Summary
alt1 调节先天免疫, 但这种情况是如何发生的仍未确定。我们使用选择性 malt1 副囊酶抑制剂 mlt-827 来解开 malt1 对 toll 样或 c 型凝集素受体下游的先天信号的贡献, 证明 malt1 调节骨髓细胞因子的产生, 并在下游c 型乳素样受体, 选择性的。
Abstract
除了在淋巴细胞中的功能外, 还有许多研究都涉及到它的功能, 副胸酶 kalt1 在模式识别受体下游的先天细胞中也发挥着重要作用。最好的研究是 c 型乳素样受体家族的 dectin-1 和 dectin-2 成员, 它们以与 alt1 相关的方式诱导 syk 和 card9 依赖信号级联, 从而导致 nf-b 激活。相比之下, toll 样受体 (tlr), 如 tlr-4, 传播 nf-b 激活, 但通过 myd88/依赖 irak 级联发出信号。尽管如此, alt1 是否可能对 tlr-4 信号做出贡献仍不清楚。作为对 falt1 副酶活性的有效和选择性抑制剂, mlt-827 的最新证据表明, 人骨髓细胞中的 tnf-ptr-4 生产与 falt1 的下游无关, 而不是 ttint-1 下游的 tnf 生产, 而 ttint-1 是丙种细胞。依赖。在这里, 我们讨论了 alt1 在模式识别传感中的选择性参与, 进一步使用了各种人和小鼠的细胞制剂, 并刺激了十丁-1、mincle 或 tlr-4 途径。我们还通过探索 tnf 之外的细胞因子, 并将 mlt-827 与 syk 抑制剂 (cpd11) 和 ikk 抑制剂 (afn700) 进行比较, 提供了更多的见解。总体而言, 这些数据为 c 型乳素样受体的 alt1 依赖性提供了进一步的证据--与 tlr 信号相比, 信号传递。
Introduction
2008年1,2 例发现了菌核相关淋巴组织淋巴瘤移位蛋白 1) 的副适应酶活性。自那时以来, 一些研究报告了它对淋巴细胞抗原受体反应的重要贡献。小鼠遗传模型以及药理数据支持 t 细胞、t 细胞依赖性自身免疫和 b 细胞淋巴瘤设置3,4的关键作用。在淋巴细胞中, 在标记11-bcl10-alt1 复合物5的组装时, 会发生 alt1 副酶激活, 这是由 t-或 b 细胞受体下游的抗原受体近端信号触发的。还有充分的证据表明, 类似的 card9-bcl10-大力图1复合物对于在骨髓细胞 6,7 中传播 c 型乳素样受体 (cllr) 下游的信号非常重要, 例如, 十丁-1、十丁-2 和 mincle。十分蛋白-1 已得到特别好的研究, 因为这种途径是关键的主机防御真菌感染 8,9。然而, 在 toll 样受体 (tlr) 通路中, alt1 的含义仍有争议10。最近在人类骨髓细胞中的证据排除了 alt1 副酶活性在 tlr-411 下游tnf-生产监管中的直接作用。
在本工作中, 我们利用人类和小鼠骨髓细胞的各种实验设置和刺激条件, 利用特定的药理工具抑制剂和细胞因子产生的测量, 探索先天信号通路。
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Protocol
实验是根据诺华人类研究伦理委员会的准则和标准进行的。
1. 用人药布制备外周血单个核细胞 (pbmc)
请注意:我们在收集了50毫升的袋子里, 从健康的志愿者那里收到了一件蓬松的外套。它们是在知情同意的情况下提供的, 并通过区域间 blutspende schweizeriches rotes kreuz 收集的。除非另有说明, 否则我们在室温下使用以下程序处理这些问题。
- 准备一把无菌干净的剪刀和一个带塑料袋的1升烧杯 (在层流下)。
- 把蓬松的外套转移到烧杯里, 用剪刀小心地打开它。
- 使用25毫升移液器, 加入100毫升磷酸盐缓冲盐水-乙二胺-四乙酸 (pbssedta:pbs 1xph 7.4 不含无 cl 2 和不 mgcl2, 辅以 2 mL edta ph 8.0)。
请注意:使用相同的移液器, 并在缓慢移液液上下后, 将稀释后的奶油涂层的25毫升放入 6个50毫升的锥形离心管中, 预先填充15毫升的多糖基密度梯度。 - 在 800 x g 下离心 20分钟, 具有适度加速度 (设置为4分 9), 无需刹车, 以便根据细胞的密度分离细胞。
请注意:离心后, 三层可见;一种含有红血球和粒细胞的颗粒, 是由血浆制成的上层, 位于含有外周血单个核细胞 (pbmc) 的白环之间。 - 使用10毫升移液器收获 pbmc 环, 并转移到新的50毫升管。
请注意:通常每件蓬松的外套需要2到 3个50毫升管。在这一阶段, 一些等离子体可能会污染收集到的 pbmc, 这应该不会对随后的浓缩步骤产生影响。 - 使用 pbssedta 顶上高达 50 ml 的每个管, 并以减少离心时间和速度进行三次连续清洗 (在 520 x g时 15分钟, 在 330 x g时 10分钟, 在 150 x g 处10分钟)。
