 mL af KK2 i et 50 mL-centrifugerør. Adskille celler af vortexing og pellet ved 300 x g i 3 min.. Supernatanten, resuspenderes og vask 3 gange på 300 x g i 3 min. i 50 mL af KK2, udsmid supernatanten hver gang til at fjerne bakterier.
- Bestemme den celle massefylde (ved hjælp af en hemacytometer eller anden celle optælling system) og fortyndes til HL5 indeholdende antibiotika til 1 x 105 celler/mL. Tilsæt 50 μl i hver brønd, ved hjælp af tre brønde for hver betingelse. Der inkuberes ved 22 ° C til 24 h. Husk at oprette en 0 min optagelse kontrol.
NOTE: En alternativ medium, fx SIH, VL6 kan bruges i stedet.
-
Indlæse celler med TRITC-dextran (figur 1B).
- Fortynd dextran til 1 mg/mL i de anvendte medium (dette kan øges til 2,5-5 mg/mL ved vurderingen af celler med meget lav optagelse). Tilsæt 50 μl til hver brønd (hvilket giver en endelig koncentration på 0,5 mg/mL TRITC-dextran) og returnere pladen til 22 ° C i 1 time, som dette giver mulighed for betydelige dextran ophobning men exocytose af dextran er endnu ikke begyndt.
Bemærk: en repeater pipette tillader dette skridt skal gøres hurtigere, reducere fejl.
- Fortynd dextran til 1 mg/mL i de anvendte medium (dette kan øges til 2,5-5 mg/mL ved vurderingen af celler med meget lav optagelse). Tilsæt 50 μl til hver brønd (hvilket giver en endelig koncentration på 0,5 mg/mL TRITC-dextran) og returnere pladen til 22 ° C i 1 time, som dette giver mulighed for betydelige dextran ophobning men exocytose af dextran er endnu ikke begyndt.
-
Forberede celler til flowcytometri (figur 1 c).
- Umiddelbart forud for vask, tilføje 50 μL dextran-holdige medier til 0 min optagelse kontrol.
- Dekanteres medium og dup dem tørre på en væv. Vaskes ved nedsænkning plade i iskold KK2, derefter dekanteres.
Bemærk: nogle stammer med overholdelse af defekter kan løsne under dette trin, f.eks. en knockout af begge homologs af Kamilla (talA-/ talB -)25. Vær forsigtig, når du arbejder med cellelinjer, der lægger dårligt og Opsug medier, hvis det kræves. - Tilsæt 100 μL af iskold 5 mM natriumazid opløst i KK2MC (KK2 + 2 mM MgSO4 og 100 μM CaCl2).
Forsigtig: Natriumazid er meget giftig. Brug en støvmaske og beskyttelsesbriller, når du arbejder med pulveret. Altid bære handsker og laboratoriekittel. Undgå varme og må ikke blandes med syre.
Bemærk: Celler frigøre hurtigt og exocytose er forhindret24. Et mikroskop kan bruges til at kontrollere dette.
-
Foranstaltning væske optagelse ved flowcytometri
- Hvis planlægger at konvertere relative værdier til absolutte dem, skal du bruge perler for at standardisere flow forskellige indstillinger (Se afsnit 2). Alternativt, brug celler fyldt med dextran som i punkt 2 til at sikre, at forward scatter og side scatter er indstillet korrekt til at isolere cellerne (figur 2A), at sikre, at maskinen ikke er blokeret, (figur 2B) og justere parametre til måle den internaliseret fluorescens (figur 2 c).
- Vedhæfte høj overførselshastighed prøveudtagningssystemet og tilføje plade. Oprette en protokol til at måle fluorescens (for TRITC-dextran bruge en gul-grøn laser til at ophidse og måle i 582 nm kanalen eller lignende) på op til 65 μL cellesuspension og køre.
-
Analysere flow flowcytometri resultater
- Gate på celler ved hjælp af forward scatter og side scatter (figur 2A). Beregne den mediane fluorescens af celler ved hjælp af indstillingen statistik. Angiv disse parametre ved hjælp af en stikprøve og gælder for alle prøver.
