Utilizando la cadena de herramientas de animación de FishSim para investigar el comportamiento de pescado: un estudio de caso en la elección de pareja copia en Mollies aletón

Summary

Utilizando la cadena de herramientas de animación FishSim novela, presentamos un protocolo para la manipulación visual no invasiva de la información pública en el contexto de la elección de pareja copia en mollies aletón. FishSim Cadena de herramientas de animación proporciona un marco de fácil uso para el diseño, animación y presentación de los estímulos de pescado computadora-animado para experimentos conductuales con peces de prueba en vivo.

Abstract

En la última década, utilizando animación por ordenador para la investigación del comportamiento animal ha aumentado debido a su capacidad para manipular de forma no invasiva la apariencia y el comportamiento de los estímulos visuales, en comparación con la manipulación de animales vivos. Presentamos la cadena de herramientas de animación FishSim , un marco de software desarrollado para proporcionar a los investigadores un método fácil de usar para la aplicación de animación por ordenador 3D en experimentos conductuales con pescado. La cadena de herramientas ofrece plantillas para crear estímulos 3D virtuales de cinco especies de peces diferentes. Estímulos son personalizables en aspecto y tamaño, basado en fotografías tomadas de peces vivos. Múltiples estímulos pueden ser animados por grabación piscina senderos en un ambiente virtual utilizando un videojuego. Para aumentar la normalización del comportamiento simulado, el camino de natación pregrabado puede reproducirse con diferentes estímulos. Múltiples animaciones más tarde pueden organizados en listas de reproducción y presenta en monitores durante experimentos con peces vivos.

En un estudio de caso con aletón mollies (Poecilia latipinna), proporcionamos un protocolo sobre cómo llevar a cabo un experimento copiado de elección de pareja con FishSim. Utilizó este método para crear y animar virtuales machos y hembras de modelo virtual y luego presentó estos para vivir las hembras focal en un experimento de elección binaria. Nuestros resultados demuestran que la animación por ordenador puede utilizarse para simular peces virtuales en un experimento copiado de elección de pareja para investigar el papel de la mujer grávidas puntos como un indicador de calidad para una mujer modelo, copia de la elección de pareja.

Aplicando este método no se limita a copiar experimentos de elección de pareja pero se puede utilizar en varios diseños experimentales. Todavía, su utilidad depende de las capacidades visuales de las especies de estudio y primero necesita validación. En general, animaciones de computadora ofrecen un alto grado de control y de normalización en experimentos y tener el potencial de 'reducir' y 'reemplazar' estímulos en animales, así como a 'perfeccionar' procedimientos experimentales.

Introduction

Recientemente, utilizando técnicas modernas para la creación de estímulos artificiales, como la animación por ordenador y realidad virtual, ha ganado popularidad en la investigación¹. Estos métodos proporcionan diversas ventajas en comparación a los clásicos enfoques experimentales con estímulo vivo animales^1,2. Animación por ordenador permite la manipulación no invasiva de la apariencia (tamaño, color) y comportamiento de estímulo virtual animales utilizados en experimentos. Por ejemplo, la extirpación quirúrgica de la espada en swordtails verdes macho (Xiphophorus helleri) probar mate preferencias en las hembras³ fue rendida innecesaria utilizando animación por ordenador en un estudio posterior sobre esta especie⁴. Además, animaciones de computadora pueden crear fenotipos que se encuentran solamente raramente en la naturaleza⁵. Incluso pueden alterar las características morfológicas de animales virtuales más allá de la gama natural de esa especie⁴. En particular, la posible manipulación sistemática del comportamiento es una ventaja importante de la animación por ordenador, ya que es casi imposible con animales vivos^6,7.

Existen varias técnicas hasta la fecha para la creación de animaciones de computadora. Animaciones de (2D) bidimensionales simple normalmente derivan de una foto de un estímulo en movimiento en dos dimensiones y pueden crearse con programas comunes como MS PowerPoint⁸ o⁹de Adobe After Effects. Las animaciones tridimensionales (3D), que requieren gráficos 3D más sofisticados software de modelado, permiten el estímulo para moverse en tres dimensiones, aumentando las posibilidades de movimiento físico realista y complejo^{6,7 , 10 , 11 , 12}. incluso realidad virtual diseños que simulan un entorno 3D donde navegación animales vivos han sido usados^13,14. En una revisión reciente Thuly Chouinard et al. ² discutir estas técnicas uno por uno y destacar ventajas y desventajas en su aplicación en la investigación, en particular según el alcance del estudio y las capacidades visuales de los animales de prueba (ver "Discusión"). Además, Powell y Rosenthal¹⁵ asesorar en el diseño experimental apropiado y qué preguntas pueden resolverse mediante el empleo de estímulos artificiales en la investigación del comportamiento animal.

Desde la creación de animación por ordenador puede ser difícil y desperdiciador de tiempo, surgió la necesidad de software facilitar y estandarizar el proceso de diseño de animación. En este estudio, presentamos la de FishSim animación Toolchain libre y de código abierto¹⁶ (corto: FishSim; https://bitbucket.org/EZLS/fish_animation_toolchain/), un enfoque multidisciplinario que combina la ciencia informática y biología para atender estas necesidades. Similar a la anteriormente publicada herramienta anyFish^17,18, el desarrollo de la cadena de herramientas siguió el objetivo de proporcionar a los investigadores un método fácil de usar para la aplicación de estímulos 3D animados en experimentos con peces. Nuestro software consiste en un conjunto de herramientas que puede utilizarse para: (1) crear peces virtuales 3D (FishCreator), pregrabadas (2) animar las trayectorias de natación de los pescados virtuales con un videojuego (FishSteering) y (3) organizan y presentan animaciones en monitores para vivir peces focal (FishPlayer). Nuestra toolchain proporciona varias características que son especialmente útiles para pruebas en una situación de elección binaria, pero también aplicable a otros diseños experimentales. Por otra parte, la posible animación de dos o más peces virtuales permite la simulación de shoaling o cortejo. Animaciones no están limitadas a un estímulo específico pero pueden reproducirse con otros estímulos que permiten cambiar la apariencia de un estímulo, pero mantener su comportamiento constante. La naturaleza de código abierto de la cadena de herramientas, así como el hecho de que se basa en el sistema de la operación del robot ROS (www.ros.org), proporcionan la alta modularidad del sistema y ofrecen casi infinitas posibilidades para incluir dispositivos de retroalimentación externa (como el controlador o una sistema de seguimiento) y adaptar la cadena de herramientas a las necesidades de cada uno en la investigación. Además de la molly aletón, cuatro otras especies son actualmente utilizables: el Atlántico molly Poecilia mexicana, el guppy Poecilia reticulata, el espinoso Gasterosteus aculeatus y un cichlid Haplochromis spp. Nuevas especies pueden crearse en un 3D y modelado de herramienta (por ejemplo, licuadora, www.blender.org). Para ejemplificar el flujo de trabajo con FishSim y proporcionar un protocolo sobre cómo llevar a cabo un experimento copiado de elección de pareja con animación por ordenador, se realizó un estudio de caso con aletón mollies.

Elección de pareja es una de las decisiones más importantes que los animales hacen en su historia de vida. Los animales han desarrollado diferentes estrategias para encontrar los mejores socios de acoplamiento. Ellos podrán depender de información personal al evaluar potencial apareamiento a socios independientemente, posiblemente según preferencias predeterminadas genéticas para un determinado rasgo fenotípico^19,20. Sin embargo, pueden también observar la elección de pareja de sus congéneres y así utilizar información pública²¹. Si el observador decide entonces elegir el mismo mate (o el mismo fenotipo) como los coespecíficos observado — el «modelo» — elegido previamente, esto se denomina elección de pareja copia (en adelante abreviado como MCC)^22,23. Copia de la elección de pareja es una forma de aprendizaje social y, por tanto, una estrategia de elección de pareja no independiente²⁴, que se ha observado en ambos vertebrados^{25,26,27,28, 29} e invertebrados^30,31,32. Hasta ahora, MCC predominante fue estudiada en el pescado y se encuentra en laboratorio las condiciones^{33,34,35,36,37,38} y en el salvaje^39,40,41,42. Copia de elección de pareja es especialmente valioso para un individuo si dos o más socios potenciales de apareamiento son aparentemente similares en calidad y una elección de pareja «bueno» — en términos de maximizar la aptitud — es difícil hacer⁴³. La calidad de un modelo de mujer se puede afectar si las hembras focal copiar su elección o no^44,45,46,47. Respectivamente, calidad mujer modelo "bueno" o "malo" se ha atribuido a su más o menos experimentada en la elección de pareja, por ejemplo en cuanto a tamaño y edad^44,45,46, o por ser un coespecíficos o heteroespecíficas⁴⁷. Mollies aletón que copie la elección de pareja de sus congéneres^{39,48,49,50,51}, se encontró que las hembras focal copiar incluso el rechazo de un hombre⁵² . Puesto que el MCC se considera que desempeñan un papel importante en la evolución de rasgos fenotípicos, así como de especiación e hibridación^21,23,53,54, las consecuencias de copiar un " opción falsa"puede ser enorme en la reducción de la aptitud de la copiadora⁵⁵. Si un individuo decide copiar la elección de otro individuo, es importante evaluar si el modelo observado es una fuente confiable de información, es decir, que el modelo sí mismo está haciendo una "buena" elección debido a él o ella bien experimentado en mate opción. Aquí surge la pregunta: ¿Qué características visuales pueden caracterizar un modelo fiable que lo copien en las hembras de molly aletón?