请注意:每一步, 上清液被倒在一个液体废物容器中, 细胞颗粒被重新悬浮在50毫升的 pbssedta 中 (第一次清洗后可以将颗粒聚集在一起)。 - 最后清洗后, 重新悬浮冰凉洗涤缓冲液 (见材料表) 的25毫升中的颗粒, 通过渗透压裂解红血球。
- 孵化, 直到溶液变得清晰 (在室温下≤ 5分钟)。
- 通过添加25毫升的分离缓冲液 (pbs 1x ph 7.4 不含无 cl2和不无 mgcl2, 辅以2% 的热灭活胎儿牛血清 (fbs) 和 1 mL edta ph 8.0) 来停止反应。
- 在 150 x g处再清洗一次, 8分钟。
请注意:在这一阶段, pbmc 可用作散装种群 (见步骤 3: pbmc 和单核细胞治疗和刺激条件), 或加工用于单核细胞浓缩 (见步骤 2: 从 pbmc 制备单核细胞), 或冻结供以后使用 (见步骤 5:单核细胞和 pbmc 冷冻/解冻程序)。
2. 从 pbmc 制备单核细胞
- 将在分离缓冲液中的步骤1.10 获得的 pbmc 重新进行再利用, 并将其计数到 5 x10 7cellss/ml。
- 将细胞悬浮液转移到带有盖帽的14毫升锥形离心管中。
- 在细胞悬浮液、涡旋每毫升中加入50μl 单核细胞富集抗体鸡尾酒, 并在4°c 孵育10分钟。
- 每 ml 细胞加入50μl 单核细胞富集珠。
请注意:珠子必须彻底涡旋, 以确保悬浮物的均匀性。 - 加入珠子后, 不久就会使细胞悬浮液变动, 并在4°c 下孵育5分钟。
- 用分离缓冲液冲洗管的上部, 直到管被填充到10毫升。
- 通过上下移液慢慢混合溶液。
- 将没有盖帽的管放入分离磁铁中。
- 在室温下孵化2.5 分钟。
- 慢慢地倒进一个15毫升的锥形离心管。
- 在此阶段, 直接使用单核细胞 (见步骤3:pbmc 和单核细胞治疗和刺激条件) 或将其分化为immature mo nocytenytd d 内生 c s (imodc) (见步骤 4), 或将其冻结以供后续使用 (请参阅步骤 5)。
3. pbmc 和单核细胞的治疗和刺激条件
- 在培养基中计数细胞并稀释它们 (roswell park 纪念研究所中等 (rpmi) 10% fbs + 1 mm 丙酮酸钠 + 100 uml 青霉素链霉素 (pen/strepycin) + 5μm β-硫醇), 下降到 1.25 x 104 细胞。
- 每道384孔板的每口井分布30μl 的细胞悬浮液。
- 加入15μl 的4倍浓缩复合溶液, 在37°c、5% co2 下预孵育1小时。
- 在最终浓度为 10 ng/ml 的情况下加入脂多糖 (lps), 或将耗尽的 zymsol (dz) 添加到最终浓度为100μgml 的浓度中, 或保存在普通介质中。
- 在 37°c, 5% co2下过夜。
- 以10μl 的上清液来测量分泌的 tnf-a 水平 (见步骤 7: 细胞因子和生存能力测量)。
4. 单核细胞分化为 imodc 和刺激条件
- 计数单核细胞 (在步骤2浓缩) 和离心细胞悬浮在 520 x g 5分钟。
- 移液器关闭上清液并添加培养基 (rpmi + 10% fbs, 以获得 0.4 x10 6 cellsl 的最终细胞悬浮液。
- 加入 80 ngml 重组人 il-4 + 100 ngml gm-csf。
- 在6井板中, 每口井分配5毫升细胞悬浮液。
- 在37°c、5% co2 下孵化7天。
- 第7天, 通过轻轻移液收获细胞, 以避免其激活。
- 离心以 520 x g 5分钟。
- 在没有生长因子的培养基中真空吸气和再悬浮。
- 在 520 x g 离心 5分钟 , 并在培养基中以 1 x 106细胞的速度重新悬浮。
- 在96孔平底板的每口井中分配100μl 细胞悬浮液 (105个细胞)。
- 在37°c 条件下, 在添加50μl 的 4 x 浓缩复合溶液后, 预孵育 1小时, 如步骤 8: 化合物制备所述。
- 添加50μl 的刺激 (4倍浓缩), 如步骤9所述。
- 在37°c 下孵化24小时。
- 将每口井混合, 将细胞和上清液 (sn) 转移到一个96孔 v 型底板中。
- 在 475 x克向下旋转5分钟。
- 将上清液转移到新的96孔平板上, 在-20°c 处密封和冷冻, 直到进一步使用。
5. 单核细胞和 pbmc 冻融程序
-
冻结
- 在 520 x 克的情况下旋转 pbmc 或单核细胞制剂5分钟。
- 真空吸气上清液并在 1 x10 7 细胞的冷冻介质中重新悬浮细胞。
- 将1毫升的电池悬浮液分配到低温管中, 将管道转移到特定的冷却装置 (见材料表), 并将其放置在-80°c。
-
解冻
