Summary
このプロトコルは、効率的かつ低コスト ジカのウイルスを検出または逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) で人間の尿や血清のサンプルや蚊のターゲットを制御するメソッドを提供します。このメソッドは、RNA の隔離を必要としないし、30 分以内に行うことができます。
Abstract
ジカ ウイルス (ZIKV) の感染は成人の無症候性することができます、ただし、妊娠中の感染は流産と重度の神経学的な先天性欠損症に 。このプロトコルの目的は、人間と蚊のサンプルで ZIKV を迅速に検出することです。ZIKV 検出のための現在のゴールド スタンダードは定量的逆転写 PCR (qRT PCR);逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) 高価な機器を必要とせずより効率的かつ低コストにテストのため可能性があります。本研究では RT ランプは最初のサンプルから RNA を隔離することがなく 30 分以内のさまざまな生体試料中の ZIKV 検出に使用されます。この手法は、患者の尿、血清、感染し、感染蚊のサンプル ZIKV を使用して示されています。18 s リボソーム リボ核酸とアクチンは、それぞれ人間と蚊のサンプル内のコントロールとして使用されます。
Introduction
2015 年にジカ (ZIKV) 注目を集めて著名なグローバル懸念の伝染病として妊娠中の感染は、流産、死産、重篤な神経学的な出生時欠損など小頭症、その他先天性にリンクされていたので先天性欠損症1。まれに、ZIKV は、ギランバレー症候群に関連付けられています。ZIKV は主にネッタイシマカ蚊; によって送信されます。しかし、それ1性的接触を通して広げることができます。迅速かつコスト効果の高い検出法の改良の必要性があったことを考えると ZIKV 感染は、ほとんどの人に無症候性または他アルボ1の感染症の症状と重なっている軽度のインフルエンザのような症状を呈する、ローカル蚊の個体数と同様、両方の人々 を画面に ZIKV。
定量的逆転写 PCR (qRT PCR) は ZIKV 検出; のための信頼性の高いアッセイです。ただし、この手法には、高価な特殊な装置、訓練された人員および興味のサンプルからの RNA の隔離が必要です。逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) は鎖と耐熱性 DNA ポリメラーゼの使用により 1 つの孵化の温度を必要なだけ PCR 技術に基づくワンステップ核酸増幅法変位プロパティ。これをたちの必要性を回避して試験を完了に必要な時間の長さを減少させます。RT ランプの付加的な利点は、高い特異性と感度、多くの PCR 阻害剤2への抵抗と温度、pH のレベルの範囲で堅牢性を含めます。比較的低コスト、試薬は室温で安定しています。これらの特徴を考えると、実験室やフィールドで RT ランプが展開できます。そのため、病原体や感染3,4、5の他の種類の範囲を検出するランプ反応が開発されています。本稿で記述されている RT ランプ プロトコルの目的は、ひと血清および尿中サンプルでも RT ランプ経由 30 分以内単一感染した蚊のように RNA の隔離なし ZIKV を検出するためです。実験室外側迅速かつ設定で動作する高感度、迅速な診断ツールである qRT PCR を交換するこのメソッドを使用できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ここで説明したすべてのメソッドは、ボーモント厚生制度レビュー委員会 (IRB) によって承認されています。関連するガイドラインと規制に従ってすべての実験を行った。
注意: 個人用保護具の使用を含むバイオ セーフティ レベル 2 標準によるとすべての可能性のある感染性物質を処理必要があります。バイオ セーフティ キャビネットにおけるエアロゾルを作り出すかもしれないプロシージャを行わなければなりません。さらに、ライブの蚊との仕事は、適切な節足動物封じ込めレベル 1-3 施設で行わなければなりません。ZIKV 先天性異常症の協会を与えられた、またはこれらの女性のパートナーの妊娠している女性、妊娠しようとしている必要がありますを大幅に削減 ZIKV への実験室の露出。ZIKV サンプルの輸送はカテゴリ B の生物学的物質に従って部門の輸送有害材料規則としてアメリカ合衆国に分類する (49 CFR Part 171-180) に従う必要がありますしたがってサンプルを出荷し、ガイドライン。ZIKV 米国 biospecimens へのインポートでは、疾病管理・予防 (CDC) 輸入許可センターが必要です。彼らが感染していない場合でも、アメリカ合衆国農務省 (USDA) が必要です ZIKV 伝送のためのベクトルとして役立つことができる節足動物のインポートを許可します。この情報は出版時点現在です。最新の推奨事項は、https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html で見つけることが。
注: 実験計画で講じる必要がありますので、RT ランプ反応、偽陽性反応の率が高いしやすい。指定されたピペットおよびフィルターのヒントは、すべてのセットアップと RT ランプ反応の実行を使用してください。理想的には、横の作業の流れを確立する必要があります。可能であれば、汚染を防ぐために囲まれた部屋で、解析と画像処理 (セクション 5) が発生します。RT ランプ製品を含むテスト管の開口部は、最小限に抑える必要があります。
