Summary
该协议提供了一种高效、低成本的方法, 用于检测人体尿液、血清样品或蚊子中的 Zika 病毒或控制靶, 采用反向转录环介导的等温放大 (RT 灯)。此方法不需要 RNA 隔离, 可以在30分钟内完成。
Abstract
感染 Zika 病毒 (ZIKV) 可能是无症状的成人, 但是, 在怀孕期间感染可能导致流产和严重的神经系统出生缺陷。该协议的目标是快速检测人类和蚊子样本中的 ZIKV。目前 ZIKV 检测的金标准是定量反向转录 pcr (qRT pcr);反向转录回路介导的等温放大 (RT 灯) 可能允许更有效和低成本的测试, 而不需要昂贵的设备。在本研究中, RT 灯用于在30分钟内在各种生物样品中 ZIKV 检测, 而不首先从样品中分离出 RNA。这种技术是使用 ZIKV 感染的病人尿液和血清, 以及感染的蚊子样本。18S. 核糖体核糖核酸和肌动蛋白分别用作人体和蚊子标本的对照。
Introduction
在 2015年, Zika 病毒 (ZIKV) 作为一种传染性疾病引起了全球瞩目, 因为怀孕期间的感染与流产、死胎、严重的神经系统先天缺陷 (包括小头) 以及其他先天性出生缺陷1。在极少数情况下, ZIKV 与格林-巴利综合征有关。ZIKV 主要由白纹蚊传播;然而, 它也可以通过性接触传播1。鉴于感染 ZIKV 的人在多数人中无症状, 或出现轻度流感样症状, 与其他 arborviruses1感染的症状重叠, 因此需要改进方法, 快速和经济高效地检测ZIKV, 以筛查人和当地蚊子的数量。
定量反向转录 pcr (qRT pcr) 是一种可靠的 ZIKV 检测方法;然而, 这种技术需要昂贵的专业设备, 训练有素的人员, 和 RNA 分离从样本的兴趣。反向转录回路介导的等温放大 (RT 灯) 是一种基于 PCR 技术的一步核酸扩增方法, 它只需要一个孵化温度由于使用了嗜热 DNA 聚合酶与链位移特性。这就绕过了对 thermocycler 的需要, 减少了完成化验所需的时间长短。RT 灯的其他优点包括其高度特异性和灵敏度, 在 pH 水平和温度范围内的鲁棒性, 以及对许多 PCR 抑制剂2的抗性。它的成本相对较低, 试剂在室温下稳定。鉴于这些特点, RT 灯可以部署在实验室或现场。因此, 已经开发了灯反应, 以检测一系列的病原体和其他类型的感染3,4,5。本文所描述的 RT 灯协议的目标是检测在人体血清和尿样中没有 RNA 分离的 ZIKV, 以及通过 RT 灯在30分钟以内的单一感染蚊子。该方法可用于替代 qRT PCR, 因为它是一种灵敏的, 快速的诊断工具, 工作迅速和在实验室以外的设置。
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Protocol
这里描述的所有方法都已得到博蒙特健康机构审查委员会 (IRB) 的批准。所有的实验都是按照相关的指导方针和规定进行的。
注意: 所有可能感染的材料应按照生物安全等级2标准处理, 包括使用个人防护设备。任何可能产生气溶胶的程序都应在生物安全柜中进行。此外, 应在适当的节肢动物控制1-3 级设施中进行活蚊的工作。鉴于 ZIKV 感染与先天性畸形的关系, 怀孕、试图受孕的妇女或这些妇女的伴侣应大大减少实验室对 ZIKV 的接触。根据运输部危险材料条例 (49 CFR 第171-180 部分), 在美国将 ZIKV 样品的运输分类为 B 类生物物质, 因此装运样品应遵守这些指引。进口到美国的 ZIKV biospecimens 需要一个疾病控制和预防中心 (CDC) 进口许可证。进口任何可以作为 ZIKV 传播载体的节肢动物, 即使它们没有被感染, 也需要美国农业部 (USDA) 许可证。此信息在发布时是最新的。最新的建议可以在 https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html 找到。
注意: RT 灯反应易发生假阳性反应率较高, 因此在实验规划中应采取预防措施。所有的 RT 灯反应的设置和执行应使用指定的吸管和过滤器提示。理想情况下, 应建立横向工作流。如果可能的话, 分析和成像 (5 节) 应该出现在一个单独的封闭的房间, 以防止污染。应将装有 RT 灯产品的试管的开口保持在最低限度。
1. RT 灯底漆的制备
