Summary
هذا البروتوكول يوفر طريقة فعالة ومنخفضة التكلفة الكشف عن الفيروسات Zika أو التحكم في الأهداف في عينات البول ومصل الدم البشري أو البعوض بالنسخ العكسي بوساطة حلقة متحاور التضخيم (RT-مصباح). هذا الأسلوب لا يتطلب عزل الجيش الملكي النيبالي ويمكن أن يتم في غضون 30 دقيقة.
Abstract
الإصابة بفيروس زكى (زيكف) يمكن أن تكون أعراض عند البالغين، إلا أن العدوى خلال الحمل يمكن أن يؤدي إلى الإجهاض، والتشوهات الخلقية العصبية الحادة. والهدف من هذا البروتوكول بسرعة الكشف عن زيكف في عينات من الإنسان والبعوض. معيار الذهب الحالي للكشف عن زيكف هو النسخ العكسي الكمي PCR (قرة-PCR)؛ عكس النسخ بوساطة حلقة التضخيم متحاور (RT-مصباح) قد تسمح لاختبار أكثر كفاءة وتكلفة منخفضة دون الحاجة إلى معدات مكلفة. في هذه الدراسة، يتم استخدام RT-مصباح للكشف عن زيكف في عينات بيولوجية مختلفة داخل 30 دقيقة، دون الأول عزل الحمض النووي الريبي من العينة. ويتجلى هذا الأسلوب استخدام زيكف إصابة المريض البول والمصل، وإصابة عينات البعوض. الحمض النووي الريبي ريبوسومال 18S واكتين تستخدم كعناصر تحكم في نماذج الإنسان والبعوض، على التوالي.
Introduction
في عام 2015، Zika الفيروسات (زيكف) اكتسبت الاهتمام العالمي البارز كمرض معد للقلق لأنه يرتبط ارتباطاً العدوى خلال الحمل بالإجهاض، الاملاص، والعيوب الخلقية العصبية الحادة بما في ذلك صغر الرأس، فضلا عن سائر خلقي 1من العيوب الخلقية. في حالات نادرة، ارتبطت زيكف بمتلازمة غيان-باريه. زيكف تنتقل أساسا عن طريق بعوض؛ ومع ذلك، فإنه أيضا يمكن أن ينتشر عن طريق الاتصال الجنسي1. نظراً لأن العدوى مع زيكف غير متناظرة في معظم الناس، أو يعرض بأعراض تشبه الإنفلونزا خفيفة تتداخل مع أعراض عدوى أخرى أربورفيروسيس1، كان هناك حاجة لتحسين أساليب الكشف السريع وفعالة من حيث التكلفة من زيكف شاشة كل الناس، فضلا عن السكان المحليين من البعوض.
النسخ العكسي الكمي PCR (قرة-PCR) تحليل موثوق بها للكشف عن زيكف؛ ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب تكلفة المعدات المتخصصة والموظفين المدربين وعزل الحمض النووي الريبي من العينة للفائدة. النسخ العكسي بوساطة حلقة متحاور التضخيم (RT-مصباح) هو أسلوب تضخيم حمض النووي خطوة واحدة تستند إلى تقنية PCR فقط تتطلب درجة حرارة الحضانة واحد نتيجة لاستخدام بوليميراز الدنا لاسخدام مع حبلا خصائص التشرد. هذا تلتف الحاجة ثيرموسيكلير ويقلل من طول الفترة الزمنية اللازمة لإتمام المقايسة. وتشمل المزايا الإضافية RT-مصباح خصوصية عالية وحساسية، ومتانة في طائفة من مستويات الحموضة ودرجات الحرارة، ومقاومة ل مثبطات بكر العديد من2. أنها منخفضة التكلفة نسبيا والكاشفات مستقرة عند درجة حرارة الغرفة. ونظرا لهذه الخصائص، يمكن نشر RT-مصباح في مختبر أو في الميدان. وقد وضعت على هذا النحو، مصباح ردود الفعل للكشف عن مجموعة من العوامل الممرضة وأنواع أخرى من العدوى3،،من45. وهدف البروتوكول RT-مصباح، المذكورة في هذه الورقة الكشف عن زيكف دون عزل الحمض النووي الريبي في البشرية عينات مصل الدم والبول، وكذلك كما هو الحال في بعوضة مصابة واحدة خلال 30 دقيقة عن طريق RT-مصباح. يمكن استخدام هذا الأسلوب لاستبدال قرت-بكر كما هو أداة تشخيصية الحساسة والسريعة التي تعمل بسرعة وفي بيئات خارج المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا بالمؤسسية استعراض المجلس (مجلس الهجرة واللاجئين) الصحة بومونت. جميع التجارب التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة والأنظمة.