Bemærk: Forward scatter/side scatter profiler kan variere mellem prøver ved brug af forskellige mutanter eller hæmmere. - Bestem middelværdien af de tre brønde for hver betingelse og Subtraher 0 min optagelse kontrol. Enten konvertere til kvantitative værdier ved hjælp af ligningen, der er fastsat i afsnit 2 eller normalisere til kontrolelementet.
- Gate på celler ved hjælp af forward scatter og side scatter (figur 2A). Beregne den mediane fluorescens af celler ved hjælp af indstillingen statistik. Angiv disse parametre ved hjælp af en stikprøve og gælder for alle prøver.
4. udførelse af væske optagelse gang-kurser
- Angive celler som i afsnit 3, med tre brønde for hvert tidspunkt og stamme/tilstand.
- Tilføje dextran mærket medium til de forskellige brønde sekventielt. Et typisk tidsforløb måler flydende optagelse på 0, 30, 60, 90, 120, og 180 min. tilføje dextran-holdige medium for 180 min. tidspunkt wells, fulgt 60 min senere ved at føje det til brønde for 120 min tidspunkt, etc. (figur 3A).
- På 0 min, tilsættes 50 μL dextran-holdige medium og straks dekanteres og vaske pladen som i afsnit 3.3. Analysere som beskrevet i afsnit 3.5.
5. dosis/respons-kurver
- Angive celler som beskrevet i afsnit 3, med tre brønde for hver stamme og tilstand.
- Fortynd sammensat af interesse i medium indeholdende 1 mg/mL dextran på dobbelt den ønskede maksimale endelige koncentration af stoffet. Forberede et andet rør indeholdende medium med dextran med den samme andel af køretøjet som først. Vortex at blande.
- Oprette en fortyndingsrække af sammensat af interesse i 200 μl dextran indeholdende medium pr. sample (figur 4A). Vortex at blande. Tilsæt 50 μL af medium til hver prøve godt for 1 h.
- Vask og analysere som beskrevet i afsnit 3.3 og fremefter.
6. fagocytose og membran optagelse
- For at måle membran optagelse, forberede cellerne som beskrevet i afsnit 3. Tilsæt 50 μL af medium indeholdende 20 μM FM 1-43 til en slutkoncentration på 10 μM. Efter ladning, vaske og forberede celler til flowcytometri som i afsnit 3.3. Måle i 585 nm kanalen eller lignende, ved hjælp af en blå laser til at vække.
Bemærk: Som membran handel er hurtigere end væske-fase, 10 min er et mere passende tidspunkt at bruge end 1 h26. Alternative farvestoffer, der fluorescerer, når indarbejdet i membranen kan bruges i stedet. -
Bruge enten fluorescently mærket perler eller bakterier til at måle fagocytose. Fluorescerende gær kan ikke bruges, som de er uadskillelige fra Dictyostelium af fremad og side scatter24. Angive celler som beskrevet i afsnit 3 og analysere som beskrevet27.
- For at måle fagocytose af perler tilføje gul-grøn mærket perler som beskrevet i afsnit 3.2 til en endelig koncentration på 5 x 107 perler/mL (1,75 og 2 μm) eller 1 x 108 perler/mL (1 og 1,5 μm) i 1 time før vask og forberede flowcytometri som i afsnit 3.3. Måle i 525 nm kanalen eller lignende, ved hjælp af en blå laser til at vække.
Bemærk: Højere koncentrationer vil føre til celle detachement. - For at måle fagocytose af bakterier, tilføje Texas-rød mærket Escherichia coli bioparticles som beskrevet i afsnit 3.2 til 1 x 108 bakterier/mL til 1 time før vask og forberede flowcytometri som i afsnit 3.3. Måle på 610 nm kanalen eller lignende, ved hjælp af en gul-grøn laser til at vække.
- For at måle fagocytose af perler tilføje gul-grøn mærket perler som beskrevet i afsnit 3.2 til en endelig koncentration på 5 x 107 perler/mL (1,75 og 2 μm) eller 1 x 108 perler/mL (1 og 1,5 μm) i 1 time før vask og forberede flowcytometri som i afsnit 3.3. Måle i 525 nm kanalen eller lignende, ved hjælp af en blå laser til at vække.