- 将低温管解冻后, 将其含量迅速转化为含有9毫升培养基的15毫升锥形离心管。
- 离心以 520 x g 5分钟。
- 真空吸气上清液和再悬浮细胞颗粒在5毫升培养基中。细胞现在已经可以进行进一步的实验处理了。
6. 小鼠脾细胞的制备与治疗
请注意:我们根据诺华动物福利组织的指导方针和标准进行了动物祭祀。研究报告得到了区域政府当局道德委员会 (kantonales 生林德拉姆特·德·斯塔特巴塞尔)的批准。我们通过过度暴露来牺牲动物, 尽一切努力将痛苦降到最低。
- 使用配备机械组织研磨装置并填充5毫升冷 rpmi 培养基的管子, 收获脾脏和离解组织。
- 使用分离机的脾脏程序来磨器官。
- 通过100毫米尼龙电池过滤器过滤电池。
- 将悬浮液转移到50°c 时的50毫升管和离心机中 10分钟, 在 320 x g。
- 真空吸气上清液, 在3毫升的冰凉裂解缓冲液中重新悬浮细胞颗粒, 并在冰上孵育≤2分钟。
- 通过添加7毫升的 rpmi 介质来停止裂解。
- 通过100μm 尼龙电池过滤器再次过滤。
- 在4°c 下, 在 330 x g处向下旋转细胞悬浮液10分钟。
- 真空吸气上清液和再悬浮细胞在 11 x10 6 cellsl 在完整的中等 (rpmi 补充 10% fbs, 100 uml pen/step 和5μm β-硫醇)。
- 板 1 x10 6 cells"井 (90μl) 在96孔板 (平底)。
- 如步骤 8.3: 小鼠脾脏细胞的串行稀释所述, 加入5μl 的20x 浓缩复合溶液, 以前在 rpmi 培养基中稀释。
- 在37°c 下孵化 30分钟, 5% co2。
- 加入 5μl 20x 浓缩 dz (最终浓度为 30μg/ml) 或20x 浓缩 lps + ifn-g (tlr-4) (最终浓度为 1μm lps 和 10 ngml ifn-g)。
- 在 37°c, 5% co2下过夜。
- 离心机在 330 x克下10分钟。
- 将上清液转移到新的板材中, 密封并冻结在-20°c, 直到进一步使用。
7. 细胞因子和可行性测量
-
用 htrf 测量人 tnf-a (同质时间分辨荧光)
请注意:该议定书遵循了供应商的建议, 简要概述如下。- 将重组试剂 (抗 tnf-a 隐酯和抗 tnf-a-xl665) 1 体积与19体积重组缓冲液 (50 mm 磷酸盐缓冲液 ph 值7.0、0.8 m 氟化物钾 (kf)、0.2% 牛血白蛋白 (bsa)) 混合。
- 在分配试剂之前, 将两个随时可用的抗体溶液1:1 混合在一起。
- 将进步级的10μl 上清清剂分配到白色384孔板中。
- 分配10μl 的抗体混合物。
- 用封口机覆盖板, 在4°c 下孵育过夜。
- 在微板读取器上读取板 (50–200闪光灯)。
- htrf 法测量人 il-23 (同质时间分辨荧光)
请注意:该议定书遵循了供应商的建议, 简要概述如下。- 将一体积重组试剂 (抗 il-23 密码抗体和抗 il-23 d2 抗体) 与19卷检测缓冲液 #3 混合。
- 在分配试剂之前, 将两个随时可用的抗体溶液1:1 混合在一起。
- 将进步级的10μl 上清清剂分配到白色384孔板中。
- 分配10μl 的抗体混合物。
- 用封口机覆盖板, 在4°c 下孵育过夜。
- 在微板读取器上读取板 (50–200 nm 闪光灯)。
-
通过电化学发光测量人白细胞介素-6、il-8、il-1β和 tnf-α
请注意:所有样品均以稀释剂2的1.5 稀释 (第一次稀释: 150μl 中的 10μl, 180μl 的20μl 稀释)。该协议遵循了供应商的建议:- 稀释样品和标准在稀释剂2。
- 使用 1. 连续褶皱稀释法, 对稀释剂2中的标准进行稀释。
- 用洗涤缓冲液清洗盘子三次。
- 每口井分配50μl 的样品或标准样品。
- 在室温下搅拌2小时。
- 用 pbs + 0.05% 聚山梨酸酯20清洗板四次。
- 在稀释剂3中加入25μl 的检测抗体 (每个抗体的60μl 为3毫升的最终抗体)。
- 在室温下搅拌2小时。
- 用 pbs + 0.05% 聚山梨酸酯20清洗板四次。
- 避免气泡, 添加150μl 每井读缓冲液 (基于特里丝的缓冲液含有三丙胺, 稀释2倍在 ddh20) 作为共同反应物, 用于电化学发光免疫测定中的发光。
- 读取多路板读取器上的板 (无延迟)。
-
按照供应商协议, 通过 elisa 测量鼠标 tnf-a
- 稀释上清液 1: 1 在测定稀释剂 (准备使用含蛋白质的缓冲液)。
- 准备试剂、样品和标准稀释剂, 如试剂盒中所述。在每口井加入50μl 的检测稀释剂。
- 每口井加入50μl 的标准、控制或样品。
- 将板框轻轻敲击1分钟。
- 盖上所提供的胶粘条, 在室温下孵育2小时。
- 对每口井进行吸气, 用 400μl/井清洗 (共重复这一步骤五次)。