تنبيه: ينبغي معالجة جميع المواد المعدية يحتمل أن تكون وفقا لمعايير السلامة البيولوجية المستوى 2 بما في ذلك استخدام معدات الحماية الشخصية. ينبغي القيام بأي من الإجراءات التي قد تنتج الهباء الجوي في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي القيام بعمل مع البعوض يعيش في مرفق مفصليات الأرجل احتواء المستوى 1-3 مناسبة. نظراً لرابطة زيكف الإصابة بتشوهات خلقية، النساء الحوامل، تحاول أن تصور، أو الشركاء في هذه المرأة ينبغي كثيرا التقليل من تعرضهم المختبر إلى زيكف. نقل العينات زيكف تصنف في الولايات المتحدة "فئة ب المواد البيولوجية" وفقا لإدارة اللوائح المتعلقة بالنقل الخطرة المواد (49 CFR Part 171-180) وشحن العينات ولذلك ينبغي أن تلتزم تلك المبادئ التوجيهية. يتطلب استيراد بيوسبيسيمينس "الولايات المتحدة من زيكف" مراكز لمكافحة الأمراض والوقاية منها تراخيص الاستيراد. استيراد أي المفصليات التي يمكن أن تكون بمثابة ناقل لنقل زيكف، وحتى لو كانت غير مصابة، يتطلب الحصول على تصريح "وزارة الزراعة في الولايات المتحدة" (وزارة الزراعة). تعتبر هذه المعلومات الحالية في وقت النشر. يمكن الاطلاع على أحدث التوصيات في https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html.
ملاحظة: ردود الفعل RT-مصباح هم عرضه لمعدلات أعلى من ردود الفعل الإيجابية الكاذبة، حيث ينبغي اتخاذ الاحتياطات في التخطيط التجريبية. يجب استخدام جميع الإعداد والتنفيذ لردود الفعل RT-مصباح الماصات المعينة ونصائح عامل التصفية. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تنشأ تدفق عمل الوحشي. إذا كان ذلك ممكناً، يجب أن يتم التحليل والتصوير (القسم 5) في غرفة مغلقة منفصلة لمنع التلوث. ينبغي أن تظل فتح أنابيب الاختبار التي تحتوي على منتجات RT-مصباح إلى الحد أدنى.
1 التحضير التمهيدي RT-مصباح
- إعادة تشكيل كل التمهيدي RT-مصباح المجففة بالتبريد في الماء الصف الجزيئية لتركيز نهائي من 100 ميكرومتر (الجدول 1). باختصار دوامة الحل التمهيدي لضمان حل متجانسة وتدور بإيجاز إلى الأسفل الحل بأقصى سرعة ممكنة في جدول أعلى أجهزة الطرد مركزي لجمع جميع التمهيدي الحل.
- إعداد 10 × RT-مصباح "التمهيدي مزيج" من الإشعال FIP، المقاضاة، F3، B3، والمجلة، ورطل استخدام وحدات التخزين الموجودة في الجدول 2. باختصار دوامة الحل التمهيدي لضمان حل متجانسة، وتدور بإيجاز إلى الأسفل الحل بأقصى سرعة ممكنة في جدول أعلى أجهزة الطرد مركزي لتجنب أي خسارة.
ملاحظة: لا تحتوي على مصباح RT التمهيدي عبد اللطيف-مصرية أكتين (عايض) تمهيدي رطل (كبسولة تفجير حلقة ليست دائماً ضرورية لردود الفعل RT-مصباح). في هذه الحالة، استبدال وحدة التخزين التمهيدي رطل مع المياه الصف الجزيئية. - تخزين الإشعال في-20 درجة مئوية بين الاستخدامات وتجنب دورات مجانية من الدفء.