Una característica visual distinta en mujeres aletón mollies y otros poecílidos es el punto grávido (también conocido como 'spot anal', 'cría parche' o 'embarazo spot'). Esta área oscuro pigmentada en su región anal deriva del melanization del tejido que recubre el saco ovárico⁵⁶. El tamaño y la presencia del punto grávido son variables a través de las hembras de la misma especie y más individualmente pueden cambiar durante la progresión de los ciclos ováricos^56,57. Grávidas puntos pueden servir para atraer a los machos y facilitar la orientación de gonopodial para inseminación interna⁵⁸ o como un medio de publicidad fertilidad^59,60. Teniendo en cuenta el vínculo entre el punto grávido y estado reproductivo de la hembra, predijimos que el punto grávido sirve como un signo de calidad femenina modelo proporcionando información sobre su estado reproductivo actual para observar hembras focal. Se investigan dos hipótesis alternativas. En primer lugar, si el punto grávido es una señal general de madurez, como se predijo por Farr y Travis⁵⁹, denota un modelo supuestamente fiable y con experiencia en comparación con un modelo inmaduro (sin el punto). Aquí, las hembras focal son más propensos a copiar la elección de un modelo con una mancha pero no la de un modelo sin una mancha. En segundo lugar, si el punto grávido marca no receptividad debido a la ya desarrollo de crías, como Sumner et al. ⁶⁰, el modelo es probablemente menos fiable ya que las hembras no receptivas se consideraría menos exigentes. En este caso, las hembras focal no copia su elección pero de modelos sin mancha. Hasta ahora, el papel del spot grávido de MCC en hembras de aletón molly tiene nunca ha probado, ni manipulados experimentalmente.

Utilizamos FishSim para llevar a cabo un experimento MCC presentando estímulos virtuales machos y hembras de modelo virtual en monitores de computadora en vez de usar vivo estímulo y modelo pescado como en el clásico procedimiento experimental^{49,50 ,51,61}. La usabilidad general de nuestro software ha sido validada previamente para probar la hipótesis sobre la elección de pareja en aletón mollies¹². Aquí, probamos si la ausencia o presencia de un punto grávido en hembras de modelo virtual afecta a la elección de pareja de observar hembras focal vivo. Primero dejamos las hembras focal aclimatación al tanque de prueba (figura 1.1) y les permiten elegir entre dos machos de diferentes estímulos virtuales en una prueba de elección de pareja primero (figura 1.2). Luego, durante el período de observación, se presentó el hombre virtual previo no preferidos junto con una mujer de modelo virtual (figura 1.3). En una posterior segunda prueba de la elección de pareja, las hembras focal eligieron otra vez entre los varones de la misma (figura 1.4). Hemos analizado si focal hembras habían copiado la elección de pareja de la mujer modelo observado comparando su decisión de elección de pareja en la primera y segunda prueba de elección de pareja. Se realizaron dos diferentes tratamientos experimentales en los cuales manipulamos visualmente la calidad de la hembra del modelo virtual. Durante el período de observación, o presentamos el previo hombre virtual no preferidos (1) junto con una hembra modelo virtual con un punto grávido (tratamiento "punto"); o (2) junto con una hembra modelo virtual sin un punto grávido (tratamiento de "ningún lugar"). Además, en un control sin cualquier mujer modelo, probamos si hembras focal eligieron constantemente cuando no se proporcionó ninguna información pública.

Figura 1. Resumen general de los pasos experimentales más importantes para un experimento MCC utilizando estímulos peces virtuales. (1) periodo de aclimatación. La prueba de elección de pareja primero (2) : mujer focal vivo elige entre machos de estímulo virtual. Período de observación (3) : focal relojes el macho anterior no preferidos junto con una hembra modelo virtual con el punto grávido. (4) prueba de segunda elección de pareja: la mujer focal nuevo elige entre machos de estímulo virtual. En este ejemplo, copia la elección del modelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

El realizados experimentos y manipulación de los peces están en consonancia con la legislación de Bienestar Animal de alemán (Deutsches Tierschutzgesetz) y aprobaron por el oficial de bienestar animal interno Dr. Urs Gießelmann, Universidad de Siegen y la (de las autoridades regionales Kreisveterinäramt Siegen-Wittgenstein; Número de permiso: 53,6 55-05).

1. pescado virtual diseño

Nota: Encontrar una lista del hardware necesario y el software en la lista de materiales suplementarios. En el Manual del usuario (https://bitbucket.org/EZLS/fish_animation_toolchain/) encontrará una descripción detallada de la funcionalidad general de FishSim y obtener sugerencias y trucos.

1. Elaboración de texturas del cuerpo de la mujer con y sin punto grávido
   1. Iniciar GIMP y haga clic en archivo >> abrir abrir la imagen de textura de cuerpo de la mujer "PLF_body_6. PNG"de los modelos de carpeta en el directorio"fishsim_animation_toolchain". Utilizar esta imagen como referencia para todas las texturas creado cuerpo de la mujer nuevo con punto grávido. Seleccione la zona punto grávida oscura de la imagen de referencia con la herramienta de selección libre y cortarlo (haga clic en Editar >> corte).
      Nota: GIMP (disponible en www.gimp.org) es una libre herramienta, similar a Adobe Photoshop, que puede utilizarse para manipular gráficos y fotografías digitales de edición de imagen.
   2. Abrir un segundo archivo de textura de cuerpo de la mujer en el GIMP (por ejemplo, "PLF_body_7.png") y transferir el área de punto en la segunda textura cuerpo insertando (Editar >> pasta en) el previo corte área spot como una nueva capa flotante. Ajustar la posición del punto grávido en las capas de imagen y fusión segundo haciendo clic capa de >> capa de anclaje.
      Nota: Asegúrese de que el área del punto grávido tiene el mismo tamaño y posición idéntica en cada mujer de modelo virtual (figura 2).
   3. Exportación (Editar >> Exportar como) la nueva textura de "punto" con un nuevo nombre (por ejemplo: PLF_body_7_S. png) en la carpeta de modelos . Cerrar todos abren ventanas en GIMP.
      Nota: No haga cualquier otro cambio (por ejemplo, escala) a la textura archivos ya editaron especialmente para posteriormente asignan a los peces 3D.
   4. Crear una segunda textura de cuerpo sin un punto grávido, usando el mismo archivo de textura de cuerpo femenino original una segunda vez (por ejemplo, "PLF_body_7.png"). Ahora, cubrir manchas grávidas ya existentes en el archivo original con la ayuda de GIMP.
   5. Abra la textura del cuerpo de la mujer en GIMP y seleccionar la herramienta para clonar. Seleccione el patrón de la zona abdominal (sin pigmentación oscura) pulsando Ctrl + botón izquierdo del ratón y utilice esta selección para cubrir pigmentación oscura existente por pintura sobre él con la herramienta de clon (figura 2).
   6. Exportación de la recién creada "no lugar" textura bajo un nuevo nombre (e.g., PLF_body_7_NS.png) en la carpeta de modelos . Cerrar el GIMP.

Figura 2: fotos de modelo de cuerpo femenino texturas antes (original) y después de la manipulación para el "punto" y "sin punto" tratamiento utilizando la edición de imágenes herramientas GIMP. El círculo punteado marca el área que fue manipulado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Ajuste el punto de vista y configuración de la "escena" para la animación
   1. Iniciar FishSim seleccionando el icono de FishSim en el lanzador en el lado izquierdo del escritorio. Configurar la resolución de los monitores de presentación y haga clic en iniciar.
      Nota: Se recomienda hacer los siguientes ajustes (medidas 1.2.2\u20121.2.4) en la pantalla de uno de los monitores de presentación (si las dimensiones del monitor y resoluciones difieren).
   2. Presione F1 en el teclado para cambiar de modo a modo de edición (alternar entre ver y modo edición pulsando F1) de visualización.
      Nota: Cambiar al modo de edición permite a la barra de herramientas de edición en la parte superior de la ventana. La escena como se ve en el modo de visualización muestra lo que se presentarán en pantalla durante los experimentos.
   3. Ajustar el punto de vista para que coincida con las dimensiones de los monitores de presentación ajustando el ángulo de la cámara. Girar la cámara pulsando el botón izquierdo del ratón y mover el cursor. Bandeja de la cámara manteniendo pulsado el botón derecho del ratón y moviendo el cursor. Zoom dentro y fuera del medio del ratón (o ambos botones del ratón) y moviendo el cursor.
   4. Haga clic en configuración de la cámara en la barra de herramientas de edición (icono de cámara) y haga clic en copiar a cam estático para definir el punto de vista. Haga clic en archivo >> guardar la escena para salvar la escena ajustada como la nueva escena predeterminada. Para esto, reemplazar el archivo "default_scene.scene" en la carpeta de escenas del directorio de FishSim .
      Nota: La escena por defecto aparecerán en cada inicio de FishSim y como la escena inicial en FishPlayer. En FishPlayer la escena por defecto también sirve como una pausa durante los experimentos (Figura 3A). Ajuste de la escena tiene que ser hecho sólo una vez.