- 在分子级水中重建每一个冻干 RT 灯底漆, 最终浓度为100µM (表 1)。简要地涡旋底漆解决方案, 以确保一个均匀的解决方案, 并简要地向下旋转的解决方案以最大速度在一个表顶离心机收集所有底漆解决方案。
- 使用表 2中的卷, 准备 FIP、F3、B3、if 和 LB 底漆的 10x RT 灯底漆组合。简要地涡旋底漆解决方案, 以确保一个均匀的解决方案, 并简要地向下旋转的解决方案, 以最大的速度在一个表顶离心机, 以避免任何损失。
注:蚊肌动蛋白 (AEDAE) 的 rt 灯底漆不包含 LB 底漆 (环底漆并不总是必要的 RT 灯的反应)。在这种情况下, 用分子级水代替 LB 底漆体积。 - 将底漆存放在-20 摄氏度之间, 以避免自由解冻循环。
2. 样品准备
- 人体尿样:在防腐剂中使用新鲜的尿液、冰冻尿液或尿液。对于新鲜或冰冻的样品: 在 700 x g处立即将样品收集10分钟后, 用上清液进行分析或冷冻-80 摄氏度以供将来使用。在使用前解冻冰冻样品。
- 人体血清样品:使用新鲜或冰冻的血清样本。
-
对于 ZIKV 感染的细胞系: 使用条件介质或细胞裂解物。
注: 无细胞条件的媒体从 Ae。伊蚊 C6/36 细胞8天后感染可作为积极的控制 ZIKV RT 灯反应。 -
蚊蚊子:使用新鲜的或冰冻的蚊子尸体。在冰上解冻冰冻的蚊子。将一只蚊子放入100µL 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 和融汇中, 用 P10 吸管尖粉碎蚊子10次 (图 1), 准备一个粗蚊子裂解液。简单地将粗裂解物离心成颗粒。用上清液进行下游 RT 灯分析。
注: 在实验室设置中可以产生阳性控制, 方法是通过胸腔内显微注射感染雌性蚊子, 在 200 nL 的体积内使用大约 103基因组病毒, 并采集蚊子5天感染后。
3. 准备 RT 灯主组合
- 在表 3中, 在冰上准备一盏 RT 灯主混合反应, 用于使用容积指南。
注: 使用 thermolabile 尿 DNA Glycosylase (UDG) 有助于预防误报。 - 涡流简单, 以确保所有样品混合良好, 然后简单地向下旋转, 以防止体积损失。
4. RT 灯检测
-
吸管23.0 µL 的 RT 灯主混合每反应成一个200µL PCR 管。添加2.0 µL 的样品 (尿液, 血清, 或粗蚊子裂解上清, 如步骤2所述)。这将使总体积为25.0 µL 每 RT 灯反应。对于负控制, 使用分子级水。包括一个积极的控制。
注: PCR 标准或病毒储存从上清的感染细胞线可以作为一个积极的控制。- 可选: 包括相关虫媒病毒的特异性控制反应, 如登革病毒 (DENV)。根据示例类型, 按照步骤2中概述的方式准备示例。添加2.0 µL 的特异性控制到23.0 µL 的 RT 灯主组合成200µL PCR 管。
- 用热块、水浴或 thermocycler 将样品加热61摄氏度30分钟。
- 热停用聚合酶加热到80°c 10 分钟。
5. RT 灯分析
注意: 在单独的封闭空间中执行 RT 灯分析。
-
孵化后, 通过寻找颜色变化的存在, 进入 RT 灯的反应视觉。
- 稀释荧光核酸染料1:10 在泰 (40 毫米三, 20 毫米醋酸, 1 毫米 EDTA) 缓冲。
注意: 任何核酸染色都与核酸结合, 因此是致癌物质。搬运时要戴上手套。 - 对12µL 的 RT 灯反应, 加入2µL 荧光核酸染料稀释。
注: 阴性反应将呈橙色, 阳性反应呈黄色/绿色。 - 可选: 使用照相机拍摄白色背景上的 RT 灯反应。
- 稀释荧光核酸染料1:10 在泰 (40 毫米三, 20 毫米醋酸, 1 毫米 EDTA) 缓冲。
- 将样品放置在 302 nm 紫外线照射下, 以通过荧光来确认 RT 灯产品的存在。使用照相机拍摄结果的图片。
注: 阳性的 RT 灯反应将有荧光输出。
注意: 使用紫外线防护眼谷歌或面罩时, 使用 uv 光。 -
可选: 通过对样品进行凝胶电泳, 确认 RT 灯产品的存在。
- 将2% 琼脂糖凝胶倒入1x 泰的缓冲器中, 用核酸染色进行可视化。
注意: 任何核酸染色都与核酸结合, 因此是致癌物质。搬运时要戴上手套。 - 在第一条小巷中添加5µL 的 DNA 阶梯, 以比较分子的重量。
- 对于每一个 rt 灯反应, 混合13µL 的 rt 灯反应混合物与2µL DNA 负载染料。载入含有 DNA 负载染料的15µL 混合物。
- 在 90 V 处运行凝胶90分钟, 或直到带分离和图像与 302 nm 紫外线光。
