Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת פרוסות מלא agarose דיוק-קאט אמבריולוגיה מרקמות החולה resected המתאימים ליצירת ריאות 3D בתרביות רקמה למחלות ריאה אנושיים מודל במחקרים ביולוגי וביו.
Abstract
תרגום של תגליות הרומן למחלה האדם מוגבל בשל הזמינות של האנושי רקמות מבוססי מודלים של המחלה. ריאות דיוק-לחתוך פרוסות (PCLS) משמש בתרביות רקמה בריאה תלת-ממד (3D-LTCs) מייצגים אלגנטי ומודל תא 3D ביולוגית מאוד רלוונטי תרבות, אשר דומה מאוד רקמות באתרו עקב המורכבות שלהם, ביומכניקה ומולקולרית ההרכב. רקמות לחתוך מוחל נרחב במודלים של בעלי חיים שונים. 3D-LTCs נגזר PCLS האנושי יכול לשמש כדי לנתח את התגובות תרופות חדישות, שעשויה לסייע עוד יותר כדי להבין טוב יותר את מנגנוני ואת תפקודית השפעות הסמים על רקמה אנושית. הכנת PCLS מדגימות רקמת ריאה בניתוח resected של חולים, אשר חוו כריתת ריאה, מגדילה את הנגישות של חולה ואת רקמות peritumoral. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט לדור של האדם PCLS של רקמת הריאה החולה בניתוח resected אלסטי רך. Agarose הוצג לתוך מרחב bronchoalveolar של resectates, ולכן שמירה על מבנה הריאות והגברת הנוקשות של הרקמה, אשר חיוני שמגיע עוקבות. 500 פרוסות עבות מיקרומטר הוכנו מהגוש רקמות עם vibratome. הביופסיה שנלקחו PCLS להבטיח רקמה דומה גודל מדגם ומכשירים להמשיך להגדיל את כמות דגימות רקמה. התרבויות רקמת הריאות שנוצר יכול להיות מיושם במגוון לימודי בביולוגיה אמבריולוגיה, כולל פתופיזיולוגיה, מנגנונים של מחלות שונות, כגון תהליכים שהותירה ברמות הסלולר שלה הכי טוב (נולד ב- sub). היתרון הגבוהה של הדגם ex-vivo 3D-LTC הוא הייצוג שלו קרוב של הריאה האנושי באתרו בגין אדריכלות רקמות תלת-ממד, גיוון סוג התא, ריאות אנטומיה, כמו גם את הפוטנציאל עבור הערכה של רקמות מחולים בודדים, אשר רלוונטי להמשיך ולפתח אסטרטגיות מקוריות עבור דיוק רפואה.
Introduction
מחלות ריאה כרונית וחמורה הן הגורם העיקרי של התחלואה והתמותה ברחבי העולם1. עבור חולים עם מחלות ריאה כרוניות כמו מחלת ריאות חסימתית (COPD)2, אסטמה חמורה3, סרטן ריאות4 מחלות ריאה parenchymal ' מאטום לשקוף '5, טיפולים המרפא כיום אינם זמינים. למרות מחקרים במודלים של בעלי חיים למחלות ריאה יש העמיקה את ההבנה של מחלת pathomechanisms6 , הובילו הזיהוי של פוטנציאל מטרות טיפולית הרומן7,8,9, מודלים אלה מציגים הבדלים ביולוגי, פיזיולוגיים רלוונטי בהשוואה בני10. כדי להתגבר על אלו אי-התאמות בין ביולוגיה מאתר ואנושי, כמו גם אנטומיה, אנושי ex-vivo תרביות רקמה בריאה תלת-ממד (3D-LTC) מערכות משמשים במגוון תחומי המחקר הביו-רפואי. מערכות התרבות 3D-LTC אלה מבוססים על ריאות דיוק-לחתוך פרוסות (PCLS). הדור של PCLS ex-vivo מאפשר ניתוח של dimensionality המרחבי השלישי, אשר מאפשר חקירה של קשרי הגומלין המרחבי פונקציונלי של תאים כולו alveoli ו איירווייז11, כמו גם interstitium, להערכת ו mesothelium. ראוי לציין, PCLS ex-vivo מודלים הם multicellular, כלומר שהם מכילים תאים הכי פונקציונלי של הריאות באתרו, ובכך מקרוב המייצג התאים לסביבתם הטבעית הביולוגית, ובכך להתגבר על התא מוגבל-תא ואינטראקציה תא מטריצה ב 2D רוב תרבית תאים מתקרב. עד עכשיו, שמחוץ PCLS מאתר שימשו להדגמת מחלות ריאות, כמו COPD12, פיברוזיס של הריאה13, סרטן ריאות14, זיהום נגיפי15,16, דיספלסיה bronchopulmonary17, ו 18. עם זאת, שיעור ניכר של טיפולים תרופתיים חדשניים במחלות ריאות אנושי זה נחקרו בניסויים קליניים לא לתרגם למרפאה עקב חוסר יעילות או בטיחות, assumingly בשל עדיין ניכר הבדלים בין בני האדם, מאתר ביולוגיה ומחלות19,20,21.
