Summary
Vi præsenterer her, en protokol for forberedelse af Agarosen-fyldt menneskelige præcision-cut lunge udsnit fra resektion patient væv, der er egnet til at generere 3D lunge vævskulturer til model menneskelige lungesygdomme i biologiske og biomedicinsk undersøgelser.
Abstract
Oversættelse af nye opdagelser til menneskers sygdom er begrænset af tilgængeligheden af menneskelige væv-baserede modeller af sygdom. Præcision-cut lunge skiver (PCLS) bruges som 3D lunge vævskulturer (3D-LTCs) repræsenterer en elegant og biologisk meget relevante 3D celle kultur model, der meget ligner in situ væv på grund af deres kompleksitet, biomekanik og molekylær sammensætning. Væv udskæring er almindeligt anvendt i forskellige dyremodeller. 3D-LTCs stammer fra menneskelige PCLS kan bruges til at analysere svar til nye lægemidler, som kan yderligere hjælpe til bedre for at forstå de mekanismer og funktionelle virkninger af narkotika i humant væv. Forberedelse af PCLS fra kirurgisk resektion lunge vævsprøver af patienter, der oplevede lunge lobectomy, øger tilgængeligheden af syge og peritumoral væv. Her, beskriver vi en detaljeret protokol for generation af menneskelige PCLS fra kirurgisk resektion soft-elastisk patient lungevæv. Agarosen blev indført i bronchoalveolar plads af resectates, dermed bevare lunge struktur og øge det væv stivhed, som er afgørende for efterfølgende udskæring. 500 µm tykke skiver blev udarbejdet fra væv blok med en vibratome. Biopsi slag taget fra PCLS sikre sammenlignelige væv stikprøvestørrelser og yderligere øge mængden af vævsprøver. Genererede lunge vævskulturer kan anvendes i en række undersøgelser i human lunge biologi, herunder Patofysiologi og mekanismer af forskellige sygdomme, såsom fibrotisk processer på sit bedste på (sub-) cellulære niveauer. Den højeste ydelse af 3D-LTC ex vivo model er dens tætte repræsentation af in situ menneskelige lungen for 3D væv arkitektur, celle type mangfoldighed og lunge anatomi samt potentialet for vurdering af væv fra enkelte patienter, som er relevante for yderligere at udvikle nye strategier for præcision medicin.
Introduction
Kroniske og akutte lungesygdomme er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed på verdensplan1. For patienter med kroniske lungesygdomme som obstruktiv lungesygdom (KOL)2, svær astma3, lung cancer4 og diffuse parenkymalt lunge sygdomme5er helbredende behandlinger i øjeblikket ikke tilgængelig. Selv om undersøgelser i dyremodeller for lungesygdomme har uddybet forståelsen af sygdom patomekanismer6 og har ført til identifikation af potentielle nye terapeutiske mål7,8,9, disse modeller udviser relevante biologiske og fysiologiske forskelle i forhold til mennesker10. For at overvinde disse forskelle mellem murine og menneskets biologi samt anatomi, menneskelige ex vivo 3D lunge væv kultur anvendes (3D-LTC) systemer i forskellige områder inden for biomedicinsk forskning. Disse 3D-LTC kultur systemer er baseret på præcision-cut lunge skiver (PCLS). Generation af PCLS ex vivo giver mulighed for analyse af en tredje rumlige dimensioner, som giver mulighed for undersøgelse af de rumlige og funktionelle relationer af celler i hele alveolerne og airways11, samt interstitium, vaskulatur og mesothelium. Især, er PCLS ex vivo modeller flercellede, hvilket betyder, at de indeholder mest funktionelle celler af in situ lunger, således nøje repræsentere celler native biologiske miljø og således at overvinde den begrænsede celle-celle og celle-matrix samspillet i de fleste 2D cellekultur tilgange. Indtil nu, ex vivo murine PCLS blev brugt til at modellere lungesygdomme som KOL12, lunge fibrose13, lung cancer14, virusinfektion15,16, bronchopulmonary dysplasia17, og astma18. Men en betydelig del af romanen drug behandlingsformer i menneskelige lungesygdomme, der blev undersøgt i kliniske forsøg Oversæt ikke til klinikken på grund af deres manglende effektivitet eller sikkerhed, assumingly grund men betydelige forskelle mellem menneske og murine biologi og sygdom19,20,21.
