Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

תאים מיאלואידים מולדת איתות לשביל רגולציה על-ידי פעילות Paracaspase MALT1

doi: 10.3791/58439 Published: January 7, 2019
* These authors contributed equally

Summary

MALT1 מסדיר מולדת חסינות אך איך זה מתרחש נשאר מעורפל. השתמשנו החומר המדכא paracaspase סלקטיבית MALT1 הטכנולוגי-827 לפענח את התרומה של MALT1 איתות מולדת במורד הזרם של קולטני לקטין דמוי כמו אגרה או C-type, הוכחת MALT1 מסדיר את הייצור של תאים מיאלואידים ציטוקינים, ויוצאת של קולטני לקטין דמוי C-type, באופן סלקטיבי.

Abstract

מלבד תפקודו בתאים הלימפה, אשר טופלה על ידי מחקרים רבים, paracaspase MALT1 גם ממלא תפקיד חשוב בתאים מולדת במורד הזרם של קולטני זיהוי דפוס. למד בצורה הטובה ביותר הם בני Dectin-1 ו- Dectin-2 של משפחת לקטין דמוי קולטן מסוג C זה לגרום SYK CARD9 ותלוי איתות אשד שמוביל NF-κB ההפעלה, באופן תלוי-MALT1. לעומת זאת, כמו אגרה קולטנים (TLR), כגון TLR-4, הפצת NF-κB הפעלה אבל אות דרך המפל MYD88/שמסכנים-תלוי. בכל זאת, MALT1 עשוי לתרום TLR-4 איתות נשאר לא ברור. הראיות זה התבצעה עם המכון הטכנולוגי-827, מעכב חזק, סלקטיבי של פעילות paracaspase MALT1, מציין כי TNF-ייצור במורד הזרם של TLR-4 בתאי מיאלואידית אדם אינו תלוי MALT1, בניגוד TNF-הייצור במורד הזרם של Dectin-1, אשר הוא MALT1 התלויים. כאן, אנחנו פתרנו את מעורבות סלקטיבי של MALT1 זיהוי תבניות חישה עוד יותר, באמצעות מגוון של האדם ואת ההכנות הסלולר העכבר גירוי של Dectin-1, MINCLE או TLR-4 מסלולים. אנחנו גם מספק תובנות נוספות על-ידי חקר ציטוקינים מעבר TNF- ולאחר השוואת הטכנולוגי-827 מעכב SYK (Cpd11), מעכב IKK (AFN700). באופן קולקטיבי, הנתונים שנמסרו ראיות נוספות עבור MALT1-התלות של קולטן דמוי לקטין C-type – איתות לעומת זאת כדי TLR איתות.

Introduction

הפעילות paracaspase של MALT1 (רירית הקשורים רקמת הלימפה לימפומה רוברטסונית חלבון 1) התגלה ב 20081,2. מאז, מספר מחקרים דיווחו על תרומתה קריטי אנטיגן קולטן תגובות לימפוציטים. דגמים גנטיים העכבר כמו גם נתונים פרמקולוגיה תמיכה תפקיד מפתח בתאי T, T-cell התלויים מחלת חיסון עצמי, B-cell לימפומה הגדרות3,4. לימפוציטים, הפעלת paracaspase MALT1 חל על הרכבה של CARD11-BCL10-MALT1 מורכבים5, אשר מופעלת על ידי אנטיגן קולטן proximal איתות במורד הזרם של הקולטן T - או B-cell. יש גם ראיות המלמדות כי מתחם CARD9-BCL10-MALT1 דומה חשוב להפצת אותות במורד הזרם של קולטני לקטין דמוי C-type (הר ר), למשל, Dectin-1, Dectin-2 ו- MINCLE ב מיאלואידית תאים6,7. Dectin-1 נחקרה היטב כי מסלול זה הוא קריטי עבור המארח הגנה מפני זיהומים פטרייתיים8,9. המשמעות של MALT1 במשעולים קולטן דמוי-אגרה (TLR), עם זאת, נותרה במחלוקת10. הראיות זה התבצעה בתאי מיאלואידית אדם לשלול תפקיד ישיר לפעילות paracaspase MALT1 בוויסות של TNF-ייצור במורד הזרם של TLR-411.