על פני מספר שנים, PCLS האנושי שימשו בעיקר כדי להעריך את הריאות רעילות של כימיקלים וסמים. רק לאחרונה, רקמת הריאה האנושי שימש מחולים עם22,23COPD, אסטמה24ו פיברוזיס של הריאה25, לרדוף אחר מחקרים הקשורים pathophysiological תרופתי. על ידי שימוש בחומר resected האיבר החולה, הפקת PCLS הימנו, אחד יכול לסכם המחפשים המחלה העיקריים רקמות תלת-ממדיים מורכבים הסביבה22 ייצוג ושמירה על רוב המגוון הסלולר מקורית של האיבר. יתר על כן, רקמות חולות מיושם במגוון setups ניסיוני הוצגה לחקות שינויים, כמו מחלת כבד, מעיים וכליות26,27,28,29.
עם זאת, העיבוד של רקמת הריאה נותר מאתגר מכמה סיבות. בניגוד רקמה מוצק, parenchyma הריאה יליד נוטה ללא אוורור ותערוכות התחתון רקמות קשיחות. מאפיינים אלה לעכב את חיתוך של הרקמה. לפיכך, מילוי של דרכי הנשימה ואת הרווח מכתשי עם agarose נקודת התכה נמוכה משמר את מבנה הריאות מקורית ומספקת הקשיחות הדרושה דיוק-קאט לחתוך של הריאות מאתר ואנושי30. Resectates אמבריולוגיה שנתרמו למטרות מחקר הן על ידי הטבע שלהם מבחינה אנטומית, גנטית, מבחינה פיזיולוגית מאוד מגוונת, לכן לעיתים קרובות הצגת השתנות גבוהה בין המטופל בעת ביצוע ניסויים25. בניגוד כל האונה או explants כל הריאה, ריאות resected על-ידי ניתוח החזה לא בהכרח בצע את מקטעי אנטומי ודוגמאות, לכן, דורשים הכנה מיוחדת. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט וממוטב לדור של האדם PCLS של רקמת הריאה resected ושלהם עוקבות הטיפוח-תרגול שימוש ניסיוני למחלות ריאה מודל.
Protocol
השימוש של רקמה אנושית אושרה על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת לודוויג-מקסימיליאן [מינכן, גרמניה (פרויקט מספר 455-12)]. כריתות ללא גידול אמבריולוגיה שסופקו על-ידי Biobank אסקלפיוס (asklepios) למחלות ריאה (Gauting, גרמניה, פרויקט מספר 333-10).
הערה: כל ההליכים לייצור PCLS האנושית (איור 1) נעשים תחת ברדס זרימה שכבתית סטרילי.
1. הכנת כלים וחומרים
-
להכין את כל החומרים על האינפלציה של רקמת הריאה עם agarose כפי שמתואר להלן.
- להכין המדיום טיפוח: F-12 בינוני נשר שונה (DMEM) של Dulbecco בתוספת-גלוטמין, HEPES, 10,000 IE פניצילין, 10,000 IE סטרפטומיצין, סרום שור עוברית 0.1% (v/v).
הערה: בינוני משמש ב 37 º C. - להכין מגש מתכת סטרילי מכוסה בנייר טישו. המקום לצלחת תרבות תא סטרילי 15 ס מ על המגש.
- למלא את המנה התרבות התא 15 מ"ל של טיפוח בינוני.
- להכין פתרון agarose 3% (w/v) על ידי המסת את הכמות המתאימה של agarose נקודת התכה נמוכה במינימום של 30 מ של טיפוח בינוני.
- מחממים את הפתרון במיקרוגל עד רתיחה. מגניב הפתרון agarose 42 ° C בתוך אמבט מים. שמור את הפתרון agarose הנוזלי המאוחסן באמבט מים.
- הכן מספר 50 מ ל חרוט צינורות מלאים של agarose נוזלי.
- להכין המדיום טיפוח: F-12 בינוני נשר שונה (DMEM) של Dulbecco בתוספת-גלוטמין, HEPES, 10,000 IE פניצילין, 10,000 IE סטרפטומיצין, סרום שור עוברית 0.1% (v/v).
2. רקמת הריאה resected
- חנות הגידול טריים רקמת הריאה חינם של כריתת האונה resectates מיד לאחר כריתה במדיום DMEM F-12 ב 4 ° C עד שלב 3.
- לא יעלה על איסכמיה קר בתקופה של 4-8 שעות לפני העיבוד.
3. פיקוח ומבחר של רקמת Resected לפני מילוי Agarose
- הרם את הרקמה של המדיום עם פינצטה. על מנת למנוע נזק לרקמות, במיוחד לא קרום הריאות, להתמודד עם הרקמה עם פינצטה-רק את דרכי הנשימה.
- ציון איכות רקמת לפי קריטריונים של הריאות Agarose מילוי הציון שהוגדרו בטבלה1.
- המשך לשלב 4 אם האיכות של הרקמה הוא הבקיע מעל או שווה ל- 72. אם האיכות של הרקמה הוא הבקיע מתחת ל-60, לא ימשיכו עוד יותר עם agarose מילוי.