I flere år, har menneskelig PCLS anvendt i vid udstrækning til at vurdere lunge toksicitet af kemikalier og lægemidler. For nylig er menneskelige lungevæv blevet brugt fra patienter med KOL22,23, astma24og lunge fibrose25, at forfølge patofysiologiske og farmakologiske undersøgelser. Ved hjælp af resektion patient orgel materiale og generere PCLS deraf, man kan sammenfatte store sygdom kendetegnende i en kompleks 3D væv miljø22 repræsenterer og bevare de fleste af de indfødte cellulære mangfoldighed af orglet. Derudover var sygt væv anvendes i en række forskellige eksperimentelle opsætninger vist at efterligne sygdom-lignende ændringer i lever, tarmen og nyre26,27,28,29.
Dog, behandling af lungevæv forbliver udfordrende af flere grunde. I modsætning til solid væv, native lunge parenkym tendens til at skjule uden ventilation og udstiller lavere væv stivhed. Disse egenskaber hindre udskæring af væv. Således, fyldning af luftvejene og den alveolære rum med lav-smeltende punkt Agarosen bevarer den oprindelige lunge struktur og giver stivhed til præcision-cut udskæring af murine og menneskelige lungerne30. Menneskelige lunge resectates doneret til forskningsformål er i sagens natur anatomisk, genetisk og fysiologisk meget forskelligartede, således ofte præsentere en høj indbyrdes patient variabilitet, når du udfører eksperimenter25. I modsætning til hele lap eller hele lunge explants, lunge prøver resektion med thoraxkirurgi ikke nødvendigvis følge de anatomiske segmenter og derfor kræver særlig forberedelse. I denne artikel giver vi en detaljeret og optimeret protokol for generation af menneskelige PCLS fra resektion lungevæv og deres efterfølgende dyrkning og eksperimenterende brug til model lungesygdom.
Protocol
Brugen af menneskelige væv blev godkendt af den etiske komité i Ludwig Maximillian Universitet [München, Tyskland (projektnummer 455-12)]. Tumor-fri menneskelige lunge resektion blev leveret af Asklepios Biobank for lungesygdomme (Gauting, Tyskland, projektnummer 333-10).
Bemærk: Alle procedurer af menneskelige PCLS produktion (figur 1) er færdig i en steril laminar flow hætte.
1. fremstilling af instrumenter og materialer
-
Forberede alle materialer til inflationen i lungevæv med Agarosen som beskrevet nedenfor.
- Forberede dyrkning medium: Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) F-12 suppleret med L-glutamin, HEPES, 10.000 IE Penicillin, 10.000 IE Streptomycin og 0,1% (v/v) føtal bovint serum.
Bemærk: Medium er anvendt ved 37 ° C. - Forberede en steril metal bakke dækket med silkepapir. Placer en steril 15 cm celle kultur parabol på bakken.
- Fyld celle kultur parabol med dyrkning medium 15 mL.
- Forberede en 3% (w/v) Agarosen løsning ved at opløse den passende mængde af low-smeltende punkt Agarosen i mindst 30 mL af dyrkning medium.
- Varme løsning i en mikrobølgeovn indtil kogende. Cool Agarosen løsning til 42 ° C i et vandbad. Holde den flydende Agarosen løsning gemt i vandbad.
- Forbered flere 50 mL konisk rør fyldt med flydende agarosegelelektroforese.
- Forberede dyrkning medium: Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) F-12 suppleret med L-glutamin, HEPES, 10.000 IE Penicillin, 10.000 IE Streptomycin og 0,1% (v/v) føtal bovint serum.
2. resektion lungevæv
- Butik frisk tumor gratis lungevæv af lobectomy resectates straks efter resektion i DMEM F-12 medium ved 4 ° C indtil trin 3.
- Overskrid ikke koldt iskæmi tid på 4-8 timer før behandling.
3. inspektion og udvalg af resektion væv inden Agarosen påfyldning
- Løft væv fra mediet med pincet. For at undgå skader på væv, især til lungehinden, håndtere væv pincet på luftvejene kun.
- Score vævet kvalitet af kriterier af lunge Agarosen påfyldning Score defineret i tabel 1.
- Fortsæt til trin 4, hvis de væv kvalitet er scoret over eller lig med 72. Hvis det væv kvalitet er scoret under 60, fortsætter ikke med yderligere med Agarosen påfyldning.