2. إعداد نموذج
- لعينات البول البشري: استخدام أما البول الطازجة أو المجمدة البول أو البول في حافظة. للعينة الطازجة أو المجمدة: فورا تدور أسفل العينة بعد جمع لمدة 10 دقيقة في 700 x ز، واستخدام المادة طافية للتحليل أو تجميد في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. ذوبان الجليد العينات المجمدة على الجليد قبل الاستخدام.
- لعينات مصل الدم البشري: استخدام أما عينات مصلية الطازجة أو المجمدة.
-
زيكف المصابة خطوط الخلايا: استخدام وسائل الإعلام مشروطة أو خلية ليساتيس.
ملاحظة: الخلية الحرة مكيفة وسائل الإعلام من عبد اللطيف. albopictus الخلايا C6/36 8 أيام بعد العدوى يمكن استخدامها كعناصر إيجابية لردود فعل زيكف RT-مصباح. -
للبعوض Ae-مصرية : استخدام أما جثث البعوض كاملة طازجة أو مجمدة. ذوبان الجليد البعوض مجمدة في الجليد. إعداد البعوض خام ليساتي عن طريق بعوضة فردية في 100 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وتجانسه بسحق البعوض 10 مرات مع تلميح بيبيت P10 (الشكل 1). باختصار الطرد المركزي النفط الخام بيليه أي حطام. استخدام المادة طافية للمتلقين للمعلومات مصباح RT التحليل.
ملاحظة: يمكن إنشاء عناصر إيجابية في إعداد مختبر بإصابة أنثى البعوض باستخدام microinjection الوعائي مع مكافئات الجينوم3 حوالي 10 من الفيروس في مجلد من 200 nL وحصاد البعوض 5 أيام ما بعد الإصابة.
3-إعداد مزيج ماجستير RT-مصباح
- إعداد رد فعل مزيج رئيسي RT-مصباح على الجليد للتمهيدي كل تعيين لاستخدامها باستخدام دليل التخزين في الجدول 3.
ملاحظة: الاستخدام من اليوراسيل ثيرمولابيلي DNA Glycosylase (UDG) يساعد في منع المغلوطة. - ثم تدور دوامة بإيجاز لضمان أن جميع العينات جيدا مختلطة، أسفل بإيجاز لمنع فقدان وحدة التخزين.
4-RT-مصباح بالانزيم
-
بيبيت 23.0 ميليلتر مزيج الرئيسي RT-مصباح كل رد فعل في أنبوب بكر 200 ميليلتر. إضافة ميليلتر 2.0 من عينة البول (مصل الدم، أو المادة طافية ليستي البعوض النفط الخام كما هو موضح في الخطوة 2). وهذا سيجلب الحجم الإجمالي ميليلتر 25.0 كل رد فعل RT-مصباح. لمراقبة سلبية، استخدام المياه الصف الجزيئية. إدراج عنصر تحكم إيجابية.
ملاحظة: يمكن استخدام أرصدة القياسية أو الفيروسات PCR من المادة طافية خطوط الخلايا المصابة كعنصر إيجابي.- اختياري: تشمل فعل تحكم خصوصية المفصليات ذات الصلة مثل فيروس حمى الضنك (DENV). تحضير العينة كما هو موضح في الخطوة 2 وفقا لنوع العينة. إضافة ميليلتر 2.0 لمراقبة النوعية إلى 23.0 ميليلتر من مزيج RT-مصباح رئيسية في أنبوب بكر 200 ميليلتر.
- الحرارة العينات من 61 درجة مئوية مدة 30 دقيقة باستخدام كتلة الحرارة أو حوض ماء، أو ثيرموسيكلير.
- إلغاء الحرارة بوليميراز بالتدفئة إلى 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
5-مصباح RT التحليل
ملاحظة: إجراء تحليل RT-مصباح في مساحة منفصلة، والمغلقة.
-
بعد الحضانة، الوصول إلى ردود فعل RT-مصباح بصريا بالنظر لوجود تغيير اللون.
- يضعف الحمض النووي نيون صبغ 01:10 في المخزن المؤقت تاي (40 مم تريس، 20 ملم حمض الخليك، يدتا 1 مم).