- 最后清洗后, 通过吸气取出任何剩余的洗涤缓冲液。
- 将盘子反转, 并将斑点擦到干净的纸巾上。
- 在每口井中加入100μl 的小鼠 tnf-α共轭。盖上新的胶粘条。
- 在室温下孵化2小时。
- 重复吸气/清洗, 如7.4.4 的步骤。
- 在每口井中加入100μl 的基板溶液, 并在室温下培养 30分钟, 不受光线影响。
- 在每口井加入100μl 稀释的盐酸溶液 (停止溶液)。轻轻轻触板材, 以确保彻底混合。
- 使用微板读取器 (在30分钟内完成) 测量 450 nm 的光学密度 (校正波长设置为 560 nm)。
- 稀释上清液 1: 1 在测定稀释剂 (准备使用含蛋白质的缓冲液)。
-
细胞活力
- 从 pbmc 或单核细胞制剂中去除上清液后, 使用可随时使用重新待命液 (氧化还原指示剂) 的方法评估细胞的活力, 该溶液直接添加到细胞悬浮液中, 最终浓度为10%。
- 在37°c 下培养 1至2小时, 5% co2。
- 使用微板读取器在 590 nm (励磁540纳米) 处阅读荧光。
8. 化合物制备
-
immodc 的串行稀释
- 将 mlt-827 库存溶液 (二甲基亚硫酸盐 (dmso) 中的 10 mm) 稀释到介质中, 一次性达到 8μm (浓缩 4倍)。
- 使用中等 + 0.08% dmso 进行六步 1: 5 串行稀释。对于车辆 (无复合), 请使用相同的介质 + 0.08% dmso 解决方案。
-
immodc 的单剂量检测
- 将 mlt-827、afn700 和 cpd11 库存解决方案稀释到介质中, 一次性达到 4μm (浓缩 4倍)。
-
小鼠脾脏细胞的连续稀释
- 将 10μm mlt-827 溶液 (在介质中一次稀释后从10mm 库存溶液中提取) 稀释至 0.01μm, dmso 端部浓度为0.1%。
- 对于稀释步骤, 对每次稀释采取 2μl, 加入 38μl rpmi, 并将5μl 移入井中。
请注意:所有治疗均为一式三份。
9. 刺激准备
-
贫化 (dz)
- 在10毫克 dz 中加入2毫升无菌内毒素水。
- 涡旋对股票溶液进行均质化, 涡旋也优先于每次使用。
- 液体溶液, 并在-20°c 下储存脂肪。
-
海藻糖-6, 6-二苯甲酸酯 (tdb)
- 在1毫克 tdb 中加入100μl 的 dmso, 在水浴中加热15–30秒。
- 涡旋并立即加入900μl 的无菌 pbs, 涡旋再次。
- 在60°c 下加热 10-15分钟, 每次使用前通过涡流进行均质化。
- 将溶液保持在4°c。
- 为 mlt-827 化合物进行连续稀释和单剂量制备。
请注意:由于 tdb 需要在 dmso 中制备, 因此在细胞刺激过程中会出现最终1% 的 dmso 浓度。
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Representative Results
在骨髓细胞中, alt1 将激活信号传递到几种 c 型乳素样受体的下游, 如十氯化锡-1、十丁-2 和 mincle6。这些途径依赖于 (下摆) 含 itam 图案的受体 (例如, dectin-1) 或含有 itam 的共同受体 (例如, fcrγ, 用于 Dectin-1 和 mincle), 用于招募和激活 sykinase (图 1)。这导致激活蛋白激酶 c 等形, 即 pkc, 磷酸化 card9, 从而触发 card9/bcl/alt1 复合物的形成和招募 traf6 为下游 nf-b 活化12。相比之下, tlr-4 通路以独立于 alt1 但依赖 myd88/irak 的方式招募 traf6 进行 nf-b 激活 (图 1)。利用 malt1 缺乏症的遗传模型以及肽活性位点抑制剂 z-vpr-fmk11、13、14的药理治疗, 获得了 malt1 这种差异参与的证据。
我们使用最近报道的强效和选择性 malt1 抑制剂 mlt-82715,并询问这种化合物是否将调节 tnf 生产下游的 c 型凝集素样和 toll 样受体, 分别。人 pbmc 和小鼠脾脏细胞受到贫化的 zymosan (dz, 一种已知的十分-1 的激动剂) 或脂多糖 (lps, tlr-4 的已知激动剂) 的刺激, 我们测量了 tnf 释放在培养上清液20小时后。在人类和小鼠的检测中, mlt-827 选择性地阻断了由 decint-1 途径驱动的 tnf-生产, 但不是由 tlr-4 途径 (图 2)。我们在与 z-vrpr-fmk 化合物孵育时获得了类似的数据 (补充图 1)。