Bemærk: Hvis væv score er mellem 60 og 68, Agarosen-påfyldning og væv udskæring stadig kan producere fornuftige resultater, og en endelig beslutning om en forlængelse af forsøget har stilles sag for sag. Men lungevæv, der ikke opfyldte de ovennævnte krav, for det meste mislykkes i Agarosen påfyldning.
4. lunge væv Inflation ved agarosegelelektroforese påfyldning
- Løft væv fra lagringsmediet og dræne overskydende medier fra vævet. Overføre lungevæv i 15 cm kultur skålen forberedt i punkt 1.1.2.
- Fylde en 30 mL sprøjte med lav-smeltende punkt Agarosen fra 1.1.3.
- Forberede en perifer venøs kateteret ved at fjerne obturatoren og knytte den til en 30 mL sprøjte
- Identificere en bronkier (0,5-3 mm i diameter) i væv, der ventilation en intakte del af væv (Se figur 2).
- Isæt kanylen i den valgte bronkier (0,5-3 mm i diameter).
- Skub forsigtigt kanylen forsigtigt frem så vidt muligt.
- Forsegle Bronkie omkring kanylen ved komprimering af bronkial mur omkring kanylen med pincet, ideelt fastspænding nogen tilstødende lungepulsåren på samme tid.
- Occlude andre yderligere airways med en kirurgisk klemme til at forhindre Agarosen siver gennem disse airways.
- Løft væv med pincet fra kultur parabol.
- Manuelt hæld Agarosen med sprøjten ikke hurtigere end 0,3 mL/s. Hastigheden af Agarosen påfyldning kan variere mellem ca. 0,05 og 0,3 mL/s på grund af de heterogene modstand i luftvejene og/eller atelektase.
-
Hvis høj modstand mens fyldet eller Agarosen siver ud fra vævet er observeret, prøv hele proceduren med en anden Bronkie fra trin 4.4. Udføre fejlfinding som beskrevet nedenfor.
Bemærk: Graden af Agarosen påfyldning er meget afhængig af placeringen af kateter i vævet og dybe indtrængen af kateter resulterer i Agarosen påfyldning af små kegle som regioner (*) af lungevæv (figur 2 c).- I tilfælde af høj modstand, prøv positionering af kateter fører til korrekt fyldning af de fleste regioner i væv (#) (figur 2D).
- Som stik af tidlige størknede Agarosen i de proksimale bronkierne eller andre luftvejs forhindringer (piletasterne) kan føre til en ufuldstændig påfyldning af væv (figur 2E), Tving ikke Agarosen fylde som dette kan føre til fejl i området fyldt, men ikke i en fyldning af blokeret væv dele.
- Hvis respiratorisk træet stammer fra den kanylerede bronkier er beskadiget under resektion og Agarosen udfylde resultater i en konstant siver ud af den flydende Agarosen (pil i figur 2F), Indsæt kateteret ind i en mere perifer del af luftvejene system til Udfyld mindst en mindre del af væv (*) (fig. 2 g). Derudover forsegle den beskadigede perifere luftvejene med en kirurgisk klemme (pil) (figur 2 H).
- Anvende Agarosen indtil lungevæv fyldes helt. Ikke over puste vævet som dette kan medføre uoprettelige skader på væv struktur og dens celler.
- Klemme den Bronkie, der blev brugt til fyldet straks. Fjerne kanyle før fastspænding.
- Inkuber væv i dyrkningsmediet ved 4 ° C i 30 min at sikre Agarosen størkning.
- Hvis resektion væv har flere bronchiale poster, skal du gentage trin 4.2 til 4.13, indtil alle dele af væv er fyldt med agarosegelelektroforese.
- Gemme Agarosen fyldt lunge væv sektioner i 4 ° C koldt medium før udskæring.
5. præcision-cut lunge udskæring
-
Identificere regioner i lungevæv, der er solidt fyldt med agarosegelelektroforese. Solidt fyldt regioner vil ikke skjule, når de presses forsigtigt med en pincet mod bunden af celle kultur parabol.
- Punktafgifter en 1-1,5 cm3 blok af regioner, der er beskrevet i punkt 5.1, side stadig skal være omfattet med lungehinden.
- Knytte hver enkelt væv blok med pleural side at kontakte indehaveren af vibratome ved hjælp af en ren lim..