1. RT ランプ プライマーの準備
- 分子グレード水最終濃度 100 μ M (表 1) に各凍結乾燥 RT ランプ プライマーを再構築します。簡単に渦同種のソリューションを確保し、すべてのプライマー ソリューションを収集するテーブル トップ遠心分離機で最大速度でソリューションを簡単にスピンするプライマー ソリューション。
- 準備、10 x のボリュームを使用して表 2FIP、BIP、F3、B3、LF、LB のプライマーの RT ランプ プライマー ミックス。簡単に渦同種のソリューションを確保して簡単に任意の損失を避けるためにテーブル トップ遠心分離機で最大速度でソリューションをスピンダウンするプライマー ソリューション。
注: Ae。 ネッタイシマカアクチン (AEDAE) の RT ランプ プライマーが LB プライマーを含まれていない (ループ プライマーは常に RT ランプ反応に必要な)。この場合、LB プライマー ボリュームを分子グレード水に置き換えます。 - -20 ° c に使用するプライマーを格納し、無料の融解を避けてください。
2. サンプル準備
- 尿サンプルの:防腐剤で新鮮な尿、凍結尿尿のいずれかを使用します。新鮮なまたは冷凍サンプル: すぐに 700 x gで 10 分間のコレクションの後、サンプルをスピン上清を使用しての分析や将来の使用に備えて-80 ° C で凍結します。使用する前に氷の上凍結試料を解凍します。
- ひと血清サンプルの:いずれかの新鮮なまたは冷凍の血清サンプルを使用します。
-
ZIKV の感染細胞株: エアコン メディアまたはセル lysates のいずれかを使用します。
注: セル無料 Ae からメディアを完備しました。ヒトスジシマカ C6/36 セル 8 日感染後は、ZIKV RT ランプ反応のポジティブ コントロールとして使用できます。 -
Ae。 ネッタイシマカ蚊:いずれかの全体の新鮮なまたは冷凍の蚊の死体を使用。氷の上の凍結の蚊を解凍します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 100 μ L で個々 の蚊を配置することによって粗蚊 lysate を準備し、P10 ピペット先端部 (図 1) で 10 回蚊の粉砕による均質化。簡単に任意の残骸をペレットに lysate の原油を遠心分離機します。下流の RT ランプ解析の上澄みを使用します。
注: ポジティブ コントロールによって生成できる実験室の設定で約 103ゲノム相当量 200 でウイルスによる胸腔内マイクロインジェクションのメスの蚊を感染 nL と蚊に 5 日間を収穫感染後。
3. RT ランプ マスター ミックスを調製します。
- 氷の上の RT ランプ マスター ミックス反応を表 3にボリューム ガイドを使用して、使用する各プライマーに備えます。
注: 使用不耐熱ウラシル DNA グリコシラーゼ (UDG) の誤検知を防止に役立ちます。 - 、すべてのサンプルが混ぜように簡潔に渦、スピン ・ ダウン簡単にボリュームの損失を防ぐために。
4. RT ランプ アッセイ
-
ピペット 23.0 μ L あたり 200 μ L の PCR チューブに反応 RT ランプ マスターの組合せの。サンプル (尿、血清、または手順 2 に記載されている粗蚊ライセート清) の 2.0 μ L を追加します。これは RT ランプ反応あたり 25.0 μ L に総量をもたらすでしょう。否定的な制御分子グレードの水を使用します。肯定的な制御が含まれます。
注: 感染した細胞株の培養上清から PCR 標準またはウイルス株は、肯定的な制御として使用できます。- オプション: デング ウイルス (DENV) など関連アルボ ウイルスの特異性制御反応が含まれます。サンプルの種類に応じて手順 2 で説明したように、サンプルを準備します。200 μ L の PCR チューブに RT ランプ マスター ミックスの 23.0 μ L に特異性制御の 2.0 μ L を追加します。
- ヒート ブロック、水浴、またはたちを使用して 30 分の 61 ° C で試料を加熱します。
- 熱は 80 ° C 10 分の加熱によりポリメラーゼを非アクティブ化します。
5. RT ランプ解析
注: 独立した密閉空間で RT ランプ解析を実行します。
-
、孵化後 RT ランプ反応の色の変化の有無を見ることによって視覚的にアクセスします。
- 蛍光核酸色素 1:10 (40 mM 20 mM 酢酸トリス 1 mM EDTA) TAE バッファーで希釈します。
注意: 任意の核酸染色核酸に結合し、したがっては発癌物質。処理するときは、手袋を着用します。 - 12 μ RT ランプ反応、蛍光核酸色素希釈法の 2 μ L を追加します。
注: 否定的な反応の色でオレンジ色になります、陽性反応は黄/緑の色になります。 - 省略可能: は、カメラを使用して、白地に RT ランプ反応の写真を撮る。
- 蛍光核酸色素 1:10 (40 mM 20 mM 酢酸トリス 1 mM EDTA) TAE バッファーで希釈します。
- 302 nm UV の下でサンプル配置光蛍光による RT ランプ製品の存在を確認します。カメラを使用して結果の写真を撮る。
メモ: RT ランプを肯定的な反応には蛍光出力があります。
注意: は、紫外線を作業時に UV 保護目のグーグルや顔のシールドを着用します。 -
省略可能: サンプルの電気泳動の実行によって RT ランプ製品の存在を確認します。