הערה: אם התוצאה רקמות היא בין 60 ל 68, agarose-מילוי וחלוקת רקמות עדיין עשוי לייצר תוצאות סבירות ולאחר החלטה סופית על התמשכות של הניסוי צריך להיות עשוי התיק לתיק. עם זאת, רקמת הריאה עונה על הדרישות הנ ל, נכשל בעיקר ב- agarose מילוי.
4. ריאות רקמות אינפלציה על ידי מילוי Agarose
- הרם את הרקמה מאמצעי אחסון, לנקז עודף המדיה מן הרקמה. העברת רקמת הריאה לתוך המנה תרבות 15 ס מ המבושלות 1.1.2.
- ממלאים מזרק 30 מ ל agarose נקודת התכה נמוכה מ- 1.1.3.
- להכין קטטר ורידי היקפיים על-ידי הסרת את האטם ולחבר אותו מזרק 30 מ
- לזהות את הסמפונות (0.5-3 מ מ בקוטר) ברקמה זה היא איוורור מקטע שלם של הרקמה (ראה איור 2).
- להכניס את הצינורית סמפון שנבחר (0.5-3 מ"מ קוטר).
- דחף בעדינות את הצינורית בעדינות קדימה ככל האפשר.
- חותם את סמפון סביב הצינורית על-ידי דחיסת החומה הסמפונות סביב הצינורית עם מלקחיים, אידיאלי מחבר חובק למעקה כל עורק הריאה סמוכים באותו זמן.
- Occlude איירווייז נוספים אחרים של מלקחיים כירורגיים כדי למנוע agarose דולף דרך אלה איירווייז.
- הרם את הרקמה עם המלקחיים מתוך קערה תרבות.
- באופן ידני שופכים את agarose עם המזרק לא מהר יותר mL 0.3/s. המהירות של agarose מילוי עשוי להשתנות בין כ 0.05 ל- mL 0.3/s בשל התנגדותם הטרוגנית איירווייז ו/או תמט הריאות.
-
אם עמידות גבוהה בעת מילוי או agarose דולף מתוך הרקמה נצפית, נסה שוב את כל התהליך עם הסמפונות שונה משלב 4.4. בצע פתרון בעיות כמתואר להלן.
הערה: מידת agarose מילוי תלויה מאוד את המיקום של הצנתר בתוך הרקמה, חדירה עמוקה של תוצאות קטטר תוך מילוי agarose קונוס קטן כמו אזורים (*) של רקמת הריאה (איור 2C).- במקרה של התנגדות גבוהה, נסה מיצוב של ההפניות קטטר כדי מילוי נאות של רוב אזורי של הרקמה (#) (איור דו-ממדי).
- כמו אטמי של agarose הקרושה מוקדם הסמפונות צינתור או אחרים דרכי הנשימה חסימות (חץ) יכול להוביל מילוי לא שלם של הרקמה (איור 2E), לא להכריח agarose מילוי כמו זה עלול להוביל לפגמים באזור מלא, אך לא סתימה של החלקים רקמות חסמים.
- אם העץ הנשימה נגזר על סמפון cannulated פגום במהלך כריתה, את agarose מילוי תוצאות דולף מתמדת של agarose נוזלי (חץ ב 2F איור), להוסיף את הצנתר לתוך חלק היקפיים יותר למערכת הנשימה למלא לפחות חלק קטן של הרקמה (*) (איור 2G). בנוסף, חותם את דרכי הנשימה היקפיים פגום של מלקחיים כירורגיים (חץ) (איור 2 H).
- החל agarose עד רקמת הריאה מלא לחלוטין. לא לנפח את הרקמה כמו זו עלולה לגרום לנזק בלתי הפיך את מבנה רקמות ותאים שלה.
- מהדק את סמפון ששימש למלית מיד. הסר את הצינורית לפני מחבר חובק למעקה.
- דגירה הרקמה במדיום תרבות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להבטיח agarose התמצקות.
- אם הרקמה resected יש ערכים הסמפונות מרובים, חזור על שלב 4.2 ל 4.13 עד לכל חלקי רקמה מלאים agarose.
- לאחסן הסעיפים רקמת הריאה agarose מלא מדיום קר 4 ° C עד חותך.
5. דיוק-קאט ריאות עם פרוסות
-
לזהות אזורים של רקמת הריאה מלאים ביציבות agarose. אזורים עם מילוי באופן יציב לא יקרוס כאשר הם לחוצים בעדינות עם פינצטה בתחתית המנה התרבות תאים.
- בלו גוש3 1 – 1.5 ס"מ באזורים המתוארים 5.1, ואילו צד אחד עדיין צריך להיות מכוסה קרום הריאות.
- לצרף כל בלוק רקמות בודדים עם הצד פלאורלי פנייה האוחז vibratome באמצעות דבק דבק מגע.