تنبيه: أي وصمة عار الحمض النووي بربط الأحماض النووية وذلك هو مادة مسرطنة. ارتداء القفازات عند التعامل. - إلى 12 ميليلتر من رد فعل RT-مصباح، إضافة 2 ميليلتر لتمييع صبغة الفلورسنت الحمض النووي.
ملاحظة: ردود الفعل السلبية سوف تكون برتقالية اللون وردود الفعل الإيجابية ستكون الأصفر/أخضر اللون. - اختياري: التقاط صور لردود الفعل RT-مصباح على خلفية بيضاء باستخدام كاميرا.
- يضعف الحمض النووي نيون صبغ 01:10 في المخزن المؤقت تاي (40 مم تريس، 20 ملم حمض الخليك، يدتا 1 مم).
- وضع العينات تحت الأشعة فوق البنفسجية نانومتر 302 الخفيفة لتأكيد وجود منتجات RT-مصباح بالأسفار. التقاط صورة للنتيجة باستخدام كاميرا.
ملاحظة: سوف يكون ردود فعل إيجابية RT-مصباح إخراج فلورسنت.
تنبيه: ارتداء درع غوغل أو الوجه واقية العين الأشعة فوق البنفسجية عند العمل مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. -
اختياري: تأكيد وجود منتجات RT-مصباح قبل تنفيذ استشراد هلام على العينات.
- صب 2% [اغروس] هلام في المخزن المؤقت x TAE 1 مع وصمة حمض النووي للتصور.
تنبيه: أي وصمة عار الحمض النووي بربط الأحماض النووية وذلك هو مادة مسرطنة. ارتداء القفازات عند التعامل. - إضافة 5 ميليلتر سلم الحمض النووي في الممر الأول لمقارنة الأوزان الجزيئية.
- لكل رد فعل RT-مصباح، مزيج ميليلتر 13 RT-مصباح رد فعل خليط مع 2 ميليلتر لتحميل صبغ الحمض النووي. تحميل الخليط 15 ميليلتر التي تحتوي على الحمض النووي تحميل صبغ.
- تشغيل الهلام في 90 الخامس لمدة 90 دقيقة أو حتى يتم فصل العصابات والصورة مع 302 ضوء الأشعة فوق البنفسجية في شمال البحر الأبيض المتوسط.
ملاحظة: ردود فعل إيجابية RT-مصباح سيكون نمط لاديرينج. لا يجب أن يتضمن ردود الفعل السلبية RT-مصباح أي العصابات.
- صب 2% [اغروس] هلام في المخزن المؤقت x TAE 1 مع وصمة حمض النووي للتصور.
6-التصرف
- التخلص من ردود الفعل RT-مصباح في حقائب مختومة مزدوجة. عدم اﻷوتوكﻻف كهذا قد أيروسوليزي للمنتجات RT-مصباح، مما أدى إلى ردود فعل إيجابية كاذبة في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن تحليل ردود فعل RT-مصباح باستخدام ثلاث طرق مختلفة. أولاً، مع إضافة صبغة الفلورسنت الحمض النووي، ستكون ردود الفعل الإيجابية الأصفر/أخضر اللون حيث ستظهر ردود الفعل السلبية برتقالية اللون للعين المجردة. ثانيا، يؤدي إضافة صبغة الفلورسنت الحمض النووي لرد فعل RT-مصباح إشارة فلورسنت عند العينات متحمسون بالأشعة فوق البنفسجية. ردود الفعل السلبية لن يكون إشارة فلورية القابلة للكشف على أي الأسفار الخلفية التي قد تكون موجودة بكميات صغيرة في مراقبة سلبية. وأخيراً، يمكن تشغيل RT-مصباح ردود الفعل على [اغروس] هلام. ردود الفعل الإيجابية RT-مصباح سيكون نمط النطاقات، بينما سيكون لها ردود فعل سلبية لا عصابات الحمض النووي. وأظهرت الأمثلة على هذا استخدام كل ثلاثة من هذه