Bemærk: Brysthinden er lidt elastisk og derfor hindrer skæring med vibratome blade. Placeret på væv indehaveren, brysthinden vil ikke blande sig med opskæring og, vigtigst, danner en naturlig barriere mellem ren lim og det væv parenkym giver mulighed for minimal diffusion af limen. - Skær lungevæv med vibratome med følgende indstillinger: tykkelse: 500 µm, frekvens: 100 Hz, amplitude af kniven: 1,2 mm, fremad hastighed af klinge af 3-12 µm/s, hvilket afhænger af væv stivhed. Reducere fremspring-hastighed af bladet, hvis udsnittet ikke er skåret korrekt, eller hvis væv blokken, selv begynder at vibrere.
- Forsigtigt overføre udsnittet ved at løfte det med pincet fra vibratome bakken i en brønd på en 12-godt tallerken fyldt med dyrkning medium. Endelig, Ruger lunge skiver i en inkubator standard celle kultur betingelser.
- Stop udskæring når 2-3 mm af væv blok lades unsliced da ren lim kan have kompromitteret væv integriteten af denne region.
6. generation af PCLS slag
- Overføre lunge skiver fra en enkelt brønd til en tom 10 cm parabol.
- Placer en 4 mm biopsi puncher vinkelret på den øvre overflade af en PCLS og begynder at flytte puncher i med uret og mod uret rotationer.
- Fylde cellekulturmedium i wells af en 96-brønd plade. Løft væv slag med pincet og overføre slag i wells af en 96-brønd plade. Endelig, Ruger lunge slag neddykket i medium forberedt i punkt 1.1.1. i en celle kultur inkubator under standardbetingelser (21% (v/v) ilt, 5% (v/v) kuldioxid og 95% fugtighed, ved 37 ° C).
7. vævskultur og prøve høst
- Kultur PCLS og slag natten over i en inkubator standard celle kultur betingelser.
- Kultur PCLS og slag under skitserede betingelse for højst 120 timer efter deres generation at sikre cellulære levedygtighed og funktion.
- Til høst af protein samt RNA, vaske PCLS og slag tre gange i fosfatbufferet saltopløsning (PBS), overføre dem til cryovials og snap-freeze i flydende kvælstof.
-
Prøven medium supernatanten af kulturperler PCLS slag til analyse af udskilles proteiner.
- Histologiske analyser, vaske PCLS og slag tre gange med PBS og løse dem med 4% PARAFORMALDEHYD ved at inkubere i 30 minutter ved 37 ° C. Endelig, gemme PCLS i PBS ved 4 ° C for videre downstream farvning.
Representative Results
PCLS generation
Generation af PCLS kan opdeles i fire væsentlige skridt: kirurgisk lunge væv resektion, Agarosen påfyldning, vibratome-baseret PCLS generation og kultur af PCLS. Resektion lungevæv er fyldt med lav-smeltende punkt agarosegelelektroforese, som tilføjer den nødvendige stivhed til lungevæv for udskæring og bevarer den oprindelige lunge struktur og arkitektur. Bemærk, PCLS generation er meget tidskrævende, således ofte overnight opbevaring af fyldt lungevæv i DMEM F-12 medium kan medtages som et yderligere skridt og PCLS generation er startet på den næste dag. Afhængigt af opsætningen følgende eksperimentelle inkuberes genererede PCLS natten over i standard cellekulturmedium indeholdende 0,1% (w/v) føtal bovint serum, før eksperimentelle betingelser anvendes. 3D-LTCs var levedygtige og udstillet cellulære funktioner (f.eks. overfladeaktive protein sekretion) for op til 120 h22 i dyrkningsbetingelserne skitseret i denne protokol (figur 1) og kan optimeres ved yderligere forbedring heraf.
Agarosen påfyldning
Agarosen påfyldning af væv, var en kanyle i en perifer venøs kateter med en 1,3 mm diameter knyttet til Agarosen-fyldt sprøjte indsat i en bronkier på overfladen af den afskårne væv (figur 2A). Bronkier er ofte lokaliseret tæt på et lungepulsåren. Mens arterierne har tyndere vægge og har tendens til at kollapse, udstillet bronkier en god synlige lumen. Afhængigt af de væv integritet, kan være avanceret kateteret gennem flere generationer af respiratorisk træet i periferien af lungen. Den trængte Bronkie blev lukket omkring kanylen ved hjælp af pincet (figur 2B). Lungepulsåren kan være fastspændt med pincet på samme tid. Bagefter, væv er løftet op og flydende Agarosen er forsigtigt Instilleres i luftvejene.