Representative Results
Når teknikken er blevet udført og celler er lastet med dextran og klar til analyse (figur 1), sikre flow forskellige ikke er blokeret og justere forward scatter/side scatter profil til at ligne de celler, der er vist i figur 2A. Hvis maskinen er blokeret, det ser mere som vist i figur 2B og skal være ikke-blokerede før du fortsætter. Sikre parametrene vis kontrol axenic celler har høj internaliseret dextran fluorescens i længere tidspunkter og lav internaliseret fluorescens på kortere dem (fig. 2 c).
Når man ser for forskelle mellem mutanter, er det sandsynligt, at der vil være en af tre fænotyper. Mutanter kunne have normal væske optagelse, de kunne have en delvis defekt eller væske optagelse kunne være helt afskaffet. Figur 2D viser en stamme med normal væske optagelse, i dette tilfælde standard laboratorium stammen Ax2, en mutant med en ~ 50% fald i væske optagelse (Ax2 rasG-14) og en med afskaffet væske optagelse (Ax3 gefB-28). Opnå den gennemsnitlige mediane væske optagelse (punkt 3.5) og bruge det til enten beregne mængden af væske internaliseret (som i figur 3B) eller til at sammenligne data til et kontrolelement (som i figur 4B og 4 C).
Når du udfører en væske optagelse tidsforløb, som i figur 3A, den internaliseret fluorescens bør øge til 60-90 min., hvorefter dextran begynder at være exocytosed og et plateau nås (figur 3B). Hjælp af 60 min som normaltid, når sammenligne macropinocytosis i forskellige mutanter/betingelserne derfor giver et godt signal skal nås, og ingen signal er tabt på grund af exocytose. Mutanter hvor exocytose er alvorligt hindret kan tage længere tid at nå et plateau29.
Hvornår behandling af celler med hæmmere, der er effektive mod macropinocytosis i Dictyostelium (sæt op som i figur 4A), dextran internaliseret i 1 h vil gå ned til næsten ingenting på højere hæmmer koncentrationer i fleste tilfælde (Figur 4B). Nogle hæmmere kan ikke være 100% effektive, men fx nocodazole kun hæmmer op til 50% af væske optagelsen af macropinocytosis når tilføjet akut (figur 4 c). Hvis hæmmere ikke er effektive, cellerne vil internalisere en lignende mængde af dextran som kontrolelementet, og et fald i fluorescens vil ikke ses. Denne teknik giver mulighed for en lang række forskellige hæmmere og hæmmer koncentrationer skal screenes for effekter på væske optagelsen af macropinocytosis meget hurtigt, at reducere den tid at optimere inhibitor behandling.
Figur 2: nedsat flow forskellige og repræsentative data. (A) forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) profiler af celler skal indstilles, så cellerne kan skelnes let. Er vist et eksempel på hvordan Ax2 celler skal se ud. (B) hvis flow-Flowcytometret er blokeret, som i dette eksempel, cellerne har meget lav side scatter. Laser vil ikke vække fluorophores korrekt og maskinen bør ublokerede før du fortsætter. Data opnået mens maskinen blev blokeret skal kasseres. (C) fluorescens bør indstilles så en 0 min optagelse prøve har lav fluorescens, hvilket øger når cellerne har været inkuberet længere i fluorescerende medium, som vist i dette eksempel taget fra Williams & Kay 201824. (D) eksempler på celler, der har været inkuberet med TRITC dextran for 1 h med normal macropinocytosis (Ax2, grønne), reduceret macropinocytosis (Ax2 rasG -, HM172614, orange) og afskaffet macropinocytosis (Ax3 gefB -, HM177628, blå). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: udfører væske optagelse gang-kurser i 96-brønd plader. (A) Dextran skal føjes til hvert sæt af prøver sekventielt, med den samme sluttidspunkt. Brøndene vaskes derefter, løsne og måle den internaliseret fluorescens ved flowcytometri. Eksempel gange hen til sammenlægge dextran er vist her. (B) væske optagelse gang-kursus Ax2 celler udføres i 96-brønd plader. Taget fra Williams & Kay 201824, Vis fejllinjer standardfejl for tre uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: væske optagelse dosis/respons-kurver. (A) tilføje sammensatte af interesse, i dette tilfælde PI3K hæmmer LY294002, til HL5 indeholdende 1 mg/mL TRITC-dextran på dobbelt den ønskede endelige maksimale koncentration. Bland med HL5 vækstmediet + 1 mg/mL dextran indeholdende køretøj alene i forskellige proportioner til at generere en fortyndingsrække af 200 µL medium pr. betingelse. Tilføje brønde som normale for 1 time før vask og måle internaliseret fluorescens. (B) væske optagelse dosis responskurve til Ax2 cellerne inkuberes med den LY294002-holdige medium fra A. Tilpasset fra Williams & Kay 201824. Flydende udbredelse er normaliseret til en ubehandlet kontrolkultur. Fejllinjer Vis standardfejl for tre uafhængige forsøg. (C) væske optagelse dosis responskurve til Ax2 cellerne inkuberes med nocodazole. Tilpasset fra Williams & Kay 201824. Flydende udbredelse er normaliseret til en ubehandlet kontrolkultur. Fejllinjer Vis standardfejl for tre uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Andre metoder til at vurdere væske optagelse er lav dataoverførselshastighed, vaske cellerne i situ og brugen af natriumazid Adskil celler er de kritiske trin i denne metode, som tillader høj overførselshastighed måling af macropinocytosis, membran optagelsen, eller fagocytose af Dictyostelium. Som cellerne er knyttet til en overflade og mediet er ikke, kan de venstre knyttet mens medium omkring dem er først smidt ud og derefter ændret ved nedsænkning i buffer og smidt ud igen. Natriumazid, som dræner cellulære ATP og depolarizes membran30, bruges derefter til at frigøre cellerne, og forhindrer også exocytose uden at påvirke celle levedygtighed24.
Mens bruger flowcytometri til at måle macropinocytosis af Dictyostelium giver en meget nøjagtig måling af væske optagelse meget hurtigt for at fastslå grunden til hvorfor en bestemt stamme eller betingelse har ændret væske optagelse, yderligere undersøgelse ved hjælp af mikroskopi er påkrævet24. Det skal også bemærkes at tidligere offentliggjorte resultater har, i nogle tilfælde vist en forskel i væske optagelse af mutantstammen dyrkes enten på en overflade (som i dette tilfælde), eller i ryster suspension (som i standard-protokol)31. Ved hjælp af denne metode kan betyde, at, i sjældne tilfælde, tilsyneladende flydende optagelse defekter er savnet. Derudover når du måler fagocytose, kan kun lave koncentrationer af partikler bruges. Den maksimale sats for fagocytose, som kan bestemmes med denne teknik er langt under det virkelige maksimum, selvom det er stadig muligt at måle relevante forskelle i fagocytose mellem stammer og betingelser24. For at bestemme den maksimale sats for fagocytose, skal optagelsen måles i ryster suspension af en alternativ protokollen27. Celler, der har phagocytosed perler steget side scatter, så dette bør være korrigeret for tilsvarende når du konfigurerer flow forskellige.
Flowcytometri kan bruges til at måle væske optagelse i pattedyrceller32, men den højere andel af væske fase optagelsen af andre endocytic veje, end set i Dictyostelium er en bekymring. Derudover er celler typisk adskilles ved hjælp af trypsin ved 37 ° C, så yderligere endocytic progression af internaliseret dextran. Iskold natriumazid forårsager ikke makrofager at løsne sig fra en overflade (Williams, upubliceret observation), hvilket gør denne teknik ikke finder anvendelse på pattedyrceller uden yderligere optimering.