הערה: קרום הריאות מעט גמיש ופוגע לכן החיתוך עם הלהב vibratome. מניחים על בעל רקמות, אדר לא יתערב החיתוך ו, וחשוב, מהווה מחסום טבעי בין הדבק דבק מגע parenchyma של הרקמה ומאפשר דיפוזיה מינימלית של הדבק. - פורסים רקמת הריאה עם vibratome עם ההגדרות הבאות: עובי: 500 מיקרומטר, תדירות: 100 הרץ, משרעת של הסכין: 1.2 מ מ, מהירות העברה של הלהב של 3-12 מיקרומטר/s, אשר תלויה רקמות קשיחות. להפחית את המהירות-בליטה של הלהב אם הפרוסה לא נחתך כראוי, או אם גוש רקמות עצמו מתחיל לרטוט.
- בעדינות להעביר את הפרוסה על ידי להרים אותו עם מלקחיים ממגש vibratome לבאר של צלחת 12-ובכן מלא עם טיפוח בינוני. לבסוף, דגירה הפרוסות ריאות בתוך אינקובטור בתנאים תרבות תא סטנדרטי.
- להפסיק עם פרוסות 2-3 מ מ של גוש רקמות הם עזבו unsliced מאז הדבק דבק מגע עשוי חשף את שלמות רקמות של האזור.
6. דור של אגרופים PCLS
- העבר את הפרוסות ריאות מבאר יחיד צלחת ריקה 10 ס מ.
- מקום כבטלן ביופסיה 4 מ מ orthogonally אל פני השטח העליון של PCLS ולהתחיל להזיז את ניקוב בכיוון הסיבוב בכיוון השעון ונגד כיוון השעון.
- למלא תא תרבות בינוני לתוך הבארות של צלחת 96-ובכן. הרם את האגרופים רקמות עם מלקחיים, להעביר את האגרופים הבארות של צלחת 96-ובכן. לבסוף, דגירה העקיצות ריאות שקוע בתוך המדיום המבושלות 1.1.1. בחממה תרבות תא בתנאים סטנדרטיים (21% (v/v) חמצן, לחות פחמן דו-חמצני ו- 95% 5% (v/v), ב 37 מעלות צלזיוס).
7. תרביות רקמה קצירת מדגם
- תרבות PCLS, אגרופים בין לילה באינקובטור בתנאים תרבות תא סטנדרטי.
- תרבות PCLS, אגרופים בתנאי מחולקת לרמות לתקופה מקסימלית של 120 שעות לאחר הדור שלהם כדי להבטיח הכדאיות הסלולר ותפקוד.
- קציר חלבון, כמו גם ה-RNA, לשטוף PCLS אגרופים שלוש פעמים בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS), להעביר אותם לתוך cryovials, snap-הקפאת בחנקן נוזלי.
-
תגובת שיקוע בינוני מדגם של PCLS בתרבית אגרופים לניתוח של חלבוני המופרש.
- עבור ניתוחים היסטולוגית, לשטוף את PCLS ואת אגרופים שלוש פעמים עם PBS ולתקן אותם עם 4% paraformaldehyde על ידי המקננת למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. לבסוף, לאחסן את PCLS PBS ב 4 ° C עבור נוסף במורד הזרם מכתים.
Representative Results
PCLS הדור
ניתן להפריד את הדור של PCLS ארבעה שלבים חיוניים: כריתה רקמת הריאה כירורגי, מילוי agarose, המבוסס על vibratome PCLS דור והתרבות של PCLS. רקמת הריאה resected מלא agarose נקודת התכה נמוכה, אשר מוסיפה הקשיחות הנדרשת רקמת הריאה שמגיע ושומר את מבנה הריאות יליד ואדריכלות. ראוי לציין, PCLS הדור הוא מאוד זמן רב, ולכן לעיתים קרובות אחסון לילה של רקמת הריאות מלא DMEM F-12 בינוני ניתן לכלול, כשלב נוסף והתחלתי PCLS הדור הוא ביום הבא. בהתאם הגדרת הניסוי הבא, PCLS שנוצר יכול להיות מודגרות בן לילה במדיום תרבות תא רגיל המכיל סרום שור עוברית 0.1% (w/v), לפני החלת תנאי הניסוי. 3D-LTCs היו קיימא שווקה הסלולר פונקציונליות (כגון הפרשת חלבון חומרים פעילי שטח) עד 120 h22 בתנאים תרבות המתוארות ב פרוטוקול זה (איור 1), אולי ניתן למטב על עוד שיפור הימנו.
מילוי Agarose
מילוי agarose של הרקמה, בצינורית של קטטר ורידי היקפי בקוטר 1.3 מ'מ המצורפת את המזרק מלא agarose הוכנס לתוך הסמפונות על פני השטח של הרקמה לחתוך (איור 2 א). הסמפונות מותאמים לעיתים קרובות ליד עורק הריאה. בעוד העורקים יש קירות דקים, נוטים לצמצם, הסמפונות הציג של לומן גלוי טוב. בהתאם השלמות של הרקמה, ניתן מתקדמים הקטטר דרך מספר דורות של העץ הנשימה אל הפריפריה של הריאה. סמפון אף נאטם סביב הצינורית באמצעות פינצטה (איור 2B). עורק הריאה יכול להיות כשכרטיס עם הפינצטה באותו זמן. לאחר מכן, הרקמה מורם, agarose נוזלי הוא בעדינות שהוחדרו לתוך דרכי הנשימה.