注意: 阳性的 RT 灯反应将有一个抽丝的模式。负 RT 灯反应不应包含任何波段。
- 将2% 琼脂糖凝胶倒入1x 泰的缓冲器中, 用核酸染色进行可视化。
6. 处置
- 双密封袋中的 RT 灯反应处理。不要高压釜, 因为这可能 aerosolize 的 RT 产品, 导致错误的积极反应在未来。
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Representative Results
可以用三种不同的方法分析 RT 灯的反应。首先, 随着荧光核酸染料的加入, 阳性反应将呈黄色/绿色, 在这种颜色中, 阴性反应会呈橙色到肉眼的颜色。第二, 将荧光核酸染料添加到 RT 灯反应中, 当样品被紫外光激发时, 会产生荧光信号。阴性反应将不会有一个可检测的荧光信号在任何背景荧光, 可能存在的小剂量在负控制。最后, 在琼脂糖凝胶上可以用到 RT 灯的反应。阳性的 RT 灯反应将有带状模式, 而负反应将没有 DNA 带。图 2和3显示了使用所有三种分析方法的例子。这些样品都没有在 RT 灯之前分离出 RNA。图 1展示了 PBS 中一整只蚊子的破碎, 这足以用于 RT 灯反应。在图 2中, ZIKV rt 灯反应的特异性表明: 只有 ZIKV 分子控制, 而不是 DENV 分子控制或负控制, 有一个积极的 rt 灯反应。此外, 在已知 ZIKV 感染的患者的尿液和血清中均检测到 ZIKV, 但不在无 ZIKV 感染的无症状对照患者中 (图 2a)。在图 2B中, 使用 RT 灯测试人体 18s rRNA 的样品。只有从患者 (尿或血清), 但不是分子控制或阴性控制的样本是阳性的 18s rRNA。因此, 18s rRNA 的 rt 灯可以作为一个质量控制的 rt 灯反应的样本从人类病人。蚊子样品可以同样测试 ZIKV 或 RT 灯质量控制, AEDAE (图 3)。在这个例子中, ZIKV 的阳性分子控制以及感染 ZIKV 的蚊子对 ZIKV 是积极的。负控制, DENV 的分子控制, 模拟感染的蚊子 (蚊子杏仁与细胞培养基不含病毒) 和 DENV 感染蚊子都是阴性 ZIKV (图 3)。然而, 所有的蚊子是积极的 AEDAE 通过 RT 灯 (图 3B)。
在可能的情况下, 所有三种分析方法都应用于确认阳性或阴性反应, 因为有时荧光信号可能是微弱的, 有些人可能是色盲, 使得视觉颜色的变化难以确定。在负控制为正的情况下, 测试的整套样本都是无效的, 因此不能排除误报。如果阳性控制为负, 则整组样本无效, 因为 RT 灯反应可能不起作用。这是一个定性读出, 但是, 更高的病毒拷贝将导致 RT 灯产品的增加, 可以得到荧光强度或通过凝胶电泳的 DNA 带状模式的强度。
图 1: 制备蚊虫粗裂解液.(a) 将蚊子放在离心管中100µL 的 PBS 中。(B) 使用 P10 吸管尖, 将蚊子压在管子两侧10次。(C) 这将产生一种原油裂解物, 应在台式离心机上简单地将其纺成颗粒碎片。只有上清应用于 RT 灯反应。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: ZIKV 和 18S rRNA 在患者尿液和血清标本中的 RT 灯.无症状控制患者 (C01) 或 ZIKV 感染患者 (Z01) 的尿液或血清样本受 ZIKV (a) 或 18S rRNA (B) 特定的 RT 灯反应。通过眼睛 (上板)、绿色荧光 (中间板) 或凝胶电泳 (下板) 添加荧光核酸染料, 对 RT 灯的反应进行了可视化。车道 M: DNA 质量标记;NTC: 无模板控制 (负控制);ZIKV: ZIKV PCR 标准阳性对照;DENV: DENV 阳性对照。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: ZIKV 和 AEDAE RT 灯在蚊. 单一Ae. 蚊感染模拟控制, ZIKV, 或 DENV 受 ZIKV (A) 或 AEDAE (B) 特定的 RT 灯反应。通过眼睛 (上板)、绿色荧光 (中间板) 或凝胶电泳 (下板) 添加荧光核酸染料, 对 RT 灯的反应进行了可视化。车道 M: DNA 质量标记;NTC: 无模板控制 (负控制);ZIKV: ZIKV PCR 标准阳性对照;DENV: DENV 阳性对照。请单击此处查看此图的较大版本.