Figura 3: imágenes de una escena en FishSim. (A) la escena por defecto vacía sin un pez, (B) una escena que muestra a un hombre solo, (C) una escena mostrando a ese mismo hombre junto a una mujer de la modelo con un punto y (D) una escena que muestra el hombre idéntico y el idéntico modelo femenino sin una mancha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Diseño de un estímulos hombre virtual para presentación durante las pruebas de elección de pareja
   Nota: Preparar estímulos hombres virtuales que más tarde serán animados y presentados para vivir las hembras focal durante las pruebas de elección de pareja.
   1. Si no ya abierto, iniciar FishSim. Presione F1 para entrar en el modo de edición.
   2. Haga clic en archivo >> carga modelo del pez de la lista desplegable y carga el defecto aletón macho molly plantilla "default_PLM.x" mediante la selección de la carpeta modelos.
   3. Izquierda haga doble clic en el pez cargado para seleccionarlo. Se destacará en una malla. Haga clic en el icono de engranaje en la barra de herramientas para abrir el conjunto de herramientas de pesca. Aparecerá un cuadro con las opciones de edición que se usa para personalizar el hombre virtual. Desactive Mostrar malla para una mejor visión de los peces.
   4. Cambiar el nombre al masculino.
      Nota: El nombre del varón es importante y representa el "rol" que jugará más tarde durante la animación. Este nombre debe ser idéntico para cada hombre virtual recién creado que se utilizará más adelante, durante los experimentos.
   5. Modificar la escala (dimensiones) del macho cambiando los valores para x, y y z, si es necesario y haga clic en aplicar.
   6. Editar textura del macho haciendo clic en texturas en el Cuadro de herramientas Editar. Haga clic en una característica de los peces (cuerpo, dorsal, caudal) para cambiarlo.
      Nota: Aparecerá el cuadro seleccionar una textura para con todos los archivos .png que se pueden utilizar como texturas. Texturas aparecen con nombres tal como figura en la carpeta de modelos .
   7. Haga clic en una textura que aparece en la lista (derecha), y directamente aparecen y reemplazar la textura anterior sobre el pescado.
   8. Cuando se crea el hombre deseado, haga clic en aplicar en Config en el Cuadro de herramientas de edicióny haga clic en Guardar peces disco. Guardar el hombre nuevo como "Male_A.fish" en la carpeta de modelos .
   9. Además, guardar toda la escena (archivo >> Guardar escena) como que un macho en la carpeta de escenas . Aquí, se recomienda utilizar el nombre "Male_A_alone.scene" (Figura 3B).
   10. Haga clic en archivo >> escena de carga a la escena por defecto vacía la carga y repita los pasos 1.3.2 a 1.3.9 para crear tantos machos virtuales diferentes según sea necesario y guardar cada uno recién crearon masculinos bajo un nombre único en la carpeta de modelos y como un nuevo archivo de .scene en la carpeta de la escena .
4. Diseño de los peces hembra modelo virtual para presentación durante el período de observación
   1. Haga clic en archivo >> escena de carga para cargar la escena por defecto. Siga el paso 1.3.1 y haga clic en archivo >> carga modelo de peces para cargar la plantilla femenina por defecto "default_PLF.x" de la carpeta de modelos .
   2. Haga doble clic izquierdo en la hembra cargada para seleccionarla y abrir el conjunto de herramientas de pesca. Cambiar el nombre a "mujer". La escala de la hembra si es necesario como se describe en el paso 1.3.5.
      Nota: Nombre y escala deben ser idénticos para todas las mujeres para los propósitos de este experimento.
   3. Reemplazar la textura del cuerpo de la mujer por defecto con el creado anteriormente "punto"-cuerpo de textura (aparecen en el cuadro a la derecha) como se describe en pasos 1.3.6 a 1.3.7.
   4. Aplicar bajo Config en el Cuadro de herramientas de edición, haga clic en guardar peces disco haciendo clic en Guardar y crear un archivo "Female_1S.fish" (S = lugar).
   5. Haga clic en archivo >> escena de carga para cargar la escena por defecto. Repita los pasos 1.4.1 a 1.4.4 crear al menos una (o como sea necesario) pero mujer modelo idéntico sin el grávido punto y asígnele el nombre "Female_1NS.fish" (NS no = lugar). Guarde cada pescado en la carpeta de modelos .
      Nota: Para el período de observación del experimento MCC, escenas incluyendo un macho y una hembra tienen que ser creado y guardado.
   6. Haga clic en archivo >> escena de carga para cargar la escena vacía por defecto. Haga clic en archivo >> carga modelo del pescado insertar un hombre virtual "Male_A.fish" de la carpeta de modelos . Haga clic en archivo >> modelo de peces la carga nuevo para agregar el virtual modelo femenina "Female_1S.fish" a la escena. Cambiar la posición de cada pescado por alterar sus ejes x, y y z-coordenadas para que sus cuerpos no se superponen.
      Nota: Eliminar un pez de la escena haciendo doble clic sobre él y presionando Borrar en el teclado.
   7. Guardar la escena entre hombre y mujer modelo haciendo clic en archivo >> escena guardar como "Male_A_with_Female_1S.scene" (figura 3).
   8. Repita los pasos 1.4.6 a 1.4.7 para crear tres escenas adicionales para: (1) Male_A con Female_1NS (ver figura 3D), (2) Male_B con Female_1S y (3) Male_B con Female_1NS.

2. animación de peces Virtual estímulos

Nota: Cada tipo de animación es necesario para el experimento debe ser preparado sólo una vez con una escena hombre ejemplar y una observación ejemplar escena (macho y hembra juntos de animación). Durante el proceso de animación, un camino de natación para cada pescado se crea más tarde que puede reproducirse por cualquier pescado, siempre y cuando el nombre es idéntico (ver paso 1.3.4).

1. Animaciones hombres virtuales para presentación durante las pruebas de elección de pareja
   Nota: Preparar dos animaciones de un hombre virtual: (1) un camino de natación con una duración de 7,5 min y (2) un camino de natación con una duración de 5 minutos.
   1. Enchufe el controlador de juegos de azar (por ejemplo, Sony Play Station 3) en el puerto USB de la computadora en funcionamiento.
   2. Abra FishSim y haga clic archivos >> escena de carga para cargar la escena de un macho desde la carpeta escenas, por ejemplo, "Male_A_alone.scene". Iniciar FishSteering haciendo clic en el icono de FishSteering .
   3. Configurar los parámetros del controlador en una ventana independiente.
      Nota: FishSim y FishSteering simultáneamente y pescado puede ser dirigido en ver modo, como se muestra durante los experimentos, o en modo de edición presionando F1.
   4. Para animar los peces (hombres), seleccione en el menú desplegable del panel de dirección . Nombres de los modelos aquí se corresponden con el nombre dado en la Caja de herramientas de edición (ver paso 1.3.4).
   5. Haga clic en Inicio colocar y utilizar el controlador para colocar los peces en cualquier posición de salida en el depósito virtual. Haga clic en dejar de colocar.
   6. Iniciar la grabación de ruta de natación de los peces haciendo clic en iniciar la grabación de. Utilice el controlador para mover los peces alrededor de la escena.
      Nota: La duración de la grabación se da en la esquina inferior derecha del panel de dirección.
   7. Haga clic en Detener grabación. Haga clic en Guardar para guardar el camino de la natación como un archivo de .bag ("registro") en el disco (por ejemplo, en el escritorio). Elegir el nombre del archivo para representar la duración del registro, por ejemplo, "7_30_min_male_alone.bag".
      Nota: Una vez que se detiene la grabación, no es posible editar la duración total otra vez.
   8. Editar el registro para agregar el movimiento de la aleta dorsal de hombre a imitar el comportamiento de cortejo masculino durante las pruebas de elección de pareja. Seleccione la aleta dorsal en el menú desplegable en la función de Editar (sólo se puede editar a la vez).
   9. Seleccione Inicio de edición y la ruta completa de la piscina se reproducirán. Presione el botón L1 en el controlador para levantar la aleta dorsal en puntos específicos en el tiempo. Haga clic en Guardar para guardar la versión editada de la ruta de la natación como un nuevo . archivo de la bolsa.
   10. Repita los pasos 2.1.8 y 2.1.9 pero seleccione el gonopodium añadir su movimiento. Guardar la versión final para su uso posterior en FishPlayer. Cierre FishSteering.
       Nota: Se recomienda guardar los archivos de la bolsa para cada paso edición bajo un nombre único. Por esto, siempre es posible volver a una versión anterior de la animación si sucede algo en el proceso de edición.
2. Animación virtual masculina y modelo femenino para su presentación durante el período de observación
   Nota: Preparar una animación con un virtual macho y la hembra del modelo virtual en el cortejo, así interactuando sexualmente con los demás, con una duración total de 10 minutos.
   1. Abierto FishSim. Presione F1 para entrar en el modo de edición y haga clic en archivo >> escena de carga para cargar una escena con masculinos y femeninos, por ejemplo, "Male_A_with_Female_1S.scene". Inicio FishSteering.
   2. Seleccione macho y hembra alternativamente para colocarlos (pulsando Start/Stop colocar) en el depósito virtual.
   3. Para la grabación, seleccione primero los peces hembra en el menú desplegable del panel de dirección y crear un camino de natación con duración de 10 min siguiendo pasos 2.1.5 a 2.1.6.
      Nota: Se puede grabar la ruta de la natación de peces sólo uno a la vez. Después de animar el primer pez, la ruta de la natación de los pescados del segundo puede incluir usando la función Editar mientras se reproducen los peces previamente dirigidos junto a para toda la duración de la animación.
   4. Haga clic en detener la grabación y Guardar el camino de la natación en la unidad, por ejemplo, como "10_00_min_male_with_female.bag". A continuación Editar sucesivamente el hombre camino de natación, movimiento de la aleta dorsal y gonopodium movimiento como se describe en pasos 2.1.8 a 2.1.10. Guardar la versión final para su uso posterior en FishPlayer.