בשנת העבודה הנוכחית, השתמשנו שונים הגדרות ניסיוני מופחתים בן אנוש וכל התנאים התאים מיאלואידית העכבר כדי לחקור מולדת איתות המסלולים, להסתמך על כלי תרופתי מסוים מעכבי ומדידה של ייצור ציטוקינים.

Protocol

הניסויים נערכו על פי קווים מנחים סטנדרטים של ועדת האתיקה נוברטיס מחקר אנושי.

1. הכנת תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) מן האדם מעילים באפי

הערה: קיבלנו מעילים באפי מתנדבים בריאים יום לאחר אוסף, בשקיות 50 מ. הם היו בתנאי מדעת, הנאסף דרך Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuz. . טיפלנו בהם באמצעות ההליך שלהלן, בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת.

  1. להכין סטרילי ונקי זוג מספריים, גביע 1 ליטר עם שקית ניילון (תחת זרם פרופריה).
  2. להעביר את המעיל באפי כשהספל ופתיחתו בזהירות עם המספריים.
  3. בעזרת פיפטה 25 מ ל, להוסיף 100 מ של באגירה פוספט מלוחים מאגר/ethylenediaminetetraacetic חומצה (PBS/EDTA: PBS 1 x pH 7.4 המכילה CaCl2 , MgCl2, בתוספת 2 מ מ EDTA pH 8.0).
    הערה: באמצעות אותו פיפטה, לאחר לאט pipetting את הפתרון למעלה ולמטה, לוותר על 25 מ של המעיל באפי מדולל לתוך צנטריפוגה חרוט 6, שפופרות 50 מ ל מראש עם 15 מ"ל של צפיפות המבוסס על רב-סוכר צבע מילוי.
  4. צנטריפוגה 20 דקות ב x 800 גר' עם התאוצה מתונה (מוגדר אצל 4 מתוך 9) ללא בלמים כדי לאפשר הפרדה בין התאים בהתאם צפיפות שלהם.
    הערה: לאחר צנטריפוגה, שלוש שכבות יהיה גלוי; גלולה המכילה תאי דם אדומים, גרנולוציטים, רובד גבוה גרם של פלסמה, ובין טבעת לבן המכיל תאי תאי דם היקפיים (PBMCs).
  5. לקצור את הטבעת PBMC באמצעות פיפטה של 10 מ"ל העברת צינורות 50 מ ל חדש.
    הערה: שלושה צינורות 50 מ ל נדרשים בדרך כלל עבור המעיל באפי. בשלב זה, איזה פלזמה סביר מזהם את PBMCs שנאספו, אשר צריך להיות ללא השפעה על הצעדים הבאים העשרה.
  6. טופ עד 50 מ"ל כל צינור באמצעות PBS/EDTA והמשך שלושה רצופים שוטף עם הפחתת צנטריפוגה זמן ומהירות (15 דקות ב- 520 x גרם, 10 דקות ב x 330 ג', 8 דקות ב x 150 גרם).
    הערה: בכל שלב, תגובת שיקוע נמזג בתוך מיכל פסולת נוזלית ולא בגדר התא הוא resuspended ב 50 מ של PBS/EDTA (כדורי עשוי להיות מאוחסן במאגר שתכבס אותה).
  7. לאחר השטיפה הסופית resuspend בגדר ב 25 מ של מאגר פירוק כקרח (ראה טבלה של חומרים) כדי lyse כדוריות דם אדומות על ידי לחץ אוסמוטי.
  8. דגירה עד הפתרון נעשה ברור (≤5 דקות בטמפרטורת החדר).
  9. לעצור את התגובה על ידי הוספת 25 מ של מאגר ההפרדה (PBS 1 x pH 7.4 המכילה CaCl2 , MgCl2, בתוספת 2% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS) ו- 1 מ מ EDTA pH 8.0).
  10. לשטוף פעם נוספת ב x 150 גרם במשך 8 דקות.
    הערה: בשלב זה PBMCs יכול לשמש אוכלוסיה בתפזורת (ראה שלב 3: טיפולים PBMCs ומונוציטים ותנאים מופחתים) או יעובדו. מונוציט העשרה (ראה שלב 2: הכנת ומונוציטים מ- PBMCs), או קפוא למטה לשימוש עוקבות (ראה שלב 5: ומונוציטים ו PBMCs הקפאה \ הפשרה נהלים).