בהתאם המיקום של הקטטר, רוב של הרקמה יכול להיות מלא עם נוזלי agarose (איור דו-ממדי). באופן אופציונלי, חרוט כמו חלקי רקמת הריאה, אשר משקפים parenchyma של הריאה מאוורר מאת סמפון אף, עשוי לקבל מלא את agarose (איור 2C). בשני התרחישים, יכול להיות שנצפו דפוס אופייני של רקמות ביציבות מילוי אזורים: קודם כל, חלק גדול מן הרקמה מלאה בפרוסות (איור דו-ממדי), או שנית, קטן יותר בולטות סביב תחומי ביסודיות רקמות מילוי אזורים מופיעים ( איור 2C). אם חלקים של דרכי הנשימה להכשיל עקב agarose קרישי דם או סיבות אחרות, חלקים של הרקמה עלול לא להיות כראוי מלא עם agarose. לפיכך, רק חלקים של הרקמה עשוי להיות רלוונטי שמגיע. במקרה של leakages במהלך agarose הליך מילוי, עשוי לקבל מחורר את חלקי העץ הנשימה מילוי, מילוי של רקמת הריאה מקבל כמעט בלתי אפשרי אולם, דרכים אפשריות לעקיפת הבעיה כוללים את המילוי באמצעות הסמפונות היקפיים יותר, יותר עמוק חדירת הצינורית לתוך דרכי הנשימה הדיסטלי (איור 2G), או מחבר חובק למעקה פוטנציאלי של האזור דליפה (איור 2 H).
ריאות דיוק-קאט לחתוך
רקמות רחובות אורך, רוחב של 1-1.5 ס"מ היו טוחנות מאזורים רקמות, אשר היו מלאים לחלוטין הקרושה agarose (איור 3A-3B). בשלב הבא, אבני רקמה בודדים הודבקו על רקמות האוחז vibratome (איור 3C). מיקרומטר 500 עבה PCLS נוצרו, ואילו גוש רקמות-vibratome התקדם הלאה עם מהירויות בין 3-12 מיקרומטר/s. (איור 3D-3F). לבסוף PCLS היו שקועים בינוני התרבות התא המכיל סרום שור עוברית 0.1% (w/v), תרבותי-תנאי התרבות תא סטנדרטי, המחולק לרמות בשלב 7.
המפרט ניסיוני של תלת-ממד אנושי-LTC לאחר 48 שעות של culturing
צביעת immunofluorescence נציג, כפי שצוין בעבר שתואר על ידי Alsafadi et al.25, מוצג באיור 4Aסי-4. Immunolabeling של fibronectin (אדום) ו תא גרעינים (דאפי, כחול), מותר עבור הדמיה של מבנה מכתשי שהשתמרו ב תלת-ממד אנושי-LTC ex-vivo. הטיפול של האדם PCLS מכה עם ציטוקינים profibrotic קוקטייל (כולל הפיכת גורם הגדילה בטא 1, גורם גידול נגזר טסית דם AB, חומצה lipophosphatidyl, גידול נקרוזה מקדם אלפא) במשך 48 שעות, גרמו לשינויים פיברוזיס דמוי אדם 3D-LTCs. על ידי qPCR, אינדוקציה משמעותית של מטריצה חוץ-תאית פיברוזיס רלוונטיות מרכיבי קולגן סוג 1 ו- fibronectin הגנים ב- 3D-LTC אגרופים נצפתה על הטיפול עם profibrotic קוקטייל (איור 4D). בנוסף, רמות החלבון של vimentin סמן mesenchymal נמצאו upregulated 3 מתוך 4 חולים לאחר טיפול ב 3D-LTC אגרופים (איור 4E).