为了获得途径洞察, 我们在人类单核细胞和未成熟的单核细胞衍生树突状细胞 (imdoc) 中进行了进一步的实验, 将 mlt-827 与 syk 抑制剂 cpd11 16 和 ikk 抑制剂 afn700 15 的效果进行了比较 ..在 lps 刺激的单核细胞中, tnf-α的生产几乎完全被 afn700 废除, 但对 cpd11 (图 3a) 不敏感, 这分别与 tlr-4 通路对 nf-b/syk 活性的依赖性 (请参见图 1)。相比之下, 由 dectin-1 驱动的 itf-α生产在 Cpd11 中除了对 mlt-827 和 afn700 的敏感性外, 还显示了对 cpd11 的敏感性 (图 3b, 补充图 2), 为参与 sykcbm 信号提供了进一步的证据在 dectin-1 路径中的级联 (图 1)。值得注意的是, 在十丁-1 刺激时生产 il-1、il-6 和 il-23 对这三种抑制剂也很敏感, 从而表明了类似于 tnf 的调节机制。然而, 这三种化合物对 il-8 生产的影响有限, 表明这种细胞因子有一个独特的调节机制 (图 3b,补充图 2)。
除了 dectin-1 之外, 其他 cllr, 如 dectin-2 和 mincle, 还通过刺激 card9 信号组7来发挥作用。因此, 我们在 imodc 中测试了 mlt-827, 并对 mincle 激动剂-6-6-二苯并酸盐 (tbd) 进行了挑战。将 tbd 浓度提高到50μgml 以上导致 tnf-6、il-6 和 il-1 的生产, 从 mlt-827 的阻断效应 (图 4 a) 中可以看出, 这些浓度依赖于 malt1 副酶酶活性。当挑战 dz 浓度不断增加以刺激十金-1 的 imodc 时, 获得了一致的结果 (图 4b)。
图 1: 十分-1、mincle 和 tlr-4 下游的 nf-b 信号.这幅漫画描绘了骨髓细胞中十丁-1、十丁-2、mincle 或 tlr-4 下游的规范 nf-b 激活途径的主要特征。含有血红素的十氢-1 受体17可以直接与 syk 接触, 刺激 cbm (card9/bcl/alt1) 复杂的形成, 导致 traf6 依赖 nf-b 激活。其他 c 型类似盐酸盐的受体, 如 dectin-2 或 mincle 需要招募含有 itam 的 fcrγ链, 以参与 cbm 并激活 nf b。tlr-4 受体利用另一种机制进行 nf-b 激活, 依靠 trf6 上游的 myd88 和 iraknerak4 激酶。
图2:modtin-1 通过 alt1 的信号, 用于在人和小鼠细胞中生产 tnf-α 。(a) 人类 pbmc 数据, 如 unterreiner 等人 (unterreiner 等人), 2017年 (图 2a)11。在 mlt-827 分级浓度的情况下, 用 llr-4 激动剂 (tlr-4 激动剂) 或 100μgml dz (十元-1 激动剂) 对人体 pbmc 进行了20小时的刺激。由 htrf 对上清液中释放的 tnf 进行了量化。(b) 用 mlt-827 浓度范围的小鼠脾脏细胞进行30分钟的治疗, 然后用 30μgml dz 或 1μgml lps + 10 ngml ifn. tnf-α在细胞培养中进行了18h 的刺激。显示了具有相似结果的两个实验中的一个, 即三个测量值的伪 sem。
图 3: tlr-4 和 dectin-1 下游细胞因子生产的 ikk-and/or syk 依赖关系.(a) 用 mlt-827 (1μm)、cpd11 (1μm) 或 afn700 (3μm) 或车辆 (dmso) 对人单核细胞进行了1小时的预处理。用 10 ngml lps 刺激细胞, 时间为 20小时, tnf--用 htrf 对上清液进行量化。(b) tnf-α, il-1β, 用 mlt-827、cpd11、afn700 (均在1微米) 或 dmso 预孵育1小时后, 由人类单核细胞衍生树突状细胞 (imodc) 生产的 il-6、il-23 和 il-8 刺激了 24小时, dz (100μg/ml)。dmso 处理样品中的细胞因子水平定为100%。数据是三种测量的手段±sd, 代表了三个独立的实验。* p < 0.05;* * p < 0.01;p < 0.001, 未配对的双尾学生 t 测试。
图4:c 型乳素依赖细胞因子由 icmodc 生产.tnf-α、il-1β和 il-6 由 icodc 生产刺激24小时与 mincle 激动剂 trehaloe-6, 6-二贝酸盐 (tdb, 100μgml) (a) 或与十元-1 激动剂 dz (100μgml) (b) 在用 mlt-827 (1μm) 或 dmso 预培养1小时后。数据是三种测量的手段±sd, 代表了三个独立的实验。
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Discussion