3. elaboración de listas de reproducción de animación para el experimento MCC

Nota: Utilice FishPlayer para presentar animaciones en dos monitores a vivir las hembras focal. Organizar la lista de reproducción para cada monitor por separado simular el procedimiento del experimento MCC (figura 1). La herramienta consta de una ventana principal que muestra la lista de registro para cada monitor (figura 4) y una ventana de animación independiente para cada monitor de presentación.

1. Funcionalidad general y disposición de escenas y registros
   1. Cierre todas las ventanas y Abra FishPlayer haciendo clic en el icono correspondiente. Configurar para el uso con dos monitores de presentación (izquierdo y derecho) y haga clic en iniciar.
      Nota: La escena por defecto creada en el punto 1.2.4 (se guarda en scenes/default_scene.scene) siempre se carga y aparece en ambos monitores, como la escena inicial y durante un comando pause.
   2. Agregar entradas a la lista de reproducción para cada monitor por separado. Haga clic en Agregar carga escena para añadir la escena de por ejemplo, A hombre, de la carpeta de escenas en el directorio de FishSim . Haga clic en Agregar jugar registro para agregar un registro de la unidad, por ejemplo, el registro de 7,5 min para un hombre solo.
      Nota: La escena y el siguiente registro se vinculará entonces por el software y el hombre virtual representado en la escena se mueve como se define en el registro correspondiente.
   3. Haga clic en Agregar pausa para agregar un comando de pausa de una duración específica (minutos/segundos) que muestra la escena por defecto sin peces como un descanso para peces de manejo entre los registros.
      Nota: Duración de pausa generalmente dependerá del tiempo necesario para la manipulación de pescado. Una entrada, haga clic en y arrastre para cambiar su orden en la lista. Las entradas están marcadas en rojo. Eliminar una entrada de la lista de reproducción seleccionando la entrada y haga clic en Eliminar selección.
   4. Haga clic en Play/Stop para iniciar y detener una presentación. Dejar siempre a terminar la lista de reproducción completa, por ejemplo, allí es no hay manera de hacer una pausa en medio de una lista de reproducción una vez funcionando.
      Nota: Listas de reproducción siempre a partir de la primera entrada y correr de arriba a abajo. Por lo tanto, el orden correcto de todas las entradas se ha establecido antes del experimento y no se puede cambiar posteriormente sin tener que detener la presentación. Un temporizador en la parte inferior de la ventana muestra la duración y el tiempo real de la lista de reproducción.
2. Arreglo de lista de reproducción para los dos tratamientos y el control del experimento MCC
   Nota: En términos de la disposición de entrada, el experimento MCC se divide en dos partes: (1) la prueba de elección de pareja primero y (2) el período de observación, seguida de la prueba de segunda elección de la pareja. Por lo tanto, para cada tratamiento y el control, listas de reproducción tienen que ser dispuestos en dos órdenes diferentes.
   1. Cuando se ejecuta el experimento, en primer lugar, preparar una lista de reproducción para la prueba de elección de pareja primero.
   2. En segundo lugar, en el proceso de la experiencia corriente, cambiar la disposición de la lista de reproducción para el período de observación posterior y la segunda prueba de la elección de pareja según el cual hombre virtual fue preferido por la mujer focal en la prueba de elección de pareja primero.
3. Arreglo de lista de reproducción específica para el tratamiento "in situ"
   1. Para la prueba de elección de la primera pareja en el tratamiento 1, ordenar la lista de reproducción tal como se muestra en la figura
   2. Después de la prueba de elección de pareja primero, descanse para el cálculo de que hombre virtual fue preferido (ver paso siguiente 5.9). Luego reorganizar las listas de reproducción para el período de observación, en que información pública proporciona a la hembra focal mostrando el macho previo no preferidos junto con la mujer modelo.
   3. Organizar la lista de reproducción para la observación y la siguiente prueba de segunda elección de la pareja según figura 5.
   4. Para el período de observación, vincular el registro de 10 minutos (masculino y modelo femenino junto) con una escena mostrando a la previa preferida hombre solo.
      Nota: En este caso, se mostrará sólo la ruta de la natación del varón y, porque se encuentra en la escena, la hembra modelo virtual estará ausente.
   5. Para la lista de reproducción con el macho no preferida, enlace el récord de 10 minutos a la escena incluyendo el macho previo no preferidos junto con la mujer modelo. Elegir las escenas incluyendo una hembra modelo con un punto grávido (S) para este tratamiento.
      Nota: En contraste con 3.3.2, aquí, el registro idéntico se repiten pero ahora la mujer modelo es visible.

Figura 4: captura de pantalla que muestra las listas de reproducción de FishPlayer para los monitores izquierdos y derecho en la primera parte (prueba de lai. e., la elección de pareja primero) del experimento MCC. Las entradas de la lista de reproducción se ordenan según sea necesario para el examen de mate de primera elección en el tratamiento 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: captura de pantalla que muestra las listas de reproducción de FishPlayer para los monitores izquierdos y derecho en la segunda parte (período de observación y segunda prueba de la elección de pareja) del experimento MCC. Las entradas de la lista de reproducción se ordenan según sea necesario para el período de observación y la segunda prueba de la elección de pareja en el tratamiento 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Arreglo de lista de reproducción específica para el tratamiento de "no lugar"
   1. Para el tratamiento 2, ordenar las listas de reproducción como se describe para el tratamiento 1 (figuras 4 y 5), pero en su lugar utilizar la escena como la mujer de modelo virtual sin una mancha grávida (NS) durante la observación.
5. Arreglo de lista de reproducción específica para el control de la coherencia de la elección
   Nota: En el control de la coherencia de la elección, entradas de lista de reproducción de la prueba de elección de pareja son idénticas a los tratamientos 1 y 2 (figura 4). Durante el período de observación, sin embargo, ninguna información pública se proporciona a las hembras focal y, por lo tanto, ninguna mujer modelo es visible.
   1. Ordenar las listas de reproducción como se muestra en la figura 5 pero combinar las escenas para cada hombre sólo junto con el registro de 10 minutos.
      Nota: En este caso, se mostrará sólo el camino de la natación de los pescados masculinos y, porque se encuentra en la escena, la hembra modelo estará ausente en ambos lados.

4. experimental configuración

1. Lugar equipo dos pantallas cada una en los extremos opuestos de un tanque de prueba. Ajustar las pantallas cubren la mayor parte de las paredes de vidrio del tanque de prueba y tener 1,5 cm de espacio entre las pantallas y las paredes del tanque. Iluminar al tanque desde arriba.
2. Cubrir el fondo del recipiente con una fina capa de grava y llenan de agua apropiado para peces vivos a la altura de las pantallas. Marca una zona de selección con una línea vertical a 20 cm de profundidad de cada extremo en el exterior del tanque. Tienen un cilindro de vidrio acrílico y dos cronómetros de mano.
3. Conectar a los monitores a la red eléctrica y el equipo operativo, a menos de 1 m del tanque de prueba, por ejemplo, en una pequeña mesa (figura 6).

Figura 6: montaje Experimental para el experimento MCC con animación por ordenador. El equipo operativo se conecta a dos monitores de presentación (Monitor 1 y 2) que reproducción animaciones vivir hembras focal dentro del tanque de prueba. Para Ilustración, ambos monitores LCD son en ángulo para mostrar una escena animada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. ejecutar el experimento MCC

Nota: Siga el procedimiento experimental para realizar un ensayo de tratamiento 1, 2 de tratamiento o el control experimento MCC utilizando una hembra focal vivo (ver figura 1).