- 可視化のための核酸染色で 1 x TAE バッファーの 2% の agarose のゲルを注ぐ。
注意: 任意の核酸染色核酸に結合し、したがっては発癌物質。処理するときは、手袋を着用します。 - 分子量を比較する最初の車線に DNA の梯子の 5 μ L を追加します。
- 各 RT ランプ反応の DNA のローディングの染料の 2 μ L で 13 μ RT ランプ反応混合物を混ぜます。ローディングの染料の DNA を含んでいる 15 μ L の混合物をロードします。
- 302 nm の紫外光を用いたゲル 90 V 90 分またはバンドを分離するまでのイメージを実行します。
メモ: 肯定的な RT ランプ反応では、ラダリング パターンがあります。RT ランプの否定的な反応は、任意のバンドを含めないでください。
- 可視化のための核酸染色で 1 x TAE バッファーの 2% の agarose のゲルを注ぐ。
6. ゴ ミ処理
- 二重密封された袋に RT ランプ反応の処分します。これは、将来的に偽陽性反応につながる RT ランプ製品をイアントが、オートクレーブ滅菌を行います。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RT ランプ反応は、3 つの異なる方法を使用して分析できます。まず、蛍光核酸色素の添加、肯定的な反応になりますイエロー/グリーン色で否定的な反応が肉眼で見える色はオレンジが表示されます。第二に、RT ランプ反応を蛍光核酸色素添加結果蛍光信号サンプルが紫外線によって興奮しているとき。否定的な反応は、陰性対照に少量存在する背景の蛍光性の検出可能な蛍光シグナルを持っていないでしょう。最後に、RT ランプ反応は agarose のゲル実行できます。肯定的な否定的な反応には DNA バンドがあるないに対し、RT ランプ反応はバンディング パターンを持っています。これらの解析手法の 3 つすべてを使用してこの例を図 2および3に示します。これらのサンプルのどれもは、RT ランプ前に分離した RNA を持っていた。図 1は、RT ランプの反応で使用のために十分である pbs は、全体蚊の粉砕を示しています。ZIKV RT ランプ反応の特異性を示した図 2で: ZIKV 分子制御のみ、DENV 分子制御または否定的な制御は肯定的な RT ランプ反応。さらに、無症候性制御患者 ZIKV 感染症 (図 2A) なしではなく尿や既知の ZIKV 感染症患者の血清の両方で ZIKV が検出されました。18 歳の人間図 2Bのサンプルをテスト rRNA RT ランプを使用しています。(尿または血清)、患者がいない分子のコントロールまたは負のコントロールからサンプルだけが 18 歳の正 rRNA。したがって、18 s rRNA RT ランプは、人間の患者からサンプルの RT ランプ反応の品質管理として使用できます。蚊のサンプルは、ZIKV または AEDAE (図 3)、RT ランプ品質コントロールは同様にテストできます。この例では、ZIKV と ZIKV に感染した蚊のため肯定的な分子制御が ZIKV 陽性です。ネガティブ コントロール DENV の分子制御、モック感染蚊 (モスキートの細胞培養媒体のウイルスが含まれていないと microinjected) と DENV 感染蚊が ZIKV (図 3A) すべて陰性。しかし、すべての蚊は RT ランプ (図 3B) によって AEDAE の肯定的です。
可能であれば、すべての 3 つの分析方法を使用して、蛍光シグナルが弱いことがあり、いくつかの個人可能性があります色盲、視覚の色を変更を決定する困難に肯定的または否定的な反応を確認ください。陰性対照が正の場合、全体の一連のテスト サンプルが汚染として有効とそのため偽陽性は排除できません。肯定的な制御が負の値の場合、RT ランプ反応が働いていないと、サンプルの全体のセットが正しくありません。これは、うち定性的読む、ただし、ウイルスの高いコピーはゲル電気泳動による DNA バンド パターンの強度、蛍光強度によって理解できる RT ランプ製品の増加になります。
図 1: 蚊原油ライセートの調製します。(A) 場所微量遠心チューブに 100 μ L の PBS に蚊。(B) 10 倍管の側面に対して蚊をつぶす P10 のピペット チップを使用しています。(C) これは破片をペレットにテーブル トップ遠心分離機で簡潔にスピンダウンする必要がある原油のライセートを生成します。RT ランプ反応の上澄みのみを使用してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:ZIKV と 18S rRNA 患者の尿および血清試料中の RT ランプ。無症候性制御患者 (C01) または ZIKV 感染患者 (Z01) から尿や血清のサンプルは、ZIKV (A) や 18S rRNA (B) 特定 RT ランプ反応を受けた。RT ランプ反応は、蛍光核酸添加蛍光目 (上部パネル)、緑 (中央のパネル)、染料やゲルの電気泳動 (底板) 後に, 可視化されました。車線 m: DNA 大量マーカー;NTC: ないのテンプレート コントロール (マイナス コントロール);ZIKV: ZIKV PCR の標準的な肯定的な制御;DENV: DENV 肯定的な制御。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:ZIKV と AEDAE の RT-ランプネッタイシマカ Ae。. ZIKV (A) AEDAE (B) 特定の RT ランプ反応する単一Ae。 ネッタイシマカモック コントロール、ZIKV、または DENV に感染を受けた。RT ランプ反応は、蛍光核酸添加蛍光目 (上部パネル)、緑 (中央のパネル)、染料やゲルの電気泳動 (底板) 後に, 可視化されました。車線 m: DNA 大量マーカー;NTC: ないのテンプレート コントロール (マイナス コントロール);ZIKV: ZIKV PCR の標準的な肯定的な制御;DENV: DENV 肯定的な制御。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ターゲット | プライマー | シーケンス (5' 3') | ||