Afhængigt af placeringen af kateteret, kan et flertal af væv være fyldt med flydende Agarosen (figur 2D). Kegle som dele af lungevæv, som afspejler den lunge parenkym ventileret ved den trængte Bronkie, kan eventuelt få fyldt med Agarosen (figur 2 c). I begge scenarier, et karakteristisk mønster af solidt fyldt væv regioner kan observeres: først, en stor del af væv, der er fyldt i kiler (figur 2D), eller for det andet, mindre fremspringende runde områder af grundigt fyldt væv regioner vises ( Figur 2 c). Hvis dele af luftvejene hindrer Agarosen blodpropper eller andre årsager, kan dele af væv ikke udfyldes korrekt med agarosegelelektroforese. Således kan kun dele af væv være gældende for udskæring. I tilfælde af udslip under Agarosen påfyldning procedure, dele af fyldt respiratorisk træet kan få perforeret og påfyldning af lungevæv bliver næsten umuligt dog, mulige løsninger omfatter påfyldning via en mere perifer Bronkie, en dybere indtrængen af kanylen i de distale airways (fig. 2 g), eller potentielle fastspænding af lækage område (figur 2 H).
Præcision-cut lunge udskæring
Væv blokke på en længde og bredde på 1-1,5 cm var skåret ud fra væv regioner, som var helt fyldt med størknede Agarosen ()figur 3A-3B). Næste, de enkelte væv blokke blev limet på væv indehaveren af vibratome (figur 3 c). 500 µm tykt PCLS blev genereret, hvorimod væv blok på vibratome rykkede frem med hastigheder mellem 3-12 µm/s. (figur 3D-3F). Endelig, PCLS blev nedsænket i cellekulturmedium indeholdende 0,1% (w/v) føtal bovint serum og kulturperler på standard celle kultur betingelser, som skitserede trin 7.
Eksperimentelle udlæsninger af menneskelige 3D-LTC efter 48h dyrkning
En repræsentativ immunofluorescens farvning, som tidligere beskrevet af Alsafadi et al.25, er vist i figur 4A-4 C. Immunolabeling af fibronektin (rød) og cellekerner (DAPI, blå), tilladt for billeddannelse af de bevarede alveolær struktur i den menneskelige 3D-LTC ex vivo. Behandling af menneskelige PCLS slag med en profibrotic cytokin cocktail (herunder omdanne vækst faktor beta 1, Trombocyt afledt vækstfaktor AB, lipophosphatidyl syre, og tumor nekrose faktor alfa) for 48 h resulterede i fibrose-lignende ændringer i menneskelige 3D-LTCs. Af qPCR, blev en betydelig induktion af fibrose-relevante ekstracellulære matrix komponenter kollagen type 1 og fibronektin gener i 3D-LTC slag observeret ved behandling med profibrotic cocktail (figur 4D). Derudover blev protein niveauer af mesenchymale markør vimentin fundet upregulated i 3 ud af 4 patienter efter behandling af 3D-LTC slag (figur 4E).
Figur 1: arbejdsgang for PCLS generation. Tumor-fri områder af lunge resektion inspiceres grundigt på grund af deres væv integritet. Hvis væv er scoret egnet til videre brug (scoring er forklaret i detaljer i afsnittet materiale og metoder), det næste er fyldt med flydende agarosegelelektroforese. Væv gader fyldt med størknede Agarosen er efterfølgende skiver med en vibratome. Nedsænket i cellekulturmedium, er 3D-LTC kulturperler op til 120 h efter deres generation. Downstream analyser af 3D-LTCs involverer protein - eller RNA-udtryk samt levende væv fluorescens imaging og immunfluorescens farvning efter fiksering af væv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: fylde lungevæv med lav-smeltende punkt agarosegelelektroforese. Lungevæv er kanylerede med en perifer venøs kateter, som er indsat i en Bronkie støder op til lungepulsåren (figur 2A). Pincet bruges til at lave kanylen i Bronkie og spænd lungepulsåren for at undgå udsivning af den flydende agarosegelelektroforese. Flydende Agarosen på 42 ° C hældes i lungevæv med en 30 mL sprøjte (figur 2B). En distale positionering af kanylen under påfyldning vil resultere i små områder af fyldt væv (figur 2 c), mens proksimale positionering vil sikre påfyldning af en større væv volumen (figur 2D). Eventuelle blokeringer af luftvejene vil reducere mængden af væv volumen, der kan blive fyldt (figur 2E). Ved agarosegelelektroforese utæt, en distal kanyle positionering og/eller fastspænding af lækage side muliggør korrekt Agarosen påfyldning af lungevæv ()figur 2F-2 H). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: præcision-cut lunge udskæring. En vellykket Agarosen-fyldt lungevæv bruges til punktafgifter et stykke af en væv blok (1 cm x 1,5 cm x 1 cm) med en skalpel (figur 3A). Næste skåret væv blok er limet til væv indehaveren, skalalinjen angiver 1 cm (figur 3B). Helst, vævet er limet med dens pleural overflade til overfladen af væv indehaveren som vist i figur 3 c. 500 µm tykke skiver er skåret af vibratome med en safir kniv i en vinkel på 10° - 15° i forhold til væv (figur 3D og 3E). Skæring procedure resulterer i 2-3 cm3 store intakt lunge skiver, skala bar = 5 mm (figur 3F). Derudover ved hjælp af en biopsi puncher, kan små reproducerbare slag med en diameter på 4 mm genereres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: eksperimenterende udlæsninger af menneskelige 3D-LTCs efter 48h kultur. En menneskelig 3D-LTC punch af 4 mm i diameter blev immunostained for fibronektin (i rødt) og DAPI (i blåt) ()figur 4A-4C). Skalere barer = 1.000 µm. figur 4 c viser det flettede billede. RNA analyse af PCLS af kvantitativ RT-PCR viser betydelige stigninger i COL1A1 og FN1 genekspression ved profibrotic cocktail25. Figur 4E viser en immunblot af hele protein lysates af PCLS, som blev behandlet med en fibrotisk cocktail25. Sondering for Vimentin og β-Actin påvist øget protein udtryk for de mesenkymale markør (vimentin) efter behandling med profibrotic faktorer i patientprøver 1, 3 og 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Kriterium | Point |
| Vævsprøve har intakt pleural overflade. | 20 |
| Vævsprøve synes makroskopisk intakt, mangler indsnit, kvaser, brud og forvridninger. | 20 |
| Vævsprøve indeholder mindst én Bronkie med en diameter på > 1mm. | 20 |
| Vævsprøve indeholder ingen eller kun lille beløb af blod. | 4 |
| Vævsprøve var gemt fuldt i medium og viser ingen åbenlyse tegn af atelektase. | 4 |
| Vævsprøve var resektion inden for de sidste fire timer. | 4 |
| Vævsprøve er større end 5cm i dens største diameter. | 4 |
| Score for at opsummere: |
Tabel 1: lunge Agarosen påfyldning Score. Lunge Agarosen påfyldning Score (LAFS) korrelerer med succesrate til at fylde en væv resektion med Agarosen for sine efterfølgende vibratome-baseret PCLS produktion. Scoren opsummerer alle punkter af kriterier opfyldt af vævet. En LAFS lig med eller over 72 forudsiger godt Agarosen udfylde egenskaber, en score under 60 forudsiger en meget sandsynlig manglende Agarosen påfyldning af væv.
Discussion
Den protokol, der er beskrevet i dette manuskript dækker generation af PCLS fra menneskelige lunge væv resectates ved at udfylde det med flydende Agarosen og efterfølgende vibratome udskæring. Generation af væv skiver blev demonstreret inden for et par af organer, som lever og hjerne, den iboende stivhed af disse organer mulighed for direkte udskæring uden nogen ændring af væv. Bemærke er den indledende ordentlig forberedelse af lungevæv de mest afgørende skridt i at skabe PCLS. Agarosen påfyldning af lungen er metoden til at stabilisere sin bløde og elastiske karakter, og at sikre en ensartet og reproducerbar PCLS generation. Store airways af resektion lungevæv er kanylerede for at give adgang til de små luftveje og intakt lunge parenkym. Manglen på en intakt lungehinden, hvilket gør Agarosen fylder næsten umuligt, er en væsentlig årsag til hvorfor lungevæv er for det meste ikke brugbar for lunge udskæring. Fremadrettet, kunne en syntetisk brysthinden oprindeligt designet til at udføre funktionelle eksperimenter på decellularized stilladser potentielt anvendes for at opnå succesfulde Agarosen fyldning af explants, der mangler en intakt brysthinden31. Resektion resulterer i en menneskelig lunge væv stykke med intakt brysthinden er afgørende for at generere væv blokke til udskæring. Resektion væv er mere tilgængelige på grund af tumor-fri væv fra kræft resektion end fuldt intakt lapper eller hele-lunge explants af patienter, der undergik lunge transplantation.