איור 1: זרימת העבודה של הדור PCLS. הגידול ללא אזורים של הריאות כריתות ומפוקחים ביסודיות בגלל היושר שלהם רקמות. אם הרקמה הוא הבקיע מתאימים לשימוש נוסף (ניקוד הסבר מפורט בסעיף חומר ושיטות), הוא הבא מלא agarose נוזלי. רקמות רחובות מלאים agarose הקרושה הם פרוסים לאחר מכן עם vibratome. . מוסתר במדיום התרבות תאים, 3D-LTC מתורבתים עד 120 קמ לאחר הדור שלהם. ניתוחים במורד הזרם של 3D-LTCs לערב חלבונים או RNA-ביטוי, רקמה חיה פלורסצנטיות הדמיה, כמו גם immunofluorescence מכתים לאחר קיבוע של הרקמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: מילוי רקמת הריאה עם agarose נקודת התכה נמוכה. רקמת הריאה הוא לצינוריות עם קטטר ורידי היקפיים אשר מוכנס לתוך הסמפונות סמוך עורק הריאה (איור 2 א). פינצטה משמשים כדי לתקן את הצינורית סמפון מהדק את עורק הריאה כדי להימנע דולף של agarose נוזלי. Agarose נוזלי-42 ° C נשפך לתוך רקמת הריאה עם מזרק 30 מ ל (איור 2B). מיצוב דיסטלי של הצינורית במילוי תגרום אזורים קטנים של רקמות מלא (איור 2C), בעוד מיצוב proximal יבטיח מילוי נפח רקמת גדול יותר (איור דו-ממדי). כל הפרעה של דרכי הנשימה תפחית את הכמות רקמת אחסון זה יכול להיות מלא (2E איור). במקרה של agarose דולף, בצינורית דיסטלי מיצוב ו/או מחבר חובק למעקה של הצד זליגת מאפשר מילוי agarose נאות של רקמת הריאה (איור 2F-2 H). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: דיוק-קאט לחתוך ריאות. רקמת הריאות מלא בהצלחה agarose משמש לסלק חתיכת גוש רקמה (1 ס"מ x 1.5 ס"מ x 1 ס מ) עם איזמל (איור 3 א). בהמשך הרחוב רקמת נכרת מודבק אל בעל רקמות, סולם בר מציין 1 ס מ (איור 3B). רצוי, הרקמה מודבק עם פני השטח pleural שלו על פני השטח של בעל רקמות כפי שמוצג באיור 3C. 500 פרוסות עבות מיקרומטר נחתכים על ידי vibratome עם סכין ספיר בזווית של 10° - 15° ביחס הרקמה (איור 3D ו- 3E). תהליך חיתוך תוצאות ב- 2-3 ס מ3 ריאות תקין גדולות פרוסות, סולם בר = 5 מ מ (איור 3F). בנוסף, באמצעות כבטלן ביופסיה, אגרופים לשחזור קטנים בקוטר של 4 מ מ ניתן להפיק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: המפרט ניסיוני של תלת-ממד אנושי-LTCs לאחר 48 שעות של תרבות. אגרוף תלת-ממד אנושי-LTC של 4 מ מ קוטר היה immunostained עבור fibronectin (באדום) ודאפי (בכחול) (איור 4A-4C). גודל ברים = 1,000 מיקרומטר. 4C דמות מראה את התמונה הממוזגת. ניתוח ה-RNA של PCLS מאת RT-PCR כמותי מציגה עליות משמעותיות של ביטוי גנים COL1A1, FN1 באמצעות קוקטייל profibrotic25. איור 4E מציג של immunoblot של כל חלבון lysates של PCLS, אשר טופלו של קוקטייל שהותירה25. בודק את Vimentin וβ-אקטין הפגינו ביטוי חלבון מוגברת של סמן mesenchymal (vimentin) לאחר הטיפול עם profibrotic גורמים בדגימות החולה 1, 3 ו- 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| קריטריון | נקודות |
| דגימת הרקמות יש פני השטח pleural ללא פגע. | 20 |
| דגימת הרקמות נראה בעין בלתי מזוינת ללא פגע, חסר חתכים, מועך, יתבקע ואת העיוותים. | 20 |
| דגימת הרקמות מכיל סמפון אחד לפחות בקוטר > 1 מ מ. | 20 |
| דגימת הרקמות מכיל לא או רק מעט כמויות של דם. | 4 |
| דגימת הרקמות היה מאוחסן באופן מלא בינוני ומראה סימן ברור של תמט הריאות. | 4 |
| דגימת הרקמות היה resected בתוך ארבע שעות. | 4 |
| דגימת הרקמות הוא גדול יותר 5 ס מ בקוטר הגדול ביותר שלה. | 4 |
| ציון בסכום: |
טבלה 1: ריאות Agarose מילוי הציון. הריאות Agarose מילוי ציון (LAFS) עולה בקנה אחד עם שיעור ההצלחה למלא כריתה של רקמה עם agarose עבור הייצור PCLS הבאים מבוסס vibratome. התוצאה מסכם את כל הנקודות של קריטריונים נפגשו על ידי הרקמה. LAFS שווה או מעל 72 מנבאת טוב agarose מילוי מאפיינים, ציון מתחת ל-60 מנבא כשל ובסבירות גבוהה של מילוי agarose של הרקמה.
Discussion
הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מכסה את הדור של PCLS מאמבריולוגיה רקמת resectates על-ידי ממלא אותו עם agarose נוזלי וחלוקת vibratome הבאים. דור של רקמות פרוסות הודגם לפני כמה איברים, כמו הכבד והמוח, ואילו הנוקשות הטבועה של איברים אלה מותר ישירה עם פרוסות ללא כל שינוי של הרקמה. ראוי לציין, הכנה נאותה הראשונית של רקמת הריאה הוא הצעד המכריע ביותר ביצירת PCLS. מילוי Agarose של הריאה היא השיטה של בחירה כדי לייצב את טבעה רך וגמיש, ולהבטיח דור PCLS הומוגנית, לשחזור. דרכי הנשימה גדול של רקמת הריאה resected הם לצינוריות כדי לספק גישה קטנות, כמו גם אל parenchyma הריאה ללא פגע. חוסר קרום הריאות תקין, מה שהופך agarose מילוי כמעט בלתי אפשרי, היא הסיבה הראשית למה רקמת הריאה הוא בעיקר לא שמיש ריאות שמגיע. פרוספקטיבי, קרום הריאות סינתטי תוכנן במקור כדי לבצע ניסויים פונקציונלי על פיגומים decellularized יכול לחול באופן פוטנציאלי כדי להשיג מילוי agarose מוצלחת של explants חסרי קרום הריאות תקין של31. כריתות וכתוצאה מכך חתיכת רקמת ריאה אנושיים עם קרום הריאות תקין חיוניים ליצירת רקמות בלוקים שמגיע. רקמת resected זמין יותר בשל רקמת הגידול ללא סרטן כריתות מאשר אונות שלם מלא או כל-לונג explants של חולים שעברו השתלת ריאה.