| ホモ sapien 18S rRNA | 18SrRNA-FIP * 18SrRNA-BIP * 18SrRNA F3 18SrRNA B3 18SrRNA LF 18SrRNA ポンド |
TGGCCTCAGTTCCGAAAACCAACCTGGATACCGCAGCTAGG GGCATTCGTATTGCGCCGCTGGCAAATGCTTTCGCTCTG GTTCAAAGCAGGCCCGAG CCTCCGACTTTCGTTCTTGA AGAACCGCGGTCCTATTCCATTATT ATTCCTTGGACCGGCGCAAG |
||
| ZIKV | ZIKV-FIP * ZIKV-BIP * ZIKV F3 ZIKV B3 ZIKV LF ZIKV ポンド |
AACCTGAGGGCATGTGCAAACCGCGGTCAGTGGAGATGACT CACAGGAGTGGAAACCCTCGACTGAAGTGGTGGGAGCAGAA GCAGAGCAATGGATGGGATA CCCATCCTTGAGGTACAGCT TCGATTGGCTTCACAACGC GGAGCAATTGGGAAGAAGTCC |
||
| Ae。ネッタイシマカ アクチン | Ae21-FIP * Ae21-BIP * Ae21 LF Ae21 F3 Ae21 B3 |
TGCTTGGTCCCTGCCTGGGAGACAGCCCACCAGAACGA GAGACGAGAACGGCCCAGCGGGTCTGGTGTGTGTCTTTG ACCGCAAGGCCAAGAACCG CGGCGCCACCACAAGA TCGTGCCTGTGTTTGTCG |
||
| * プライマーは、急速な高速液体クロマトグラフィー (HPLC) で精製する必要があります。他のすべてのプライマーの標準脱塩状態で十分です。 | ||||
表 1: RT ランプ反応のプライマー シーケンスします。もともとのプライマー シーケンスを前の文書6で説明します。
| (Μ l) | プライマー | ストック濃度 (μ M) | 最終濃度 (μ M) |
| 80 | 前方内側プライマー (FIP) | 100 | 16 |
| 80 | 後方内側プライマー (BIP) | 100 | 16 |
| 10 | 前方外側プライマー (F3) | 100 | 2 |
| 10 | 後方外側プライマー (B3) | 100 | 2 |
| 20 | フォワード ループ (LF) | 100 | 4 |
| 20 | 下位 (LB) をループします。 | 100 | 4 |
| 280 | 分子グレード水 | - | - |
| 500 | 合計 |
表 2: RT ランプ プライマー ミックス x 10 の準備。Ae。 ネッタイシマカ アクチンの RT ランプ プライマーに BF プライマー; が含まれていません。このボリュームを水に置き換えます。
| 1 x ボリューム (μ L) | コンポーネント | 最終濃度25 μ L のボリュームの |
| 2.5 | まじりけ増幅バッファー x 10 | 1 x |
| 1.8 | 100 mM デュ/A/T/C/GTPs | 1.4 mM |
| 2.0 | 100 mM MgSO4 | 6 mM + 2 mM のバッファー = 8 mM [4-10 ミリメートルの範囲] |
| 2.5 | 10 x プライマー | 1.6 Μ M FIP/BIP、0.2 Μ M F3/B3、0.4 Μ M フロリダ/BL |
| 1.0 | ともなう鎖置換 (8,000 U/mL) と耐熱性 DNA ポリメラーゼ | 8 U |
| 0.5 | 逆転写酵素 (15,000 U/mL) | 7.5 U |
| 0.5 | UDG (1,000 U/mL) | 0.5 U |
| 12.3 | 分子グレード水 | - |
| 23.0 | 合計 |
表 3: RT ランプ マスター ミックスの準備。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
人間と蚊の両方のサンプル6を使用してこの紙の作品で説明している ZIKV RT ランプの試金。検出限界は約 1 ゲノム等価6、症候性 ZIKV 感染患者の典型的なウイルス負荷は 10 なので十分なする必要があります3 106 Pfu/ml7。さらに、このメソッドは最初の分離する RNA と細胞培養におけるウイルスの増幅なしのサンプル ZIKV を検出できます。時間、コスト、および qRT PCR と比較してこのアッセイの健康上のリスクが大幅に減少します。