| 目标 | 底漆 | 序列 (5 '-3 ') | ||
| 同性恋 sapien 18S rRNA | 18 srrna-FIP * 18 srrna * 18 srrna-F3 18 srrna-B3 18 srrna 18 srrna 磅 |
TGGCCTCAGTTCCGAAAACCAACCTGGATACCGCAGCTAGG GGCATTCGTATTGCGCCGCTGGCAAATGCTTTCGCTCTG GTTCAAAGCAGGCCCGAG CCTCCGACTTTCGTTCTTGA AGAACCGCGGTCCTATTCCATTATT ATTCCTTGGACCGGCGCAAG |
||
| ZIKV | ZIKV-FIP * ZIKV * ZIKV-F3 ZIKV-B3 ZIKV-如果 ZIKV 磅 |
AACCTGAGGGCATGTGCAAACCGCGGTCAGTGGAGATGACT CACAGGAGTGGAAACCCTCGACTGAAGTGGTGGGAGCAGAA GCAGAGCAATGGATGGGATA CCCATCCTTGAGGTACAGCT TCGATTGGCTTCACAACGC GGAGCAATTGGGAAGAAGTCC |
||
| Ae。蚊肌动蛋白 | Ae21-FIP * Ae21-BIP * Ae21-LF Ae21-F3 Ae21-B3 |
TGCTTGGTCCCTGCCTGGGAGACAGCCCACCAGAACGA GAGACGAGAACGGCCCAGCGGGTCTGGTGTGTGTCTTTG ACCGCAAGGCCAAGAACCG CGGCGCCACCACAAGA TCGTGCCTGTGTTTGTCG |
||
| * 底漆应通过快速高效液相色谱 (HPLC) 纯化。对于所有其他底漆, 标准脱盐条件是足够的。 | ||||
表 1: RT 灯反应的底漆序列.底漆序列最初描述在前出版物6。
| 容积 (µL) | 底漆 | 库存浓度 (µM) | 最终浓度 (µM) |
| 80 | 正向内底漆 (FIP) | 100 | 16 |
| 80 | 向后内底漆 (保险) | 100 | 16 |
| 10 | 前向外底漆 (F3) | 100 | 2 |
| 10 | 向后外底漆 (B3) | 100 | 2 |
| 20 | 向前循环 (if) | 100 | 4 |
| 20 | 向后循环 (磅) | 100 | 4 |
| 280 | 分子级水 | - | - |
| 500 | 总 |
表 2: 制备 10x RT 灯底漆组合物.蚊肌动蛋白不含高炉底漆的 RT 灯底漆。把这卷换成水。
| 1x. 容积 (µL) | 组件 | 最后的轻质。25µL 卷 |
| 2。5 | 10x 等温放大缓冲器 | 1x |
| 1。8 | 100毫米/GTPs/吨/丙 | 1.4 毫米 |
| 2。0 | 100毫米 MgSO4 | 6毫米 + 2 毫米在缓冲器 = 8 毫米 [4-10 毫米范围] |
| 2。5 | 10x 底漆 | 1.6 µM FIP/保险, 0.2 µM F3/B3, 0.4 µM FL/BL |
| 1。0 | 嗜热 DNA 聚合酶与绞线置换 (8000 U/毫升) | 8 U |
| 0。5 | 逆转录酶 (1.5万 U/毫升) | 7.5 U |
| 0。5 | UDG (1000 U/毫升) | 0.5 U |
| 12。3 | 分子级水 | - |
| 23。0 | 总 |
表 3: 制备 RT 灯主组合。
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Discussion
本文所描述的 ZIKV RT 灯的研究工作使用的人和蚊子样本6。检测的限制约为1基因组等效6, 这应该是足够的, 因为典型的病毒负荷的症状 ZIKV 感染患者是 10 3 至 106 PFU/毫升7。此外, 该方法可以检测不先分离 RNA 的样品中的 ZIKV, 细胞培养中不存在病毒放大。与 qRT PCR 相比, 这大大降低了这种检测的时间、成本和健康风险。
在本议定书所示的体积比上使用的尿样应该允许在没有 RNA 隔离的情况下发生 RT 灯反应。虽然理论上可以增加 RT 灯反应中使用的样品量, 但当这个样品是尿液时, 应该小心。尿中含有多种化学物质, 可抑制 PCR 反应;尿中的尿素是已知的降解聚合酶8和使用尿/RT 灯反应率过高将防止 RT 灯反应。如果预期有少量的病毒, 最好使用特定于尿液的试剂盒进行 RNA 隔离。同样, 血清可以含有 PCR 抑制剂, 可能会抑制 RT 灯时, 血清是在更高的8卷使用。