Høj overførselshastighed måling af macropinocytosis har potentiale til at blive anvendt til at screene hurtigt og billigt for virkningerne af hæmmere, genetiske mutation eller gen knockdown på Dictyostelium celler. Mutanter bør altid være i forhold til deres direkte overordnet kun. Hvis læseren har ingen forudgående præference for Dictyostelium stamme, ikke-axenic stammer som DdB eller NC4 er mere "wild-type" end axenic og kan manipuleres så effektivt som axenic stammer33. Ellers Ax2 stammer er de axenic stammer med de færreste genom gengangere34, mens mange stammer af Ax4 Talin A knockouts og bør undgås om muligt23. De fleste tidligere udgivne stammer kan bestilles fra Dicty Stock Center35.
Denne teknik giver mulighed for større efterforskningsmæssige muligheder end det var tidligere muligt i virkningerne af forskellige betingelser, hæmmere og mutationer på macropinocytosis af Dictyostelium.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.
Acknowledgments
Vi takker de medicinske Forskningsråd UK for core finansiering (U105115237) til RRK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR_II flow cytometer | BD Biosciences | - | Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD |
| TRITC-dextran (155 kDa) | Sigma-Aldrich | T1287 | Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine |
| HL5 medium | Formedium | HLGCFG | |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3596 | Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work |
| Dihydrostreptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1517 | |
| Ampicillin sodium | Formdium | AMP50 | |
| Kanamycin monosulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Sodium azide | VWR | 103694M | |
| Magnesium sulfate hydrate | VWR | 25169.295 | |
| Calcium chloride dihydrate | VWR | 1.02382.0250 | |
| Potassium dihydrogen phopshate | VWR | 1.04877.1000 | |
| Di-potassium hydrogen phosphate | VWR | 1.05104.1000 | |
| Fluorimeter | Perkin-Elmer | LS 50 B | |
| FM1-43 | Thermofisher | T35356 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 µm | Polysciences | 15702-10 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 µm | Polysciences | 09719-10 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 µm | Polysciences | 17687-5 | |
| Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 µm | Polysciences | 09847-5 | |
| Texas Red E. coli bioparticles | Thermofisher | E2863 | |
| Flow-set fluorospheres | Beckman Coulter | 6607007 | Calibration Beads |
| SM agar | Formedium | SMACFG | |
| 0.22 µm syringe filter | Elkay Laboratory Products | E25-PS22-50S | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 302188 | |
| Round-bottom polystyrene tubes | Corning | 352058 | Use a tube that will fit onto your flow cytometer. |
| 70 µm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 50 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.547.004 | |
| Repeating pipette | Eppendorf | M4-SK | |
| 5 mL repeating pipette tips | Eppendorf | 30089650 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| LY294002 | Cayman Chemical Company | 70920 | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG |
References
- Bloomfield, G., Kay, R. R. Uses and abuses of macropinocytosis. Journal of Cell Science. 129 (14), 2697-2705 (2016).
- Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182 (2), 389-400 (1995).
- Hardt, W. D., Chen, L. M., Schuebel, K. E., Bustelo, X. R., Galan, J. E. S. typhimurium encodes an activator of Rho GTPases that induces membrane ruffling and nuclear responses in host cells. Cell. 93 (5), 815-826 (1998).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3548-3553 (2011).
- Hacker, U., Albrecht, R., Maniak, M. Fluid-phase uptake by macropinocytosis in Dictyostelium. Journal of Cell Science. 110, 105-112 (1997).
- Dowrick, P., Kenworthy, P., McCann, B., Warn, R. Circular ruffle formation and closure lead to macropinocytosis in hepatocyte growth factor/scatter factor-treated cells. European Journal of Cell Biology. 61 (1), 44-53 (1993).
- Buczynski, G., et al. Inactivation of two Dictyostelium discoideum genes, DdPIK1 and DdPIK2, encoding proteins related to mammalian phosphatidylinositide 3-kinases, results in defects in endocytosis, lysosome to postlysosome transport, and actin cytoskeleton organization. Journal of Cell Biology. 136, 1271-1286 (1997).
- Araki, N., Johnson, M. T., Swanson, J. A. A role for phosphoinositide 3-kinase in the completion of macropinocytosis and phagocytosis by macrophages. Journal of Cell Biology. 135 (5), 1249-1260 (1996).