1. Abra FishPlayer en el equipo operativo y arreglar las listas de reproducción para la elección de pareja primero prueba como por ejemplo, que se describe para el tratamiento 1 (figura 4). Verifique que apuntan a los monitores para la presentación y que muestran la escena vacía por defecto.
2. Lugar una vivo mujer focal dentro del tanque de prueba. Que nadan libremente y aclimatar al tanque y la presentación de los tanques vacíos en ambos monitores para un período de 20 minutos.
3. Después de la aclimatación, colocar la hembra focal en un cilindro de acrílico transparente en el centro del tanque de prueba para asegurar una distancia igual a dos monitores y ejecutar las listas de reproducción en ambos monitores al mismo tiempo haciendo clic en jugar, a partir de la elección de pareja primero prueba.
   Nota: La hembra focal es permitida ver dos machos de estímulo virtual de dentro del cilindro por alrededor de 2,5 min.
4. Antes de que el temporizador llega a 2:30 min, ir lentamente al tanque experimental y suelte la hembra focal del cilindro levantándola suavemente derecho fuera del agua, por ejemplo, en 2:15 min.
   Nota: Aquí, el tiempo exacto depende de la distancia desde el equipo de operación para el tanque de prueba y debe determinarse durante la prueba previa. Es fundamental actuar lentamente y suavemente para evitar destacando los peces. Puesto que los peces pueden actuar muy rápido, se recomienda para ya tener un cronómetro en la mano mientras suelta la hembra para directamente iniciar medición del tiempo de la Asociación (ver paso 6.1).
5. Volver al equipo de operación. Observar la hembra focal y tienen dos cronómetros de mano a la hora de medir la Asociación con cada macho de estímulo virtual (ver paso 6.1).
   Nota: La hembra focal se permite nadar libremente y elegir entre ambos hombres durante 5 minutos.
6. Dejar de medir el tiempo de asociación cuando el temporizador llega 7:30 min. La entrada de pausa entonces tendrá una duración de 1,5 minutos uso la pausa como manejo de tiempo, otra vez, colocar la hembra focal dentro del cilindro y el tiempo para cada hombre virtual escribir en una hoja de datos.
   Nota: Después de la pausa, el segundo 7:30 entrada de minutos comenzará y la hembra focal puede ver ambos varones de 2:30 minutos. Posición masculina esté ahora entre izquierda y derecha para controlar un sesgo lateral posible en hembras focal (ver paso 6.3).
7. Antes de que el temporizador llega a 11:30 min, liberar la mujer focal de los cilindros. Tiempo de Asociación de medida para los próximos 5 minutos.
8. Dejar de medir el tiempo de asociación cuando el temporizador llega a 16:30 min. La entrada de pausa tendrá una duración de 1 minuto uso este tiempo de manipulación para colocar la hembra focal dentro del cilindro.
9. Anote los tiempos de Asociación para la segunda medición. Para cada hombre, en definitiva veces Asociación de ambas mitades de la prueba de elección de la primera pareja (antes y después de que los hombres fueron cambiados). Calcular si la hembra focal tenía un prejuicio de lado y que hombre fue preferido por la mujer focal (ver pasos 6.1 a 6.3).
   Nota: No es ningún problema si se acaba la pausa antes de realiza el cálculo, ya que proceder al siguiente paso necesita la lista de reproducción para llegar a su fin y se detenga.
10. Reorganizar las listas de reproducción (hacer no cerrar FishPlayer!) como se muestra en la figura 5 (dependiendo del tratamiento actual) para que el previo preferido hombre se mueve solo durante el período de observación y el macho no preferido antes se mueve junto con el modelo virtual femenino.
    Nota: Cambios realizados en las listas de reproducción no son visibles a la hembra focal.
11. Haga clic en jugar para continuar que la segunda parte del experimento y las entradas se repiten de arriba hacia abajo comenzando con el período de observación de 10 minutos.
    Nota: Durante el período de observación, la hembra focal sigue siendo dentro del cilindro pero es capaz de ver ambas presentaciones.
12. Después del período de observación, una pausa de 0,5 min inicia. Antes de que el contador llegue a 10:30 min, soltar la hembra focal del cilindro y comenzar la prueba de segunda elección de pareja con el registro de 5 minutos para cada hombre. Medir tiempos de Asociación para los próximos 5 minutos.
13. Dejar de medir el tiempo de asociación cuando el temporizador llega a 15:30 min. La entrada de pausa luego ejecutar durante 1,5 minutos lugar la hembra focal dentro del cilindro y anote el tiempo medido para cada hombre virtual.
    Nota: Después de la pausa, el próximo 7:30 min entrada comenzará y la hembra focal pueden ver dos machos (cuya posición ha cambiado otra vez entre izquierda y derecha) por 2,5 min.
14. Antes de que el temporizador llega a 19:30 min, soltar la hembra focal del cilindro y medir el tiempo de la Asociación para los últimos 5 minutos.
15. Dejar de medir el tiempo de asociación cuando el temporizador llega a 24:30 min y terminar el experimento. Escriba veces Asociación para ambos machos virtuales y proceder con el análisis.

6. medición de datos

1. Medir el tiempo de asociación durante la primera y la segunda parte (antes y después de estímulos se cambian) de cada prueba de elección de pareja, cuando se elige entre los dos machos la hembra focal.
   Nota: Comienza la medición cuando la hembra cruza la línea de confinamiento de la zona de elección con su cabeza y el opérculo. Dejar de medir su cabeza y el opérculo están fuera de la zona de elección.
2. En definitiva la Asociación tiempo medido para cada hombre en la primera y segunda parte de una prueba de elección de pareja y determinar que hombre fue preferido.
   Nota: El hombre recomendado: se determina como la mujer focal pasó más de un 50% del tiempo total que pasó en ambas zonas de elección dentro de una prueba de elección de pareja. Para el análisis, tiempo de asociación se traduce a menudo en puntajes de preferencia (valor relativo de elección de pareja), que se define como el tiempo con un hombre dividido por el tiempo que pasó con ambos machos en las zonas de elección de pareja una mujer focal.
3. Calcular si las hembras focal muestran un sesgo de lado durante la prueba de elección de pareja primero y excluyen hembras sesgadas del análisis final.
   Nota: Las hembras focal se consideran sesgo de lado si pasaron más de 90% del tiempo total (ambas mitades de la prueba de elección de pareja primero) en la misma zona de elección, incluso después de que fue cambiada la posición masculina. Su elección para un hombre entonces se considera como parte parcial y se termina el juicio.
4. Medir la longitud estándar de cada hembra focal (SL).
   Nota: Para impedir que los peces se destacó durante los experimentos, las mediciones se toman siempre después de la terminación de un estudio experimental.

Representative Results

Siguiendo el protocolo, utilizamos FishSim para crear animaciones de computadora de aletón virtual molly machos y hembras. Además utilizamos el toolchain para presentar animaciones para vivir las hembras focal en una situación de elección binaria para llevar a cabo un experimento MCC, según el procedimiento experimental descrito en la figura 1 y el paso 5 del protocolo.

Para determinar si las hembras focal copiaron la elección de la hembra del modelo virtual, medimos el tiempo de asociación focal femenina para cada macho dentro de la prueba de elección de la pareja primera y la segunda durante los experimentos. Varios parámetros se analizan típicamente usando tiempo de asociación obtenido en la primera y la prueba de segunda elección de la pareja para cada tratamiento y el control de la coherencia de la elección. Cómo los datos están siendo analizados no está vinculado a una prueba estadística específica pero se puede hacer de varias maneras (por ejemplo, paramétrico/no paramétricas, pruebas, medidas repetidas ANOVA, modelos estadísticos) y puede depender de la estructura de datos final. Para nuestro análisis de los datos, se utilizó el R 3.2.2⁶². Hemos cargado los datos en bruto se obtuvo en el experimento así como el código de R que hemos utilizado para nuestro análisis a Figshare (doi: 10.6084/m9.figshare.6792347).

En el estudio actual, hemos creado 15 hembras de diverso modelo virtual con un punto grávido para el tratamiento 1 y hembras de 15 modelo idéntico sin un lugar para el tratamiento 2. Todas las hembras de la modelo tenían una longitud estándar virtual (SL) de 50 mm. El área de punto grávido relativa era 4.7% de la superficie corporal total (excluyendo las aletas; medida con ImageJ v1.51j8) para todas las mujeres en el tratamiento 1. Además, hemos creado 30 machos de diferentes estímulos virtuales presentados durante las pruebas de elección de pareja, permitiendo 15 estímulos masculino singular maridaje. Estímulo machos tuvieron un virtual SL entre 41-45 mm. Realizamos 15 ensayos para cada tratamiento y el control de la coherencia de la elección. Probamos un número total de descendiente de 55 hembras focal vivo de mollies aletón salvaje capturado en la isla Mustang cerca de Corpus Christi, TX, Estados Unidos en 2014. Todas las hembras focal eran adultos maduros y se probaron solo una vez. Dos hembras tuvieron que ser excluido debido a problemas técnicos durante la prueba. Una mujer fue excluida debido al estrés ya que ella no adapte a la situación de prueba y tenía demasiado Mieda entrar en cualquier zona de elección. El control para el sesgo lateral en peces focal (paso 6.3 del Protocolo) requería que excluimos otras siete mujeres del análisis final debido a sus prejuicios de lado en la prueba de elección de pareja primero. En total, se analizaron un total de n = 15 hembras focal para cada tratamiento y el control. Las hembras focales tuvieron una media SL de 32 ± 5 mm en el tratamiento 1, 33 ± 5 mm en el tratamiento 2 y 33 ± 3 mm en el control de la coherencia de la elección. Comparamos la longitud estándar (SL) de hembras focal a través de tratamientos y el control mediante una prueba de suma de rango de Kruskal Wallis para revelar datos independientes que SL no difirió entre tratamientos y el control (prueba de Kruskal Wallis suma fila: n = 45, df = 2, χ² = 0,329, p = 0.848).