الأساليب تحليل في الشكل 2 و 3. أيا من هذه العينات كان الجيش الملكي النيبالي معزولة قبل RT-مصباح. يوضح الشكل 1 سحق البعوض كله في برنامج تلفزيوني، وكافية للاستعمال في رد فعل RT-مصباح. ويظهر في الشكل 2، خصوصية رد فعل زيكف RT-مصباح: السيطرة الجزيئية زيكف فقط، وليس DENV الجزيئية عنصر التحكم أو السيطرة السلبية، وقد فعل RT-مصباح إيجابي. وعلاوة على ذلك، يتم الكشف عن زيكف في البول والمصل للمريض بالعدوى زيكف المعروفة، ولكن ليس في المريض أعراض التحكم دون الإصابة زيكف (الشكل 2أ). في الشكل 2ب، يتم اختبار العينات للبشرية 18s الرنا الريباسي استخدام الرايت-مصباح. فقط العينات من المرضى (البول أو مصل الدم)، ولكن لا عناصر التحكم الجزيئي أو المراقبة السلبية، إيجابية بالنسبة 18s الرنا الريباسي. ولذلك، 18s الرنا الريباسي RT-مصباح يمكن استخدامها كعنصر تحكم الجودة لردود فعل RT-مصباح للعينات من المرضى البشر. وبالمثل يمكن اختبار عينات البعوض زيكف أو مراقبة الجودة RT-مصباح، عايض (الشكل 3). في هذا المثال، يتم التحكم الجزيئي الإيجابية زيكف، فضلا عن البعوض مصابة زيكف إيجابية بالنسبة زيكف. مراقبة سلبية، السيطرة الجزيئية ل DENV، موك إصابة البعوض (البعوض ميكروينجيكتيد مع وسائل الإعلام في ثقافة الخلية التي تحتوي على أي فيروس)، والبعوض DENV المصابة كلها سلبية زيكف (الشكل 3أ). بيد أن جميع البعوض إيجابية بالنسبة عايض قبل RT-مصباح (الشكل 3ب).
عندما يكون ذلك ممكناً، ينبغي استخدام جميع الأساليب التحليلية الثلاث لتأكيد فعل إيجابية أو سلبية في بعض الأحيان يمكن أن يكون إشارة الفلورسنت ضعيفة، وبعض الأفراد قد يكون اللون أعمى، مما يجعل من الصعب على تحديد تغيير اللون البصرية. في الحالات التي يكون فيها عنصر سلبي إيجابي، مجموعة كاملة من عينات اختبار غير صحيح كالتلوث و ولذلك لا يمكن استبعاد المغلوطة. في الحالات التي يكون فيها عنصر إيجابي سلبي، مجموعة كاملة من عينات غير صالحة كما قد لا تكون عملت رد فعل RT-مصباح. هذا قراءة نوعية بها، بيد نسخ أعلى من الفيروسات سوف يسفر عن زيادة في منتجات RT-مصباح التي يمكن تقدير شدة الفلورسنت أو بالكثافة من النطاقات نمط الحمض النووي بالتفريد جل.
الشكل 1 : إعداد البعوض الخام ليساتي. (أ) مكان البعوض إلى 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني في أنبوب ميكروسينتريفوجي. (ب) استخدام تلميح بيبيت P10، سحق البعوض ضد الجانبين من الأنبوب 10 مرات. (ج) وهذا ينتج الخام ليستي التي ينبغي أن نسج أسفل بإيجاز في جدول أعلى أجهزة الطرد مركزي بيليه الحطام. ينبغي أن تستخدم فقط المادة طافية لرد فعل RT-مصباح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : زيكف و 18S الرنا الريباسي RT-مصباح في عينات البول والمصل المريض. عينات البول أو المصل من مراقبة أعراض المريض (C01) أو زيكف إصابة المريض (Z01) تعرضوا زيكف (A) أو 18S الرنا الريباسي (ب) ردود