2. הכנת ומונוציטים מ- PBMCs

  1. Resuspend את PBMCs שהושגו בשלב 1.10 במאגר ההפרדה, לספור אותם להגיע 5 x 107תאים למ"ל.
  2. העברת התליה תא לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 14 מ עם מכסה.
  3. להוסיף 50 µL של נוגדן העשרה מונוציט קוקטייל לכל מיליליטר תא ההשעיה, מערבולת, דגירה 10 דקות ב 4 º C.
  4. הוסף µL 50 של חרוזים העשרה מונוציט לכל מ"ל של תאים.
    הערה: החרוזים חייב להיות יסודי vortexed כדי להבטיח אחידות ההשעיה.
  5. אחרי הוספת החרוזים, זמן קצר מערבולת התליה תא, דגירה 5 דקות ב 4 º C.
  6. לשטוף את החלק העליון של הצינור עם מאגר ההפרדה עד הצינור מלא עד 10 מ"ל.
  7. מערבבים לאט את הפתרון על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
  8. למקם את צינור בלי הכובע מגנט ההפרדה.
  9. תקופת דגירה של 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. שופכים לאט לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 15 מ"ל.
  11. בשלב זה, השתמש ומונוציטים ישירות (ראה שלב 3: טיפולים PBMCs ומונוציטים ותנאים מופחתים) או להבדיל אותם לתוך אניmmature מוnocyte-derived Dendritic Cells (iMoDCs) (ראה שלב 4), או להקפיא אותם למטה לשימוש עוקבות (ראה שלב 5).

3. PBMCs, ומונוציטים טיפולים ותנאים מופחתים

  1. לספור תאים ו לדלל אותם תרבות בינוני (רוזוול פארק אנדרטת מכון בינוני (RPMI) 10% FBS + 1 מ"מ פירובט נתרן + U/mL 100 פניצילין סטרפטומיצין (עט/דלקת) + 5 מיקרומטר β-mercaptoethanol), עד 1.25 x 104 תאים/טוב.
  2. פזר µL 30 של השעיה תא לכל טוב של צלחת 384-. טוב.
  3. להוסיף 15 µL של 4 x מרוכזים פתרונות מורכבים, טרום תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  4. להוסיף ליפופוליסכריד (LPS) ריכוז סופי של 10 ng/mL, או דלה zymosan (DZ) כדי ריכוז הסופי של 100 µg/mL, או לשמור על בינוני רגיל.
  5. דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  6. לקחת 10 µL של תגובת שיקוע כדי למדוד רמות TNF-a המופרש (ראה שלב 7: מדידות ציטוקינים ו הכדאיות).

4. ומונוציטים בידול לתוך iMoDCs ותנאים מופחתים

  1. לספור ומונוציטים (מועשר בשלב 2), centrifuge התליה תא ב x 520 גרם במשך 5 דקות.
  2. פיפטה הנחה תגובת שיקוע והוסף תרבות בינוני (RPMI + 10% FBS לקבל השעיה תא הסופי של 0.4 x 106 תאים למ"ל.
  3. מוסיפים 80 ננוגרם למ"ל רקומביננטי האנושי IL-4 + 100 ננוגרם למ"ל GM-CSF.
  4. לוותר על 5 מ של השעיה תא לכל טוב בצלחת 6-. טוב.
  5. תקופת דגירה של 7 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  6. יום 7, לקצור תאים על-ידי pipetting בעדינות כדי למנוע את ההפעלה שלהם.
  7. צנטריפוגה ב x 520 גרם במשך 5 דקות.
  8. וביופסיה ואקום, resuspend ב 50 מ של תרבות בינונית ללא גורמי גדילה.
  9. צנטריפוגה ב x 520 גרם במשך 5 דקות, resuspend-עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל במדיום תרבות.
  10. לוותר על 100 µL תא השעיה (105 תאים) לכל טוב של צלחת בתחתית שטוח 96-ובכן.
  11. Incubate מראש עבור h 1 ב 37 ° C לאחר הוספת 50 µL של 4x מרוכזים פתרונות מורכבים, שהוכן כפי שמתואר בשלב 8: תרכובות הכנה.
  12. הוסף µL 50 של גירויים (מרוכז x 4), שהוכן כפי שמתואר בשלב 9.
  13. דגירה 24 שעות ב 37 º C.
  14. לערבב טוב, העברת תאים כל תגובת שיקוע (SN) לתוך צלחת V-התחתון 96-ובכן.
  15. ספין למטה ב x 475 g למשך 5 דקות.
  16. להעביר את תגובת שיקוע לתוך צלחת חדשה בתחתית שטוח 96-ובכן, לאטום ומקפיאים ב-20 ° C עד שימוש נוסף.