在这项工作中, 我们使用简单的实验设置来研究人和小鼠先天细胞的信号通路, 并询问他们对 alt1 蛋白溶解功能的依赖。在先前工作11的基础上, 我们的研究表明, alt1 副酶活性控制 c 型肌肽样受体诱导的细胞因子的产生, 包括 tnf-α。相反, tlr-4 诱导的 tnf-α在这两个物种中都与 alt1 无关。这些数据总体上证实了 c 型乳素样受体下游的 m异位谱的关键和选择性贡献, 早期的研究6,12,18揭示了这一贡献。
骨髓细胞中的 tlr-1 信号的清晰独立性是否适用于其他细胞类型还有待探讨。例如, 在 b 淋巴细胞中, tlr 信号以前被证明有助于 b 细胞抗原受体19 下游的 b 细胞激活。事实上, 我们有未公布的证据表明, tlr-4 刺激了人和小鼠 b 细胞对 mlt-827 的敏感性。因此, b 细胞受体下游的进一步机械洞察将是有价值的。在此背景下, 最近对 b 细胞淋巴瘤的一项研究为 b 细胞受体和 tlr9 受体20下游的信号通路的聚集提供了证据。traf6 在 b 细胞受体和 tlr 通路中充当 nf-b 激活的介质, 可能是一个串扰点, 这可以解释这两种途径对 alt1 蛋白酶抑制的敏感性。相反, tref6 也是 cllr 和 tlr 的一个常见的下游播放器, 用于诱导 nf-b, 但这两种途径在骨髓细胞中似乎不会以与 palt1 旁侧向依赖的方式串扰。
这项工作的重点是细胞因子的生产, 它提供了一个简单的读出信号通路, 并可以很容易地实现复合分析。它强调了选择性和有效的 alt1 抑制剂的价值, 以解开 alt1 生物学。获得进一步的机械洞察将需要额外的工作和开发更近端的检测, 例如, 定性的 matr1 的基板涉及固有的信号调节。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 elsevier 授权 (许可证编号 4334770630127) 在这里复制来自 unterreiner等人的图 2a 。(2017年)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm nylon cell strainer | Sigma | CLS431752 | |
| 14 mL Falcon tube | BD Falcon | 352057 | |
| 15 mL Falcon tube | Falcon | 352090 | |
| 50 mL Falcon tube | Falcon | 352070 | |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid | Costar | 3595 | |
| 96 well V-bottom plate | Costar | 734-1798 | |
| Ammonium Chloride - NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Assay diluent RD1-W ELISA | R&D | 895038 | Assay diluent |
| Cell culture microplate, 384 well, black | Greiner | 781986 | |
| Depleted Zymosan | Invivogen | tlrl-dzn | now: tlrl-zyd |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO |
| EDTA-Na2 | Sigma | E5134 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate |
| ELISA muTNF-α | R&D | SMTA00 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| gentleMACS C tubes | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS dissociator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| GM-CSF | Novartis | - | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum | Gibco | 10082 | FBS |
| HTRF hu IL-23 | CisBio | 62HIL23PEG | |
| HTRF hu TNF-α | CisBio | 62TNFPEC | |