בדרך כלל, שתי מערכות משמשות כדי לייצר PCLS: Krumdieck רקמות מבצעה15 ומיקרוטומים רטט (vibratomes). רקמות slicers ליצור פרוסות על-ידי העברת גוש רקמה באמצעות כלי מתכת, אשר חותך את PCLS ב- 90° בקצה של כלי השיט הזה. Vibratomes צור PCLS על-ידי הזזת רוטטת הסכין אופקית מעל בלוק המעוגן של רקמת בתוך אמבט בינוני מקורר, אשר לעומת בפורס Krumdieck מפעילה פחות כוח הטיה על הרקמה. התוצאה פחות היחס הקשה של הרקמה לפני התרגול. מצד שני, חיתוך vibratome הוא יותר זמן עבודה רב. בידיים שלנו, vibratome חותך הזמינים הייצור של מקסימום של 100 PCLS או 500 PCLS אגרופים ביום אחד, מספיק ללימודי האקספרימנטאלי ביותר. PCLS יכול להיות תרבותי במגוון דרכים: (א) אלו טרנס-וולס, ובכך יצירת ממשק נוזלי אוויר מערכת (עלי), (ב) כתרבות איבר דינאמי (DOC), או (ג) שקוע בתוך תא בינוני תרבות-תנאי התרבות תא סטנדרטי. הטיפוח בפירוט של PCLS היה שתואר לעיל22,23,25; אולם, תקן נפוץ של טיפוח תנאים בין השימוש שלהם במעבדות שונות ברחבי העולם היא עדיין נעדרת. בפרט, הזמן תרבות עשוי להיות קריטי: כמו מאתר PCLS, הפסד של SFTPC חיובי מכתשי מסוג 2 תאים נצפית לאחר 144 h, אבל לא אחרי 120 h22. בנוסף, פעילות חילוף החומרים נראה נותרים יציבים מאתר22 , PCLS האנושי25 עבור 120 h.
ישנן כמה מגבלות טכניות עבור הדור של PCLS: המספר והגודל של resectates תנודות לאורך זמן; היעילות של agarose מילוי, אשר תלוי הנוכחות של קרום הריאות תקין בתוך רקמת שהושג, קובע הסופי ההצלחה של הדור PCLS; הרס רקמות הנגרמת על ידי שינויים פתולוגיים בתוך רקמת הריאה (חולה) שהושג עשויים להפריע ההכנה PCLS. חסימות דרכי הנשימה רקמות שהותירה חסר שטח מכתשי שלם לעכב עם agarose מילוי, ובכך להפוך חיתוך של הרקמה שהותירה משימה תובענית. Emphysematous רקמות כמו למצוא מחלות כגון COPD או אלפא-1-אנטי-טריפסין לקוי עלול שלא עמדו בלחץ של agarose מילוי, יגרום קרע של alveoli ושל חפצי אדריכלי. במקרים אלה, השימוש של ריכוז agarose נמוך, למשל, 1% (w/v), עשוי להיות שימושי להקטין את הלחץ ומהירות במילוי agarose בסך הכל, המדינה מחלה של הרקמות באופן דרמטי יכול להגביל את השימוש הרקמה לדור PCLS. כל הפרמטרים הללו קובעים את כמות PCLS זה ניתן להפיק של רקמת הריאה, גם משך הזמן שנדרש כדי לייצר את PCLS. יותר מגבלות של PCLS הם חוסר עקביות בין פרוסות הריאות שונה לגבי תוכן גודל או רקמות, אשר דורש צעדים נורמליזציה לניסויים. כדי להתגבר על זה, אגרופים ביופסיה של אזורים דומים של הפרוסה אותה ניתן להפיק. ההליך זה מתאים להפחית את מידת ההשתנות רקמות, בתור יתרון נוסף, להגדיל את מספר דוגמאות PCLS יכול לשמש לניסויים.
לסיכום, אמבריולוגיה 3D בתרביות רקמה מן agarose מלא PCLS לספק מודל אנושי מורכב עבור לימודי פיזיולוגיה ריאות ומחלות. הפרוטוקול מספק תיאור מפורט של הכנת PCLS של רקמת הריאה resected, הטיפוח-תרגול, יתר על כן מטפל אתגרים agarose מילוי של אמבריולוגיה כריתות וכיצד להתגבר עליהם.