El parámetro más importante en un experimento MCC es la focal hembra Asociación para cada hombre (paso 6.1 del Protocolo). Asociación el tiempo es una medida indirecta de preferencia mate mujer pescado^63,64,65,66 y una medida establecida para determinar la elección de pareja en mollies aletón cuando ningún contacto directo es proporciona de^{12,48,61,67,68}. Para cada tratamiento y el control, primero utilizamos tiempo Asociación para analizar si la motivación elegir diferenció entre pruebas de elección de pareja. Elegir la motivación se define como el tiempo total una hembra focal en ambas zonas de elección dentro de una prueba de elección de pareja. Sin embargo, un cambio en la elección de motivación no necesariamente reflejan un cambio en la preferencia por cualquier hombre. Si la elección de motivación es significativamente diferente entre las dos pruebas de elección de pareja es obligatorio el uso de puntajes de preferencia en lugar de tiempo absoluto de la asociación, para su posterior análisis asegurar la comparabilidad dentro de y entre los tratamientos (ver protocolo paso 6.2 ). En nuestro estudio, elección de motivación de focal hembras antes y después de la observación de una hembra de modelo virtual interactuando sexualmente con un hombre no difirió en el tratamiento 1 (Wilcoxon firmado prueba rank: n = 15, V = 44, p = 0.379) y en el control para la opción () consistencia Wilcoxon firmado prueba rank: n = 15, V = 42, p = 0.33). Sin embargo, elegir la motivación fue significativamente mayor después de la observación de una hembra modelo virtual sin mancha grávida interactuando sexualmente con un hombre en el tratamiento 2 (Wilcoxon firmado prueba rank: n = 15, V = 22, p = 0,03).

El determinante más importante de si MCC producido es un incremento significativo en las puntuaciones de tiempo pasado/preferencia por el macho previo no preferidas de la primera a la segunda elección de pareja prueba²². Transferido a una situación natural, un aumento en tiempo pasado con el hombre prefirió no previo, por lo tanto aumenta la probabilidad de que una mujer se acoplará con ese hombre. Por lo tanto, el análisis principal en comparación con los tiempos absolutos o los puntajes de preferencia para el varón no preferido previo entre las dos pruebas de elección de pareja. Este análisis debe hacerse por separado para cada tratamiento y el control. Ya que en nuestro estudio, motivación elección difiere en el tratamiento 2, utilizamos puntuaciones de preferencia para el varón estímulos inicialmente no preferido, en lugar de tiempo absoluto de la asociación, para determinar si estos puntajes cambiaron entre la primera y segunda elección de pareja prueba cuando se proporcionó información pública, en comparación con el tratamiento control en el que la información pública era ausente.

Para esto, ajuste un modelo lineal de efecto mixto (LME) con la función de la lme en el paquete de 'nlme'⁶⁹ con puntuación de preferencia para el varón no preferido previo (pref_NP) como la variable dependiente. Se incluyeron pruebas de elección de pareja (Mtest: M1, M2) y tratamiento (tratamiento: no spot, mancha, control) como factores fijos así como estándar de longitud de la hembra focal (SL) como covariable. Para tener en cuenta para el diseño de medidas repetidas, la identidad femenina focal (ID) fue incluida como un factor aleatorio. Estábamos especialmente interesados en si el efecto de la prueba de elección de pareja fue diferente entre tratamientos; por lo tanto, se incluyeron una interacción entre la prueba de elección de pareja y el tratamiento en nuestro modelo. Se realizaron dos comparaciones ortogonales para el "tratamiento" mediante la función contrastes⁷⁰. Fijamos los contrastes del modelo (1) para comparar el control contra la media de todos los tratamientos en cualquier modelo virtual mujer fue presentada durante la observación [control >> (lugar, no lugar)] y (2) para comparar el tratamiento mostrando mujeres con un modelo virtual Spot contra eso sin un punto (punto >> no punto). Una parcela de los residuales estandarizados de un factor contra los valores ajustados reveló heterocedasticidad de la varianza residual para "Mtest". Por lo tanto, incluimos una función de pesos utilizando la clase varIdent de la función de la lme para permitir variaciones diferentes para cada nivel de "Mtest"^71,72. Se utilizó el paquete de R 'phia'⁷³ para un análisis post hoc con corrección de Holm-Bonferroni de términos de interacción significativa. Se analizaron hipótesis de modelo (Q y Q-parcelas, residuales, residuales contra valores ajustados) para todos los modelos visualmente⁷⁴. Además comparamos la distribución de los residuales contra una distribución normal con pruebas de normalidad de Shapiro-Wilk. Los valores de p dados se consideraron significativos si p ≤ 0.05.

Los resultados de este análisis se dan en la Figura 7A y las tablas 1 y 2. Se encontró una interacción significativa entre M2 y el contraste "[control >> (lugar, no lugar)]" para las puntuaciones de la preferencia del varón no preferido previo (LME: df = 42, t =-2.74, p = 0,009). Sin embargo, decenas de preferencia no fueron afectados por focal femenino SL. Más análisis post hoc del término interacción revelaron una diferencia significativa de puntajes de preferencia del varón no preferido previo en M2 en el tratamiento 1 (spot: df = 1, χ² = 30.986, p < 0.001) y tratamiento 2 (sin lugar: df = 1, χ² = 19,957, p < 0.001) pero no para el control (χ²-prueba: df = 1, χ² = 2,747, p = 0,097). Aquí, nuestros resultados demuestran, como se predijo por MCC, puntajes de preferencia para el varón virtual no preferido anterior aumentado significativamente de M1 a M2 después de focal hembras habían presentadas con la elección de pareja simulado de una hembra de modelo virtual. Encontramos este efecto en ambos tratamientos pero no en el control de la coherencia de la elección. En cambio, en el control donde ninguna mujer modelo estaba presente durante el período de observación, las hembras focal eran constantes en su elección de pareja para un hombre.

Factores	Inferior	Estimación	Superior	SE	DF	valor de t	valor de p
(Intercepto)	0.046	0.339	0.632	0.145	42	2.336	0.024
M2	0.207	0.296	0.384	0.044	42	6.750	< 0.001
Control → (spot, no punto)	-0.041	-0.012	0.017	0,014	41	-0.852	0.4
No punto → ningún lugar	-0.093	-0.043	0.008	0.025	41	-1,715	0,094
SL	-0.012	-0.003	0.006	0.004	41	-0.747	0.459
M2 x [control → (lugar, no lugar)]	-0.148	-0.085	-0.023	0.031	42	-2,743	0.009
M2 x (no punto → punto)	-0.067	0,042	0.15	0.054	42	0.777	0.441

Tabla 1. LME estimaciones para efectos en puntajes de preferencia para el varón virtual previo no preferida. Puntuación de preferencia para el estímulo masculino virtual no preferido previo fue la variable dependiente a lo largo. Dado son estimaciones ± error estándar y los intervalos de confianza más bajo superior, grados de libertad, valores de t y p-los valores para cada factor fijo. Interceptar las estimaciones representan la gran media de todos los tratamientos. Comparaciones ortogonales de los tratamientos se dan. Si los tratamientos se combinan en paréntesis, valores medios de estos tratamientos se utilizan en las comparaciones. La categoría de referencia de intercepción para el factor "M2" es "M1". Valores de p significativos (p < 0.05) se imprimen en negrita. M1 = prueba de elección de pareja primero, M2 = prueba de segunda elección de la pareja, SL = longitud estándar de la hembras focal. 90 observaciones n = 15 hembras focal por tratamiento.

Factor aleatorio	Varianza	SD
ID ((intercepto))	1.464x10-10	1.21x10-5
Residual	1.859x10-2	0.1364

Tabla 2. Componentes de varianza de la LME para focal mujer ID. La varianza y la desviación estándar para el efecto aleatorio "focal mujer ID" y los residuos figuran.