| HTRF reconstitution buffer | CisBio | 62RB3RDE | 50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA |
| IFN-γ | R&D | L4516 | |
| IL-4 | Novartis | - | |
| Isoflurane | Abbott | Forene | |
| Lipopolysaccharides (LPS) | Sigma | L4391 | LPS used in human samples |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516 | LPS used in murine samples |
| Lysis buffer | Self-made | - | 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Magnet | Stemcell | 18001 | |
| Microplate, 384 well white | Greiner | 784075 | |
| Monocytes enrichment kit | Stemcell | 19059 | |
| Nalgene Mr. Frosty Cryo 1°C Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | cooling device (containing Propanol-2) |
| PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2 | Gibco | 10010 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Pen/Strep |
| Potassium bicarbonate - KHCO3 | Sigma | P9144 | |
| PrestoBlue | Invitrogen | A13262 | Resazurin solution for viability assessment |
| Propanol-2 | Merck | 1.09634 | |
| Read buffer | MesoScale Discovery | R92TC-3 | Tris-based buffer containing tripropylamine |
| Recovery cell culture freezing medium | Gibco | 12648-010 | freezing medium |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax | Gibco | 61870 | + 10% FBS for iMoDCs + 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes + 10% FBS + Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for murine splenocytes |
| Separation buffer | Self-made | - | PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Trehalose-6,6-dibehenate | Invivogen | tlrl-tdb | TDB |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | Polysorbate 20 |
| UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15675 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Viewseal sealer | Greiner BioOne | 676070 | |
| V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit | MesoScale Discovery | K15049D | electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8) |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350 |
References
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