- Araki, N., Egami, Y., Watanabe, Y., Hatae, T. Phosphoinositide metabolism during membrane ruffling and macropinosome formation in EGF-stimulated A431 cells. Experimental Cell Research. 313 (7), 1496-1507 (2007).
- Clark, J., et al. Dictyostelium uses ether-linked inositol phospholipids for intracellular signalling. The EMBO Journal. 33 (19), 2188-2200 (2014).
- Hoeller, O., et al. Two distinct functions for PI3-kinases in macropinocytosis. Journal of Cell Science. 126, 4296-4307 (2013).
- Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins. Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).
- Veltman, D. M., et al. A plasma membrane template for macropinocytic cups. Elife. 5, e20085 (2016).
- West, M. A., Prescott, A. R., Eskelinen, E. L., Ridley, A. J., Watts, C. Rac is required for constitutive macropinocytosis by dendritic cells but does not control its downregulation. Current Biology. 10 (14), 839-848 (2000).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109, 2731-2739 (1989).
- Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
- Clarke, M., Kohler, J., Heuser, J., Gerisch, G. Endosome fusion and microtubule-based dynamics in the early endocytic pathway of Dictyostelium. Traffic. 3, 791-800 (2002).
- Pacitto, R., Gaeta, I., Swanson, J. A., Yoshida, S. CXCL12-induced macropinocytosis modulates two distinct pathways to activate mTORC1 in macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 101 (3), 683-692 (2017).
- Rivero, F., Maniak, M. Quantitative and microscopic methods for studying the endocytic pathway. Methods in Molecular Biology. , 423-438 (2006).
- Bacon, R. A., Cohen, C. J., Lewin, D. A., Mellman, I. Dictyostelium discoideum mutants with temperature-sensitive defects in endocytosis. Journal of Cell Biology. 127, 387-399 (1994).
- Basu, S., Fey, P., Jimenez-Morales, D., Dodson, R. J., Chisholm, R. L. dictyBase 2015: Expanding data and annotations in a new software environment. Genesis. 53 (8), 523-534 (2015).
- Williams, T. D., Kay, R. R. The physiological regulation of macropinocytosis during Dictyostelium growth and development. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
- Tsujioka, M., et al. Overlapping functions of the two talin homologues in Dictyostelium. Eukaryotic Cell. 7 (5), 906-916 (2008).
- Aguado-Velasco, C., Bretscher, M. S. Circulation of the plasma membrane in Dictyostelium. Molecular Biology of the Cell. 10, 4419-4427 (1999).
- Sattler, N., Monroy, R., Soldati, T. Quantitative analysis of phagocytosis and phagosome maturation. Methods in Molecular Biology. 983, 383-402 (2013).
- Wilkins, A., Chubb, J., Insall, R. H. A novel Dictyostelium RasGEF is required for normal endocytosis, cell motility and multicellular development. Current Biology. 10, 1427-1437 (2000).
- Thomason, P. A., King, J. S., Insall, R. H. Mroh1, a lysosomal regulator localized by WASH-generated actin. Journal of Cell Science. 130 (10), 1785-1795 (2017).
- van Duijn, B., Vogelzang, S. A., Ypey, D. L., van der Molen, L. G., van Haastert, P. J. M. Normal chemotaxis in Dictyostelium discoideum cells with a depolarized plasma membrane potential. Journal of Cell Science. 95, 177-183 (1990).
- Novak, K. D., Peterson, M. D., Reedy, M. C., Titus, M. A. Dictyostelium myosin I double mutants exhibit conditional defects in pinocytosis. Journal of Cell Biology. 131, 1205-1221 (1995).
- Mercer, J., Helenius, A. Vaccinia virus uses macropinocytosis and apoptotic mimicry to enter host cells. Science. 320 (5875), 531-535 (2008).
- Paschke, P., et al. Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum. PLoS One. 13 (5), e0196809 (2018).
- Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum. Genome Biology. 9 (4), R75 (2008).
- Fey, P., Dodson, R. J., Basu, S., Chisholm, R. L. One stop shop for everything Dictyostelium: dictyBase and the Dicty Stock Center in 2012. Methods in Molecular Biology. 983, 59-92 (2013).