Figura 7: resultados del MCC virtual experimentan manipulando modelo mujer calidad visual ausencia o presencia de un punto grávido. (A) puntuaciones de preferencia para el varón de estímulo virtual no preferidos (previo) en M1 y M2 para tratamientos y el control. (B) cambio de preferencia de M1 a M2 (puntuación de copiado) para el previo no preferido virtual varón en los tratamientos y en el control. La línea punteada no representa ningún cambio en la preferencia, valores positivos muestran un aumento en la preferencia y los valores negativos muestran una disminución en la preferencia. Gris en los puntos A y B representan los datos en bruto de cada hembra focal. (C) número de revocaciones de la elección de pareja en M2 para cada tratamiento y el control. M1 = prueba de elección de pareja primero, M2 = segunda prueba de la elección de pareja, ns = no significativo * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001. N = 15 para tratamientos y el control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para obtener información adicional acerca de si un efecto copiado podría ser más o menos fuerte dependiendo del tratamiento respectivo, fue una comparación entre copiar el decenas y el número de revocaciones de la elección de pareja entre los distintos tratamientos y el control llevó a cabo. Por lo tanto, más analizamos si copias partituras para el varón no preferido previo fueron diferentes entre tratamientos. La puntuación de copia para un hombre describe el cambio en la preferencia femenina para un hombre de la primera a la segunda prueba de la elección de pareja. La puntuación de copia se define por la puntuación de preferencia de un hombre en la prueba de segunda elección de la pareja menos la puntuación de ese mismo hombre en la prueba de elección de pareja primero. Copiado de partituras oscilan entre -1 y + 1 y pueden ser valores positivos o negativos, en que los valores negativos describen una disminución en la preferencia y valores positivos un incremento en preferencia por ese hombre. Aquí, encajamos un LME con copia score (copy_NP) como la variable dependiente, como un factor fijo, focal SL mujer como covariable y zona punto focal de la mujer como un factor aleatorio. Aquí, se realizaron el mismo dos comparaciones ortogonales para el "tratamiento" como se describió anteriormente.

Como se muestra en figura 7B y tablas 3 y 4, se encontró significativamente mayor copia de puntuación para el varón no preferido previo en tratamientos con una hembra de modelo virtual en comparación con el control (LME: df = 20, t =-2.833, p = 0,01) pero no significativo diferencia entre los tratamientos (LME: df = 20, t = 0.618, p = 0.544). Copiado de partituras no fueron afectados por focal femenino SL.

Factores fijos	Inferior	Estimación	Superior	SE	DF	valor de t	valor de p
(Intercepto)	-0.889	-0.081	0.727	0.389	21	-0.208	0.837
Control → (spot, no punto)	-0.153	-0.088	-0.023	0.031	20	-2.833	0.01
No punto → ningún lugar	-0.079	0.033	0,146	0.054	20	0.618	0.544
SL	-0.013	0.011	0.035	0.011	20	0.991	0,333

Tabla 3. LME estimaciones para efectos en copiando partituras para el varón virtual previo no preferida. Copia cuenta para el estímulo masculino virtual no preferido previo fue la variable dependiente a lo largo. Dado son estimaciones ± error estándar y los intervalos de confianza más bajo superior, grados de libertad, valores de t y p-los valores para cada factor fijo. Interceptar las estimaciones representan la gran media de todos los tratamientos. Comparaciones ortogonales de los tratamientos se dan. Si los tratamientos se combinan en paréntesis, valores medios de estos tratamientos se utilizan en las comparaciones. Valores de p significativos (p ≤ 0.05) se imprimen en negrita. SL = longitud estándar de la hembras focal. 45 observaciones n = 15 hembras focal por tratamiento.

Factor aleatorio	Varianza	SD
spot_area ((intercepto))	0.028	0.166
Residual	0.075	0.275

Tabla 4. Componentes de la varianza del LME para el área focal de punto femenina. La varianza y la desviación estándar para el efecto aleatorio "spot_area" y los residuos figuran.

Además, probamos si el número de hembras focal que revirtió su preferencia mate inicial en M2 difirieron entre tratamientos. Revocación de la elección de pareja se define como si hay un cambio en la preferencia por un varón (de menos de 50% a más del 50% del tiempo en ambas zonas de elección) de la primera a la segunda prueba de la elección de pareja. Revocación de la elección de pareja se cuenta como un "sí" (la preferencia por un varón ha cambiado) o un "No" (preferencia por un varón no cambió). Aquí realizamos un post hoc pairwise G-test utilizando la R del paquete 'RVAideMemoire'⁷⁵ con la corrección de pruebas múltiples. Como se muestra en la figura 7, once de 15 hembras focal revirtió su elección de pareja en el tratamiento 1 y diez hembras revirtió su elección de pareja en el tratamiento 2. Por otra parte, sólo dos retrocesos se observaron en el control. Por lo tanto, el número de hembras focal que revirtió su elección de la pareja inicial a favor del hombre prefirió no previo m2 fue significativamente mayor en ambos tratamientos en comparación con el control (post hoc pares G-prueba: punto vs. control, p = 0,002; no spot vs control, p = 0.003) pero no significativamente diferentes entre los tratamientos 1 y 2 (Post-hoc pares G-prueba: no punto vs mancha, p = 0,69).

Discussion

El punto grávido en hembras de aletón molly fue descrito previamente para servir como un medio de anuncio de fertilidad hacia machos conespecíficos^59,60. Si un punto grávido puede también proporcionar la información a las hembras conespecíficos en el contexto de la elección de pareja había no se han probado hasta ahora. En el presente estudio de caso, investigamos el papel potencial de un punto grávido como fuente de información pública para la observación de hembras conespecíficos en el contexto del MCC. Nuestro estudio muestra que el punto grávido parece no ser un signo de calidad femenina modelo vivo hembras focal cuando decide copiar la elección de pareja de una mujer modelo virtual de un hombre virtual. Las hembras focal copian la elección de una hembra modelo virtual de un hombre virtual no preferido previa independientemente de si la mujer modelo tenía un grávido o no. No se encontraron diferencias en copiar partituras ni el número de revocaciones de la elección de pareja entre los dos tratamientos, indicando que el efecto copiar también era igual de fuerte si la hembra modelo tenía un grávido o no. Cuando no hay información pública fue proporcionada en el control (ninguna mujer modelo actual), las hembras focal eran constantes en su elección de pareja. Esto apoya que el cambio observado de preferencia dentro de los tratamientos puede explicarse por la presencia de la hembra del modelo virtual, proporcionar información pública suficiente para copiar la elección de pareja de los demás.

A pesar de la presencia general y el alcance del punto grávido se consideran relacionadas con el ciclo reproductivo femenino, con el punto ser mayor antes del parto y más pequeña o ausente después de dar a luz⁶⁰, sistemáticas observaciones visuales de la desarrollo de manchas grávidas en las hembras individuales todavía faltan. Por otra parte, variación en el tamaño de punto grávido puede ser alta entre hembras individuales con manchas también está totalmente ausente en las hembras grávidas, maduras⁶⁰. Aunque aletón molly hembras son poco más receptivo después de parto^59,76, son capaces de almacenar esperma por varios meses⁵⁷. Por lo tanto, las hembras siempre deben ser exigentes para el mejor mate de calidad. Con respecto a nuestro caso de estudio en MCC y las hipótesis comprobadas, concluimos que un punto grávido no puede ser un indicador válido de calidad mujer modelo para observar las hembras de la misma especie. Información sobre el estado reproductivo de una hembra modelo que posiblemente podría obtener una hembra observación parece no ser importante en la decisión de copiar su elección o no, al menos entre los mollies aletón.

En particular, nuestro estudio demuestra un procedimiento altamente estandarizado para la manipulación visual de información pública MCC experimentos utilizando pescado computadora animada. En contraste con un estudio anterior realizado por Benson⁷⁷, que inyectó tinta de tatuaje para manipular puntos grávidos a peces vivos, nuestro método ofrece una alternativa totalmente no invasivo para la manipulación visual. Nos describe en detalle el procedimiento para crear y animar mollies virtual aletón en FishSim. Además mostramos cómo animación por ordenador se puede utilizar para adoptar el procedimiento experimental de un clásico experimento de MCC con peces virtual para la presentación a prueba en vivo pescados en una situación de elección binaria.

Siguiendo el protocolo, identificamos varios pasos críticos que necesitan atención especial para asegurar el correcto manejo de nuestra toolchain y el éxito del experimento. Desde animaciones de computadora se crean y se presentó usando Computadoras y dispositivos de visualización como monitores de computadora, el equipo técnico siempre debe ser lo suficientemente bueno para asegurar un proceso suave del flujo de trabajo general y, más importante, la reproducción de la animación (pasos 2, 3 y 5). Cuando utilice a dos o más monitores para la presentación de estímulos, sus características técnicas deben ser idénticos. Al utilizar nuestro software, la resolución del monitor de sistema siempre debe ser la de la presentación monitores (ver paso 1.2.1.). Configuración de la escena (paso 1.2.) así como el diseño (pasos 1.3. y 1.4.) y animación (paso 2) de estímulos virtuales debe hacerse siempre en un monitor usado más tarde para presentación de estímulo durante los experimentos para asegurar las dimensiones correctas.

En este protocolo, nos concentramos en las medidas necesarias para crear un sistema de estímulos de peces (pasos 1.3. y 1.4.) para el uso en un ensayo de un tratamiento (paso 5). Aquí, nos gustaría señalar que es importante crear varios estímulos de diversos pescados o animaciones para dar cuenta de pseudoreplication^15,78,79 que afecta a la posible interpretación de los datos obtenidos durante los experimentos. Con nuestras herramientas, es fácil crear varios estímulos peces ofreciendo posibilidades para utilizar un único conjunto de estímulos para cada ensayo experimental. En general el número total de estímulos necesitada depende del tamaño de muestra previsto para cada tratamiento (ver sección "Resultados representativos" para obtener información sobre nuestro caso de estudio).