RNA 分離なしに行われる RT ランプ反応尿このプロトコルに示された容積比で使用できるようにします。一方、1 つは理論的に RT ランプ反作用で使用されるサンプルの量を高めることができる、このサンプルが尿ケアを行使しなければなりません。尿には、PCR 反応を阻害することができる複数の化学物質が含まれています。尿中の尿素がポリメラーゼ8を低下させる知られている、高すぎる尿/RT-ランプ反応比を用いた RT ランプ反応を防ぎます。低ウイルス量が予想される場合、尿の特定のキットを使用して RNA の隔離を実行するより良いでしょう。同様に、血清は高いボリューム8時血清を使用する場合、RT ランプを阻害する可能性が PCR 阻害物質を含めることができます。
このプロトコルに含まれる西部のしみが付くプロトコルの負荷制御と同類の RT ランプ反応の品質コントロールの包含であります。臨床サンプルが RT ランプの品質管理のため負の場合、ZIKV RT ランプのための否定的な反応があります偽陰性、PCR 阻害物質の高量または総 RNA の少量サンプル。RT ランプ測定前にサンプルからの RNA を隔離する必要はありません。このプロトコルでは代表的な RT ランプ結果が RNA の隔離なし得られました。ただし、RNA の隔離低ウイルス負荷の検出能力を向上、PCR 阻害物質の高いレベルを含むことがあります。血清を含むほとんどのサンプルの種類、次の製造元の推奨プロトコル RNA 抽出用キットを使用できます。尿、尿の特定 RNA 分離キットを使用してください。蚊のサンプルについては、最高速度または RNA の隔離の前に douncing で 2 分間破砕列を 100 μ L の PBS で蚊を実行して蚊を溶解することをお勧めします。RNA は、30 μ L の溶出バッファーで溶出し、使用するまで-80 ° C で保存できます。
RNA の隔離は、内因性の PCR 阻害物質を削除または RT ランプ前に RNA を集中に示唆されました。RT ランプの品質管理がまだ負の場合、qRT PCR が ZIKV 検出に使用する必要があります。
このプロトコルで RT ランプ プライマー (57 ~ 65 ° C) 温度およびインキュベーションの範囲で動作するように確認されている (8 60 分) 回型破りな使用だけでなく、暖房源 (e.g、フレームレス配給ヒーター、水バス) 標準外。実験室の条件。テストすべての温度は、同等の結果を与えた。ビジュアルなカラー変更だけで検出に基づいて、ZIKV RT ランプ製品の検出のための最適な時間は 30 分だった。ただし、UV 光励起またはバンディングのゲルのパターンによる検出としてはほとんど 8 分合計インキュベーション時間と陽性であった。RT ランプの一部のプロトコルは、DMSO を含めるが、このプロトコルで RT ランプ反応の抑制につながります。室温を設定することができます耐熱性 DNA ポリメラーゼを用いた高速増幅信号を含む野生型耐熱性 DNA ポリメラーゼ上の利点があります、室内温度9,10時の安定性を増加しています。.臭化エチジウムは核酸の可視化 2% の agarose のゲルの代わりに使用できます、しかし、他の核酸蛍光染料は agarose のゲルは低い mutagenic 潜在性のそれらより安全な選択をします。しかし、まだ手袋を着用など適切な安全措置を使用ください。
このプロトコルの制限は、定性的および定量的手法ではない、しかし、相対的な定量化に6を行うことができます。さらに、RT ランプ プライマーは非常に特定、16 系統、および少なくとも 5 系統6で動作するように確認される ZIKV の非構造タンパク質 5 の非常に節約されたシーケンスに対して設計されています。それは可能な広範な変異体が野生の ZIKV を将来的にこれらのプライマーでは検出できない場合があります。他のグループはまた興味11,12,13,14,15,16,17する必要があります ZIKV の検出のための新技術を開発しました。.
要約すると、このプロトコルは特殊な装置を必要としない様々 なサンプルの型で ZIKV の高速、シンプルかつコスト効果の高い方法を提供します。これは、RNA は、RT ランプ反応の前に分離する必要はありません ZIKV の検出のための新しい診断ツールを提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
レルと MBC ジカ ウイルス診断法の知的財産があります。残りの著者は競合する興味を持ってないです。
Acknowledgments
この作品は、モーリーンとロナルド ・ ハーシュ家族の慈善的貢献とフィールド神経科学研究所、ミシガン州の聖マリアによって支持されました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。我々 はまた、彼らの重要な原稿のレビュー博士ベルナデット Zwaans とエリヤ病棟をありがとうございます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537S | |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380S | |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372S | |
| MgSO4 | New England Biolabs | B1003S | |