فعل محددة RT-مصباح. وقد تصور ردود الفعل RT-مصباح بعد إضافة الحمض النووي نيون صبغ بالأسفار العين (اللوحة العلوية)، الأخضر (الفريق الأوسط)، أو هلام استشراد (أسفل اللوحة). لين م: الحمض النووي الشامل علامة؛ المجلس الوطني الانتقالي: لا قالب مراقبة (السلبية)؛ زيكف: زيكف PCR التحكم القياسية الإيجابية؛ DENV: DENV مراقبة إيجابية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : زيكف وعايض RT-مصباح في الزاعجة المصرية عبد اللطيف. . واحد Ae. مصرية مصابة بمراقبة صورية أو زيكف أو DENV تعرضوا زيكف (A) أو عايض (ب) محددة RT-مصباح ردود الفعل. وقد تصور ردود الفعل RT-مصباح بعد إضافة الحمض النووي نيون صبغ بالأسفار العين (اللوحة العلوية)، الأخضر (الفريق الأوسط)، أو هلام استشراد (أسفل اللوحة). لين م: الحمض النووي الشامل علامة؛ المجلس الوطني الانتقالي: لا قالب مراقبة (السلبية)؛ زيكف: زيكف PCR التحكم القياسية الإيجابية؛ DENV: DENV مراقبة إيجابية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الهدف | التمهيدي | تسلسل (5 '-3') | ||
| هومو كلمن 18S الرنا الريباسي | 18SrRNA--FIP * 18SrRNA-الهيئة * 18SrRNA--F3 18SrRNA--B3 18SrRNA--المجلة 18SrRNA رطل |
تجككتكاجتككجاااككاككتجاتاككجكاجكتاج جكاتكجتاتجكجككجكتجكااتجكتتكجكتكتج جتكااجكاجكككجاج ككتككجاكتتكجتكتجا أجاككجكجتككتاتككاتات أتتككتجاككجكجكاج |
||
| زيكف | زيكف--FIP * زيكف-الهيئة * زيكف--F3 زيكف--B3 زيكف--المجلة زيكف رطل |
آككتجاججكاتجتجكااككجكجتكاجتجاجاتجاكت كاكاجاجتجااكككتكجاكتجاجتجتججاجكاجا جكاجاجكاتجاتججاتا كككاتككتجاجتاكاجكت تكجاتجكتكاكاكجك جاجكاتججاجاجتكك |
||
| عبد اللطيف. أكتين الزاعجة المصرية | Ae21--FIP * Ae21-الهيئة * Ae21--المجلة Ae21--F3 Ae21--B3 |
تجكتجتكككتجككتججاجاكاجكككاككاجاكجا جاجاكجاجاكجكككاجكججتكتجتجتجتجتكتتج أككجكاجككاجاككج كجكجككاككاكاجا تكجتجككتجتجتتجتكج |
||
| * يجب تنقية الإشعال بسرعة عالية الأداء اللوني السائل ([هبلك]). لجميع أجهزة الإشعال الأخرى، تكون الشروط القياسية الملحي كافية. | ||||
الجدول 1: تسلسل التمهيدي لردود الفعل RT-مصباح- تسلسلات التمهيدي يرد أصلاً في السابق نشر6.
| وحدة التخزين (ميليلتر) | التمهيدي | تركز الأسهم (ميكرومتر) | التركيز النهائي (ميكرومتر) |
| 80 | التمهيدي الداخلية إلى الأمام (FIP) | 100 | 16 |
| 80 | التمهيدي الداخلية المتخلفة (المقاضاة) | 100 | 16 |
| 10 | التمهيدي الخارجي إلى الأمام (F3) | 100 | 2 |
| 10 | التمهيدي الخارجي إلى الخلف (B3) | 100 | 2 |
| 20 | حلقة الأمام (LF) | 100 | 4 |
| 20 | حلقة المتخلفة (رطل) | 100 | 4 |
| 280 | المياه الصف الجزيئية | - | - |
| 500 | المجموع |
الجدول 2: إعداد 10 x ميكس التمهيدي RT-مصباح- لا تحتوي على تمهيدي فرنك بلجيكي؛ التمهيدي RT-مصباح مصرية أكتين عبد اللطيف. استبدال وحدة التخزين هذه بالماء.