Con nuestras herramientas, hemos querido proporcionar un proceso rápido y fácil de crear animación mediante el uso de un regulador del juego video (paso 2). Por lo tanto, el comportamiento general de natación de los peces virtuales se genera automáticamente, basado en videos de natación aletón en mollies⁸⁰. Comportamiento de la natación (incluyendo movimiento de aletas y gonopodium) es, por lo tanto, atentos al uso de estímulos virtuales de mollies aletón en particular y del vivir-cojinete pescado en general. Aparte de peces del vivir-cojinete, una plantilla adicional para un espinoso proporciona funciones adicionales de movimiento propios de cada especie, como subir o bajar de espinas dorsales y ventrales.

Funciones de animación que actualmente ofrece nuestra toolchain podrían no ser suficientes para cada patrón de comportamiento y especies de peces. Esto, sin embargo, es hasta el usuario y depende de la pregunta de investigación probadas. Además, animación con FishSteering (paso 2) debe previamente un poco de práctica para acostumbrarse a las funciones del controlador de juegos de azar. Por lo tanto, el proceso de animación es probablemente el paso más desperdiciador de tiempo del protocolo. Un controlador de otra marca puede ser utilizado aquí, pero la funcionalidad no puede ser que lisa y las funciones de los botones (tal como se indica en el manual del usuario) pueden ser diferentes o totalmente ausente. Durante el proceso de animación, sólo una de las características de un estímulo virtual (por ejemplo, posición, aletas, gonopodium) puede ser animada a la vez. En primer lugar, el movimiento de la natación (posición) y luego más características (por ejemplo, aletas) pueden añadirse independientemente. Se recomienda guardar cada paso por separado. Esto ofrece la ventaja de que el usuario tiene la posibilidad de volver a una versión anterior de la animación al cambiar una característica específica, por ejemplo manteniendo constante el camino de la natación pero cambiando el movimiento de la aleta dorsal en comparación a una versión anterior. Especialmente al animar más pescado (paso 2.2.), el orden en que peces son animados los estímulos es muy importante y debe ser determinado previamente. Aquí, podría ser útil hacer referencia a la biología de las especies probadas. En nuestro caso de estudio, simuló el comportamiento de cortejo de los mollies aletón en que un varón es generalmente siguiente una mujer de⁸¹. Por lo tanto, primero creó el camino de la natación de la mujer virtual y añade la ruta de acceso para el hombre virtual siguiendo la hembra.

Cuando se ejecuta el procedimiento experimental (paso 5) el tiempo es crucial para el éxito del experimento. Los tiempos / períodos nos hemos referido en el protocolo (paso 5) derivado de estudios previos con aletón mollies. Deben considerarse como sugerencias y no están obligados por el éxito general de la experimental pero debe, sin embargo, firmemente seguir durante el procedimiento. Tiempo de aclimatación puede variar entre especies de peces e incluso individuos y generalmente debe ser siempre y cuando los peces focal tiene que explorar el depósito de toda prueba y aclimatarse a su nuevo entorno. Determinamos la longitud de la duración de pausa adecuada en carreras de formación del procedimiento experimental. La pausa debe ser al menos tan larga como el tiempo necesario para pescando con el cilindro, así como caminar a y desde el tanque de prueba y equipo operativo para liberar a los peces desde el cilindro. Aquí, los tiempos posiblemente variar dependiendo de la situación experimental concreta en cada laboratorio y de las especies probadas. En cualquier caso, el experimentador puede cambiar individualmente veces / duraciones o ajuste a un tiempo distinto en FishPlayer (ver paso 3.1. 3.) o mediante la creación de secuencias de animación con una longitud diferente (véase el paso 2.1).

El experimentador puede mejorar la medición del tiempo de la Asociación por cada prueba de elección de pareja mediante la implementación de un sistema de seguimiento automatizado, aunque debe ser capaz de seguimiento en tiempo real. Aquí, también queremos señalar que no hay posibilidad de tener un observador ciego y, por ende, ciego análisis cuando siguiendo el procedimiento para las pruebas de MCC. Puesto que el experimentador no puede saber que virtual estímulo masculino va ser el preferido por la mujer focal antes de la prueba, él o ella tiene que ser consciente de la elección del pez focal para reorganizar el orden de las secuencias de animación en consecuencia (ver pasos 3.2 y 5.10).

El protocolo que se describe aquí es específico para el diseño del estudio en MCC en mollies aletón. Sin embargo, la cadena de herramientas puede también utilizarse en combinación con otros diseños experimentales con hasta cuatro monitores de presentación. En general, herramientas de animación de computadora ofrecen una amplia variedad de soluciones para estudiar varias cuestiones sobre el comportamiento de peces como el compañero de elección, shoaling decisiones o detección de depredador-presa, utilizando estímulos visuales artificiales. Consideraciones generales de técnicas y conceptuales para el uso de la animación por ordenador en la investigación del comportamiento de los animales deben ser evaluados cuidadosamente antes de usar en experimentos^2,15. Lo más importante para la decisión de si se pueden implementar enfoques de la animación de computadora en la investigación considera que las capacidades visuales de las especies probadas y si responde naturalmente hacia estímulos virtuales presentados en pantallas de monitor. Especialmente, cuando se prueba el efecto de los aspectos de color, cabe señalar que pantallas de monitor sólo representan colores como valores RGB y que esto podría impedir o limitar posibilidades de investigación, aunque de hecho puede ser salida RGB color ajustado⁸². Para algunas especies de peces, una limitación sin duda puede ser que los monitores no emiten longitudes de onda UV o que, por otra parte, ciertos tipos de monitor altamente son polarizadas que podría ser una limitación con peces sensibles a la luz polarizada por ejemplo en las cuestiones de compañero de opción⁸³. Por lo tanto, una validación de la efectividad de los estímulos presentados como animaciones de computadora es necesaria antes de probar cualquier hipótesis^{2,12,15,84,85}.

En el futuro, nuevos avances en reconocimiento de seguimiento y acción animal hagan posible crear estímulos virtuales interactivos que reaccionan en tiempo real hacia peces vivos y simular el comportamiento correspondiente para aumentar masivamente el realismo para la observación de peces ⁸⁶. gracias a la modularidad de los ROS subyacente, dispositivos externos como cámaras pueden integrarse en la cadena de herramientas, siempre que el usuario tiene suficientes conocimientos de programación. Una primera tentativa acertada demostrada que FishSim puede utilizarse para simular estímulos peces virtual interactivo por extensión de un 3D en tiempo real de seguimiento sistema^87,88,89. Durante el evento de comunicación de la ciencia «Molly sabe mejor» (https://virtualfishproject.wixsite.com/em2016-fisch-orakel), hemos sido capaces de demostrar que peces virtuales se pueden programar para que siga vivo pescado focal en pantalla y realizar comportamiento de cortejo según un algoritmo predefinido. Además, estos sistemas de seguimiento en tiempo real podrían utilizarse para medir el tiempo de la Asociación automáticamente para mejorar el procedimiento experimental. Esta característica todavía no está incluida en la versión actual de FishSim pero depende del desarrollo futuro.

En conclusión, el uso de la animación por ordenador en la investigación del comportamiento animal es un enfoque prometedor cuando los métodos convencionales requeriría tratamiento invasivo de animales vivos para manipular la expresión de un rasgo visual o patrón de comportamiento. Manipulación de animaciones de computadora permite un alto grado de control y de normalización comparado con peces de prueba en vivo, sobre todo, ya que también ofrece soluciones para manipular el comportamiento que es muy limitada o incluso imposible en peces vivos. Además, en consonancia con el principio 3R y directrices similares para el uso de animales en investigación y docencia de^90,91, esta técnica tiene el potencial de 'reducir' y 'reemplazar' vivo animales, así como a 'perfeccionar' experimental procedimientos en la investigación.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hardware
2x 19" Belinea LCD displays	Belinea GmbH, Germany	Model 1970 S1-P	1280 x 1024 pixels resolution
1x 24" Fujitsu LCD display	Fujitsu Technology Solutions GmbH, Germany	Model B24-8 TS Pro	1920 x 1080 pixels resolution
Computer			Intel Core 2 Quad CPU Q9400 @ 2.66GHz x 4, GeForce GTX 750 Ti/PCIe/SSE2, 7.8 GiB memory, 64-bit, 1TB; keyboard and mouse
SONY Playstation 3 Wireless Controller	Sony Computer Entertainment Inc., Japan	Model No. CECHZC2E	USB-cable for connection to computer
Glass aquarium			100 cm x 40 cm x 40 cm (L x H x W)
Plexiglass cylinder	custom-made		49.5 cm height, 0.5 cm thickness, 12 cm diameter; eight small holes (approx. 5 mm diameter) drillt close to the end of the cylinder lower the amount of water disturbance while releasing the fish
Gravel
2x OSRAM L58W/965	OSRAM GmbH, Germany		Illumination of the experimental setup
2x Stopwatches
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
ubuntu 16.04 LTS			Computer operating system; Download from: https://www.ubuntu.com/
FishSim Animation Toolchain v.0.9			Software download and user manual (PDF) from: https://bitbucket.org/EZLS/fish_animation_toolchain
GIMP Gnu Image Manipulation Program (version 2.8.22)			Download from: https://www.gimp.org/