Almindeligt, to systemer anvendes til at producere PCLS: Krumdieck væv slicer15 og vibrerende mikrotomer (vibratomes). Væv slicere generere skiver af passerer en væv blok gennem en metal fartøj, som skærer PCLS på 90° i slutningen af dette fartøj. Vibratomes generere PCLS ved at flytte en vibrerende kniv vandret over en forankrede blok af væv, der er nedsænket i et afkølet medium bad, som i forhold til Krumdieck udsnitsværktøjet udøver mindre shear kraft på væv. Dette resulterer i mindre hårde behandling af væv inden dyrkning. På den anden side er vibratome skæring mere tid og arbejde tidskrævende. I vores hænder, vibratome udskæring aktiveret produktionen af højst 100 PCLS eller 500 PCLS slag på én dag, tilstrækkeligt for mest eksperimentelle undersøgelser. PCLS kan dyrkes på forskellige måder: (a) knyttet til Trans-brønde, således skaber en flydende luftgrænseflade (ALI) system, (b) som dynamisk organ kultur (DOC), eller (c) neddykket i cellekulturmedium på standard celle kultur betingelser. I detaljer dyrkning af PCLS var tidligere beskrevet22,23,25; en fælles standard for dyrkning forhold mellem deres brug i forskellige laboratorier rundt om i verden er dog stadig mangler. Navnlig kultur tid kan være kritisk: som i murine PCLS, et tab af SFTPC positive alveolær type 2 celler er observeret 144 h, dog ikke efter 120 h22. Derudover synes metaboliske aktivitet at forblive stabil i murine22 og menneskelige PCLS25 til 120 h.
Der er et par af tekniske begrænsninger for generation af PCLS: antallet og størrelsen af resectates svinger over tid; effektiviteten af Agarosen fylde, der afhænger af tilstedeværelsen af intakt brysthinden inden for den fremkomne væv, bestemmer den endelige succes af PCLS generation; og væv ødelæggelse forårsaget af patologiske ændringer inden for den fremkomne (syge) lungevæv kan forstyrre PCLS forberedelse. Luftvejene forhindringer og fibrotisk væv mangler intakt alveolær plads hindre med Agarosen fyldning og dermed gøre udskæring af fibrotisk væv en krævende opgave. Emphysematous væv som fundet i sygdomme som KOL eller alfa-1-anti-trypsin mangel ikke kan modstå presset fra Agarosen påfyldning, og vil resultere i ruptur af alveolerne og arkitektoniske artefakter. I disse tilfælde, kan brugen af lav Agarosen koncentration, fx, 1% (w/v), være nyttigt at formindske presset og hastighed ved agarosegelelektroforese fyldning. Samlet set kan tilstanden sygdom af væv dramatisk begrænse brugen af vævet til PCLS generation. Alle disse parametre stoerrelsen af PCLS, der kan genereres fra lungevæv, og også mængden tid, det tager for at producere PCLS. Yderligere er begrænsninger af PCLS uoverensstemmelser mellem forskellige lunge skiver med hensyn til størrelse eller væv indhold, som kræver yderligere normalisering foranstaltninger for eksperimenter. For at overvinde dette, kan biopsi slag af lignende regioner af den samme skive genereres. Denne procedure er tilbøjelig til at reducere væv variabilitet, og som en ekstra fordel, øge antallet af PCLS prøver, der kan bruges til eksperimenter.
Afslutningsvis, menneskelige 3D lunge vævskulturer fra Agarosen fyldt PCLS give en komplekse menneskelige model til at studere lunge fysiologi og sygdomme. Protokollen indeholder en detaljeret beskrivelse af forberedelsen af PCLS fra resektion lungevæv og deres dyrkning, og desuden løser udfordringer i Agarosen fyldning af menneskelige lunge resektion og hvordan man kan overvinde dem.
Disclosures
Alle forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for Marisa Neumann ekspert teknisk bistand. Alle lungevæv blev venligt leveret af CPC-M Bio-arkiv. Dette arbejde blev støttet af den tyske Center af lunge forskning (DZL), Helmholtz Association og CPC Research School tilskud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | - | |
| Hyrax CU 65 | Zeiss | - | |
| Vasofix Braunüle 18 G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
| 30 mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
| Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
| Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
| Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | - | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
| Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
| Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
- Rosenberg, S. R., Kalhan, R., Mannino, D. M. Epidemiology of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: Prevalence, Morbidity, Mortality, and Risk Factors. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine Med. 36 (4), 457-469 (2015).