本议定书包括了对 RT 灯反应的质量控制, 类似于西方印迹协议中的负载控制。如果临床样品是阴性的 RT 灯的质量控制, 那么 ZIKV RT 灯的负面反应可能是假阴性, 因为样品可能含有大量的 PCR 抑制剂或少量的总 RNA。在 RT 灯检测之前, 不需要将 RNA 与样品分离。在无 RNA 分离的情况下获得了该协议的代表性 RT 灯结果。然而, RNA 分离可以改善在样本低病毒负载或可能含有高水平的 PCR 抑制剂的检测。对于包括血清在内的大多数样本类型, 可以按照制造商建议的协议使用 RNA 隔离套件。对于尿样, 应使用特定于尿样的 RNA 隔离试剂盒。对于蚊子样本, 建议在 RNA 分离之前, 通过在最大速度或 douncing 上用2分钟的切碎柱在100µL 的 PBS 中运行蚊子来溶解蚊子。RNA 可以洗脱在30µL 洗脱缓冲器和存储在-80 °c, 直到使用。
rna 分离然后建议去除内源性 PCR 抑制剂或集中 rna 在 RT 灯之前。如果 RT 灯的质量控制仍然是阴性的, 那么 qRT PCR 应用于 ZIKV 检测。
该协议中的 RT 灯引物已确认工作在温度范围 (57–65°c) 和孵化时间 (8-60 分钟), 以及使用非常规加热源 (例如, 焰配给加热器, 水浴) 以外标准实验室条件。测试的所有温度都有类似的结果。基于视觉颜色变化的检测, ZIKV RT 灯产品检测的最佳时间为30分钟。然而, 在凝胶上的紫外光激发或带状模式检测均为阳性, 总潜伏期仅为8分钟。一些 rt 灯协议包括亚砜, 但在本协议中, 它可以导致 rt 灯反应的抑制。使用一种可在室温下建立的嗜热 dna 聚合酶可以比野生型高温 dna 聚合酶更有优势, 包括更快的放大信号, 并且在室温9、10中增加了稳定性。.溴溴化可代替2% 琼脂糖凝胶中的核酸可视化, 然而, 其他荧光核酸染料的琼脂糖凝胶具有较低的诱变潜力, 使他们更安全的选择。不过, 仍应使用适当的安全措施, 例如戴上手套。
该协议的一个局限性是, 它是一个定性而非定量的技术, 但是, 相对量化可以做6。此外, RT 灯引物是高度特异的, 是针对一个高度保守的序列结构性蛋白5的 ZIKV, 发现在16菌株和验证工作至少5株6。这是可能的广泛的突变 ZIKV 在野外可能无法检测到这些引物在未来。其他小组还开发了新的技术, 以检测 ZIKV, 可能是感兴趣的11,12,13,14,15,16,17.
总之, 此协议为不需要专用设备的各种示例类型中的 ZIKV 提供了一种快速、简单、经济高效的方法。这为 ZIKV 检测提供了一种新的诊断工具, 其中 RNA 在 RT 灯反应之前不必被隔离。
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Disclosures
LEL 和地中海 Zika 病毒诊断方法具有一定的知识产权。其余的作者没有相互竞争的兴趣。
Acknowledgments
这项工作得到了莫林和罗纳德-神经家庭慈善捐款和密歇根州圣玛丽的实地研究所的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。我们还感谢伯纳黛特 Zwaans 博士和以利亚沃德对手稿的批判性审查。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
| MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
| 100 mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100 mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100 mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100 mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100 mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
| Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
| Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
| BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
| Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
| ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
| DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |
References
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