| 1 x حجم (ميليلتر) | المكون | الأسفلت النهائي 25 ميليلتر حجم |
| 2.5 | 10 × التضخيم إيسوثيرميك المخزن المؤقت | س 1 |
| 1.8 | 100 ملم dU/A/T/C/خلال | 1.4 مم |
| 2.0 | 100 مم MgSO4 | 6 + 2 مم في المخزن المؤقت = 8 مم [نطاق مم 4-10] |
| 2.5 | كبسولة تفجير x 10 | 1.6 ميكرون FIP/المقاضاة، 0.2 ميكرون F3/B3، 0.4 ميكرومتر FL/BL |
| 1.0 | بوليميراز الدنا لاسخدام مع التشرد حبلا (8,000 U/mL) | 8 يو |
| 0.5 | المنتسخة العكسية (15,000 U/mL) | 7.5 يو |
| 0.5 | UDG (1,000 U/mL) | 0.5 يو |
| 12.3 | المياه الصف الجزيئية | - |
| 23.0 | المجموع |
الجدول 3: إعداد مزيج RT-مصباح الأصول الرأسمالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الإنزيم زيكف RT-مصباح المبينة في هذه الورقة يعمل استخدام عينات الإنسان والبعوض6. كان الحد الأقصى للكشف عن حوالي 1 الجينوم ما يعادل6، الذي ينبغي أن يكون كافياً نظراً للحمل الفيروسي نموذجية للمريض زيكف المصابين بأعراض 103 إلى 10 مل بفو/6 7. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الكشف عن هذا الأسلوب زيكف في عينات دون الأولى عزل الحمض النووي الريبي ودون تضخيم الفيروس في خلية ثقافة. وهذا يقلل بشكل ملحوظ الوقت والكلفة، والمخاطر الصحية لهذا الفحص بالمقارنة مع قرة-بكر.
عينات البول المستخدمة في نسبة حجم المشار إليها في هذا البروتوكول ينبغي أن تسمح RT-مصباح ردود الفعل أن تحدث دون عزل الحمض النووي الريبي. بينما واحدة يمكن نظرياً زيادة كمية العينة المستخدمة في رد فعل RT-مصباح، ينبغي توخي الحذر عندما يكون هذا العينة البول. البول يحتوي على عدة من المواد الكيميائية التي يمكن أن تحول دون ردود فعل بكر؛ اليوريا في البول ومن المعروف أن تتحلل [بولمرس]8 وسيمنع استخدام نسبة البول/RT-مصباح رد فعل عالية جداً رد فعل RT-مصباح. إذا كان من المتوقع على كمية منخفضة من الفيروس، يكون من الأفضل القيام بعزل الحمض النووي الريبي استخدام أدوات محددة للبول. وبالمثل، يمكن أن تحتوي على مصل مثبطات PCR التي قد تمنع RT-مصباح عند استخدام مصل في أعلى المجلد8.
وهو إدراج ضوابط الجودة لردود الفعل RT-مصباح، أقرب إلى عنصر تحكم تحميل في البروتوكولات الغربية النشاف المدرجة في هذا البروتوكول. إذا عينة سريرية سلبية لمراقبة نوعية RT-مصباح، ثم إلى رد فعل سلبي زيكف RT-مصباح قد تكون سلبية كاذبة العينة قد تحتوي على كمية عالية من مثبطات PCR أو كميات قليلة من مجموع الجيش الملكي النيبالي. فإنه ليس من الضروري لعزل الحمض النووي الريبي من العينة قبل التحليل RT-مصباح. تم التوصل إلى النتائج RT-مصباح الممثل في هذا البروتوكول دون عزل الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، عزل الحمض النووي الريبي قد تحسين الكشف عن العينات مع تحميل الفيروس منخفضة أو التي قد تحتوي على مستويات عالية من مثبطات PCR. لمعظم أنواع العينة بما في ذلك المصل، يمكن استخدام مجموعة مواد عزل الحمض النووي الريبي يتبع البروتوكول المقترح الخاص بالشركة المصنعة. لعينات البول، وينبغي أن تستخدم مجموعة مواد عزل الحمض النووي الريبي محددة لعينات البول. لعينات البعوض، من المستحسن أن البعوض عن طريق تشغيل البعوض في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني عن طريق عمود تمزيق لمدة 2 دقيقة في الحد الأقصى للسرعة أو دونسينج قبل عزل الحمض النووي الريبي. يمكن التيد في 30 ميليلتر من المخزن المؤقت شطف الحمض النووي الريبي وتخزينها في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
ثم يقترح عزل الحمض النووي الريبي إزالة مثبطات بكر الذاتية أو تركيز الحمض النووي الريبي قبل RT-مصباح. إذا مراقبة الجودة RT-مصباح لا يزال سلبيا، ثم يجب استخدام قرة-PCR للكشف عن زيكف.