- Hekking, P. P., et al. The prevalence of severe refractory asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (4), 896-902 (2015).
- Woodard, G. A., Jones, K. D., Jablons, D. M. Lung Cancer Staging and Prognosis. Cancer Treatment and Research. 170, 47-75 (2016).
- Ley, B., Collard, H. R., King, T. E. Clinical course and prediction of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 183 (4), 431-440 (2011).
- Burgstaller, G., et al. The instructive extracellular matrix of the lung: basic composition and alterations in chronic lung disease. European Respiratory Journal. 50 (1), (2017).
- Degryse, A. L., Lawson, W. E. Progress toward improving animal models for idiopathic pulmonary fibrosis. The American Journal of the Medical Sciences. 341 (6), 444-449 (2011).
- Fricker, M., Deane, A., Hansbro, P. M. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 9 (6), 629-645 (2014).
- Sagar, S., Akbarshahi, H., Uller, L. Translational value of animal models of asthma: Challenges and promises. European Journal of Pharmacology. 759, 272-277 (2015).
- Williamson, J. D., Sadofsky, L. R., Hart, S. P. The pathogenesis of bleomycin-induced lung injury in animals and its applicability to human idiopathic pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 41 (2), 57-73 (2015).
- Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of beta2-adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
- Skronska-Wasek, W., et al. Reduced Frizzled Receptor 4 Expression Prevents WNT/beta-Catenin-driven Alveolar Lung Repair in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 196 (2), 172-185 (2017).
- Lehmann, M., et al. Senolytic drugs target alveolar epithelial cell function and attenuate experimental lung fibrosis ex vivo. European Respiratory Journal. 50 (2), (2017).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Ebsen, M., et al. Infection of murine precision cut lung slices (PCLS) with respiratory syncytial virus (RSV) and chlamydophila pneumoniae using the Krumdieck technique. Pathology - Research and Practice. 198 (11), 747-753 (2002).
- Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
- Royce, S. G., et al. Airway Remodeling and Hyperreactivity in a Model of Bronchopulmonary Dysplasia and Their Modulation by IL-1 Receptor Antagonist. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (6), 858-868 (2016).
- Donovan, C., et al. Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 309 (10), L1219-L1228 (2015).
- Zscheppang, K., et al. Human Pulmonary 3D Models For Translational Research. Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).
- Fisher, R. L., et al. The use of human lung slices in toxicology. Human & Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
- Wang, L., et al. Differences between Mice and Humans in Regulation and the Molecular Network of Collagen, Type III, Alpha-1 at the Gene Expression Level: Obstacles that Translational Research Must Overcome. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 15031-15056 (2015).
- Uhl, F. E., et al. Preclinical validation and imaging of Wnt-induced repair in human 3D lung tissue cultures. European Respiratory Journal. 46 (4), 1150-1166 (2015).
- Switalla, S., et al. Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices. Toxicology and Applied Pharmacology. 246 (3), 107-115 (2010).
- Banerjee, A., et al. Trichostatin A abrogates airway constriction, but not inflammation, in murine and human asthma models. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (2), 132-138 (2012).
- Alsafadi, H. N., et al. An ex vivo model to induce early fibrosis-like changes in human precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), L896-L902 (2017).
- Westra, I. M., Oosterhuis, D., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut liver slices as a model for the early onset of liver fibrosis to test antifibrotic drugs. Toxicology and Applied Pharmacology. 274 (2), 328-338 (2014).
- Vatakuti, S., Schoonen, W. G., Elferink, M. L., Groothuis, G. M., Olinga, P. Acute toxicity of CCl4 but not of paracetamol induces a transcriptomic signature of fibrosis in precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 29 (5), 1012-1020 (2015).
- Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Disease Models & Mechanisms. 8 (10), 1227-1236 (2015).
- Li, M., de Graaf, I. A., Groothuis, G. M. Precision-cut intestinal slices: alternative model for drug transport, metabolism, and toxicology research. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (2), 175-190 (2016).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Wagner, D. E., et al. Design and Synthesis of an Artificial Pulmonary Pleura for High Throughput Studies in Acellular Human Lungs. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 184-195 (2014).