Disclosures
כל המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים לנוימן מריסה לסיוע טכני מומחה. לכל רקמות הריאה היו מתבקשים שסופקו על-ידי עלות לקליק-M ביו-ארכיון. עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הגרמנית של מענקי מחקר הריאות (DZL), הלמהולץ האגודה עלות לקליק מחקר בבית הספר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome Hyrax V50 | Zeiss | - | |
| Hyrax CU 65 | Zeiss | - | |
| Vasofix Braunüle 18 G | B. Braun Melsungen AG | 4268130B | |
| 30 mL NORM-INJECT | Henke Sass Wolf | 4830001000 | |
| Guarded disposable scalpels, sterile | Swann-Morton | ||
| Loctite 406 | Henkel | LOCTITE 406 | |
| Synthetic Single Crystal Sapphire | Delaware Diamond Knives | - | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| Special process fetal bovine serum (Sera Plus) | Pan Biotech | P30-3702 | |
| Disposable Biopsy Punch | pfm medical | 48401 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile | Falcon / Corning | 353219 | |
| Agarose, low geling temperature | Sigma | A9414-100G |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
- Rosenberg, S. R., Kalhan, R., Mannino, D. M. Epidemiology of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: Prevalence, Morbidity, Mortality, and Risk Factors. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine Med. 36 (4), 457-469 (2015).
- Hekking, P. P., et al. The prevalence of severe refractory asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (4), 896-902 (2015).
- Woodard, G. A., Jones, K. D., Jablons, D. M. Lung Cancer Staging and Prognosis. Cancer Treatment and Research. 170, 47-75 (2016).
- Ley, B., Collard, H. R., King, T. E. Clinical course and prediction of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 183 (4), 431-440 (2011).
- Burgstaller, G., et al. The instructive extracellular matrix of the lung: basic composition and alterations in chronic lung disease. European Respiratory Journal. 50 (1), (2017).
- Degryse, A. L., Lawson, W. E. Progress toward improving animal models for idiopathic pulmonary fibrosis. The American Journal of the Medical Sciences. 341 (6), 444-449 (2011).
- Fricker, M., Deane, A., Hansbro, P. M. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 9 (6), 629-645 (2014).
- Sagar, S., Akbarshahi, H., Uller, L. Translational value of animal models of asthma: Challenges and promises. European Journal of Pharmacology. 759, 272-277 (2015).
- Williamson, J. D., Sadofsky, L. R., Hart, S. P. The pathogenesis of bleomycin-induced lung injury in animals and its applicability to human idiopathic pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 41 (2), 57-73 (2015).
- Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of beta2-adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
- Skronska-Wasek, W., et al. Reduced Frizzled Receptor 4 Expression Prevents WNT/beta-Catenin-driven Alveolar Lung Repair in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 196 (2), 172-185 (2017).
- Lehmann, M., et al. Senolytic drugs target alveolar epithelial cell function and attenuate experimental lung fibrosis ex vivo. European Respiratory Journal. 50 (2), (2017).
- Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).
- Ebsen, M., et al. Infection of murine precision cut lung slices (PCLS) with respiratory syncytial virus (RSV) and chlamydophila pneumoniae using the Krumdieck technique. Pathology - Research and Practice. 198 (11), 747-753 (2002).
- Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
- Royce, S. G., et al. Airway Remodeling and Hyperreactivity in a Model of Bronchopulmonary Dysplasia and Their Modulation by IL-1 Receptor Antagonist. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (6), 858-868 (2016).
- Donovan, C., et al. Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 309 (10), L1219-L1228 (2015).
- Zscheppang, K., et al. Human Pulmonary 3D Models For Translational Research. Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).
- Fisher, R. L., et al. The use of human lung slices in toxicology. Human & Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
- Wang, L., et al. Differences between Mice and Humans in Regulation and the Molecular Network of Collagen, Type III, Alpha-1 at the Gene Expression Level: Obstacles that Translational Research Must Overcome. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 15031-15056 (2015).
- Uhl, F. E., et al. Preclinical validation and imaging of Wnt-induced repair in human 3D lung tissue cultures. European Respiratory Journal. 46 (4), 1150-1166 (2015).
- Switalla, S., et al. Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices. Toxicology and Applied Pharmacology. 246 (3), 107-115 (2010).
- Banerjee, A., et al. Trichostatin A abrogates airway constriction, but not inflammation, in murine and human asthma models. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (2), 132-138 (2012).
- Alsafadi, H. N., et al. An ex vivo model to induce early fibrosis-like changes in human precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (6), L896-L902 (2017).
- Westra, I. M., Oosterhuis, D., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut liver slices as a model for the early onset of liver fibrosis to test antifibrotic drugs. Toxicology and Applied Pharmacology. 274 (2), 328-338 (2014).
- Vatakuti, S., Schoonen, W. G., Elferink, M. L., Groothuis, G. M., Olinga, P. Acute toxicity of CCl4 but not of paracetamol induces a transcriptomic signature of fibrosis in precision-cut liver slices. Toxicology in Vitro. 29 (5), 1012-1020 (2015).
- Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Disease Models & Mechanisms. 8 (10), 1227-1236 (2015).
- Li, M., de Graaf, I. A., Groothuis, G. M. Precision-cut intestinal slices: alternative model for drug transport, metabolism, and toxicology research. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (2), 175-190 (2016).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Wagner, D. E., et al. Design and Synthesis of an Artificial Pulmonary Pleura for High Throughput Studies in Acellular Human Lungs. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 184-195 (2014).