تأكدت الإشعال RT-مصباح في هذا البروتوكول على العمل في نطاق من درجات الحرارة (57-65 درجة مئوية)، وحضانة مرات (8-60 دقيقة)، فضلا عن استخدام غير تقليدية تدفئة المصادر (مثلاً.، سخان تحديثية الحصص التموينية، وحوض ماء) خارج المعيار الظروف المختبرية. وأعطى جميع درجات الحرارة اختبار النتائج قابلة للمقارنة. بناء على الكشف عن تغيير اللون البصرية وحدها، كان الوقت الأمثل للكشف عن المنتجات زيكف RT-مصباح 30 دقيقة. ومع ذلك، الكشف بالأشعة فوق البنفسجية الإثارة الخفيفة أو النطاقات النقوش على المواد الهلامية كانت إيجابية مع أقل قدر من 8 دقيقة حضانة مجموع وقت. وتشمل بعض البروتوكولات RT-مصباح [دمس]، ولكن في هذا البروتوكول، فإنه يمكن أن ينتج تثبيط رد فعل RT-مصباح. استخدام بوليميراز الدنا الحرارة التي يمكن إعدادها في درجة حرارة الغرفة وقد مزايا أكثر بوليميراز الدنا لاسخدام البرية من نوع بما في ذلك أسرع بتضخيم الإشارات وازدادت الاستقرار في درجة حرارة الغرفة9،10 . اثيديوم بروميد يمكن أن تستخدم بدلاً من ذلك التصور الحمض النووي في الجل 2% [اغروس]، ومع ذلك، الأخرى الأصباغ الفلورية الحمض النووي للجل [اغروس] أقل إمكانيات مطفرة يجعلها خياراً أكثر أماناً. ومع ذلك، يجب لا يزال استخدام احتياطات السلامة المناسبة مثل ارتداء القفازات.
حد من هذا البروتوكول هو أنه نوعي ولا أسلوب كمي، ومع ذلك، يمكن أن يتم التحديد الكمي النسبي6. وعلاوة على ذلك، الإشعال RT-مصباح محددة للغاية وقد صممت ضد تسلسل يحافظ على درجة عالية من البروتين نونستروكتورال من زيكف التي يتم العثور عليها في سلالات 16 والتحقق منها للعمل في سلالات على الأقل 565. فمن الممكن أن الطفرات الواسعة إلى زيكف في البرية قد لا يمكن كشفها بواسطة كبسولة تفجير هذه في المستقبل. ووضعت المجموعات الأخرى أيضا تقنيات جديدة للكشف عن زيكف التي قد تكون ذات فائدة11،،من1213،14،15،16،17 .
وباختصار، يوفر هذا البروتوكول طريقة سريعة وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة زيكف في مجموعة متنوعة من أنواع العينات التي لا تتطلب معدات متخصصة. وهذا يوفر أداة تشخيص جديدة للكشف عن زيكف التي ليس فيها الجيش الملكي النيبالي تكون معزولة قبل رد فعل RT-مصباح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليل وأم بي سي على الملكية الفكرية وسائل تشخيص فيروس زيكا. الكتاب المتبقية قد لا المصالح المتنافسة.
Acknowledgments
بتأييد هذا العمل مساهمة الأسرة الخيرية مورين ورونالد هيرش وحقل معهد علوم الأعصاب، سانت ماري في ولاية ميشيغان. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة. كما نشكر الدكتور برناديت زوانس وجناح إيليا لاستعراضها الحرجة من المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
| MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
| 100 mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100 mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100 mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100 mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100 mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
| Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
| Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
| BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
| Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
| ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
| DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |
References
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).
- Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).
- Gandasegui, J., et al. The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963 (2015).
- Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens. The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Lamb, L. E., et al. Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification. Scientific Reports. 8 (1), 3803 (2018).
- Faye, O., et al. One-step RT-PCR for detection of Zika virus. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948 (2012).
- Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification. Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).
- Chan, K., et al. Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus. Scientific Reports. 6, 38223 (2016).
- Lee, D., et al. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Priye, A., et al. A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses. Scientific Reports. 7, 44778 (2017).