5. ומונוציטים ו PBMCs הקפאה \ הפשרה נהלים

  1. מקפיא
    1. ספין למטה PBMC או מונוציט תא ההכנות ב x 520 גרם 5 דקות.
    2. ואקום וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend תאי הקפאה מדיום-עונה 1 פרק 107 תאים למ"ל.
    3. לוותר על 1 מ"ל של השעיה תא לתוך cryotubes, להעביר הצינורות הקירור להתקן ספציפי (ראה טבלת חומרים) ולמקם אותו ב-80 מעלות צלזיוס.
  2. מפשיר
    1. להפשיר את cryotube, העבר במהירות את התוכן שלה לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 15 מ"ל, המכיל 9 מ של תרבות בינוני.
    2. צנטריפוגה ב x 520 גרם במשך 5 דקות.
    3. ואקום וביופסיה תגובת שיקוע, resuspend תא גלולה ב 5 מ של תרבות בינוני. תאים הם עכשיו מוכן לעיבוד נסיוני נוסף.

6. העכבר הטחול תאים הכנה וטיפול

הערה: ערכנו קורבנות בעלי החיים על פי קווים מנחים סטנדרטים של נוברטיס חיה רווחה בארגון. מחקרים אושרו על ידי ועדת האתיקה של הרשות ממשלתיים אזוריים (Kantonales Veterinäramt העיר באזל). הקרבנו בעלי חיים על ידי חשיפת יתר איזופלוריין, עם כל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל.

  1. הקציר הטחול, מביצועם רקמות באמצעות צינור מאובזרים עם מכשיר חיתוך רקמה מכנית, מלא עם 5 מ של בינוני RPMI קר.
  2. השתמש בתוכנית הטחול של המכונה דיסוציאציה לטחון איברים.
  3. לסנן את התאים דרך מסננת תא ניילון 100 מ מ.
  4. להעביר את המתלים לתוך צינורות 50 מ ל, צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 320 x g.
  5. ואקום לשאוב תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- 3 מ"ל של פירוק כקרח מאגר ולאחר תקופת דגירה של ≤2 דקות על קרח.
  6. לעצור את פירוק על-ידי הוספת 7 מ של RPMI בינונית.
  7. לסנן שוב דרך מסננת תא ניילון 100 מיקרומטר.
  8. ספין למטה תא ההשעיה ב x 330 גר' 10 דקות ב 4 º C.
  9. ואקום וביופסיה תגובת שיקוע, resuspend תאים על 11 x 106 תאים למ"ל במדיום מלאה (RPMI בתוספת 10% FBS, עט U/mL 100/שלב ו- 5 מיקרומטר β-Mercaptoethanol).
  10. צלחת עונה 1 פרק 106 תאים/טוב (90 µL) לתוך צלחת 96-ובכן (בתחתית שטוח).
  11. להוסיף 5 µL של 20 x מרוכז פתרון במתחם קודם לכן מעורבבת עם RPMI בינוני כפי שמתואר בשלב 8.3: דילול טורי עבור תאי הטחול מאתר.
  12. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  13. להוסיף 5 µL של 20 x מרוכז DZ (הריכוז הסופי 30 µg/mL) או 20 x מרוכז LPS + IFN-g (TLR-4) (ריכוז סופי 1 מיקרומטר LPS ו 10 ננוגרם למ"ל IFN-g).
  14. דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  15. צנטריפוגה ב x 330 גרם במשך 10 דקות.
  16. להעביר את supernatants, את לוחיות הרישוי, לאטום ומקפיאים ב-20 ° C עד שימוש נוסף.