| 100 mM dATP Solution | New England Biolabs | N0440S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100 mM dCTP Solution | New England Biolabs | N0441S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100 mM dTTP Solution | New England Biolabs | N0443S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100 mM dGTP Solution | New England Biolabs | N0442S | Deoxynucleotide Set N0446S |
| 100 mM dUTP Solution | Thermo Fisher Scientific | R0133 | |
| SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S7563 | |
| Nancy-520 | Sigma Aldrich | 01494 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10-068-013 | |
| Zika Postive Control | Robert Koch Institute, Germany | N/A | |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1600 | |
| BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 10816015 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom Oligo | |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9938 | |
| Urine Preservative | Norgen Biotek | 18126 | |
| ZIKV PCR Standard | Robert Koch Institute | N/A | Vero E6 cell supernatants |
| DENV2 New Guinea C Control | Connecticut Agricultural Experiment Station | N/A |
References
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).
- Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
- Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).
- Gandasegui, J., et al. The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963 (2015).
- Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens. The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Lamb, L. E., et al. Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification. Scientific Reports. 8 (1), 3803 (2018).
- Faye, O., et al. One-step RT-PCR for detection of Zika virus. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification. Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948 (2012).
- Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification. Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).
- Chan, K., et al. Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus. Scientific Reports. 6, 38223 (2016).
- Lee, D., et al. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Song, J., et al. Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus. Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).
- Yaren, O., et al. Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya. BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).
- Wang, X., et al. Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).
- Priye, A., et al. A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses. Scientific Reports. 7, 44778 (2017).