7. ציטוקינים ומדידות הכדאיות

  1. האדם TNF-a מדידה על ידי HTRF (הומוגנית זמן נפתרה קרינה פלואורסצנטית)
    הערה: הפרוטוקול בעקבות ההמלצות של הספק, לסכם בקצרה להלן.
    1. לערבב 1 נפח של ריאגנט משוקם (אנטי TNF--cryptate ו- anti-TNF--XL665) עם 19 כרכים של מאגר הכינון (50 מ מ פוספט מאגר pH 7.0, 0.8 מ' אשלגן פלואוריד (KF), 0.2% אלבומין שור (BSA)).
    2. לערבב שני פתרונות נוגדנים מוכנים לשימוש 1:1 רק לפני מחלק את ריאגנטים.
    3. לוותר על 10 µL של supernatants מ שלב 3.6 לבן לוחות 384-. טוב.
    4. לוותר על 10 µL של המיקס נוגדן.
    5. מכסה לצלחת עם סילר לאיטום, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    6. לקרוא את לוחית הזיהוי קורא microplate (50 – 200 פלאש).
  2. מדידה איל-23 האנושי על-ידי HTRF (הומוגנית זמן נפתרה קרינה פלואורסצנטית)
    הערה: הפרוטוקול בעקבות ההמלצות של הספק, לסכם בקצרה להלן.
    1. מערבבים אחסון אחד של ריאגנט משוקם (אנטי-IL-23-cryptate-נוגדן ו- anti-IL-23 D2-נוגדן) עם 19 כרכים של מאגר זיהוי #3.
    2. לערבב שני פתרונות נוגדנים מוכנים לשימוש 1:1 רק לפני מחלק את ריאגנטים.
    3. לוותר על 10 µL של supernatants מ שלב 3.6 לבן לוחות 384-. טוב.
    4. לוותר על 10 µL של המיקס נוגדן.
    5. מכסה לצלחת עם סילר לאיטום, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    6. קרא את הצלחת על קורא microplate (50 – 200 ננומטר פלאש).
  3. האדם IL-6, IL-8, IL-1β ו- TNF-α מדידות על ידי electrochemiluminescence
    הערה: כל הדגימות היו מדולל ב 150/1 diluent 2 (דילול הראשון: µL 10 ב 150 µL ולאחר מכן µL 20 ב- 180 µL). הפרוטוקול בעקבות ההמלצות של הספק:
    1. לדלל תקן 2 diluent ודוגמאות.
    2. המשך דילול של תקן 2 diluent באמצעות לדילול טורי מקפלים 1/4.
    3. לשטוף צלחות שלוש פעמים עם מאגר לשטוף.
    4. לוותר על 50 µL של דוגמאות או תקן לכל טוב.
    5. תקופת דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר תחת עצבנות.
    6. לשטוף את הצלחת ארבע פעמים עם PBS + 0.05% Polysorbate 20.
    7. להוסיף 25 µL של זיהוי נוגדנים (60 µL של כל נוגדן עבור סופי 3 מ"ל) ב- diluent 3.
    8. תקופת דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר תחת עצבנות.
    9. לשטוף את הצלחת ארבע פעמים עם PBS + 0.05% Polysorbate 20.
    10. הימנעות בועות, להוסיף 150 µL לכל טוב של מאגר הקריאה (מאגר מבוסס-טריס המכיל tripropylamine, מדולל 2 x ב- ddH20) כמו מגיב משותף לדור אור ב- electrochemiluminescence immunoassays.
    11. לקרוא על הלוחית (ללא דיחוי) קורא מולטיפלקס צלחת.
  4. העכבר TNF-a מדידה על ידי אליסה ע פ הפרוטוקול של הספק
    1. לדלל תגובת שיקוע 1:1 ב diluent assay (מוכן לשימוש המכיל חלבון מאגר).
      1. להכין ריאגנטים, דגימות ו דילולים רגיל כפי שמתואר בערכה. להוסיף 50 μL של assay diluent מכל קידוח.
      2. הוסף μL 50 של תקן, שליטה או דוגמה לכל טוב.
    2. מערבבים על-ידי בעדינות הקשה מסגרת לוחית 1 דקות.
    3. מכסה עם רצועת דבק שסופקו, תקופת דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר.
    4. תשאף כל טוב, תשטוף עם μL 400/טוב (חזור על צעד זה חמש פעמים בסך הכל).
    5. לאחר השטיפה הסופית להסיר את כל מאגר שטיפת שנותרו על ידי כ רפה בעברית.
    6. הפוך את הצלחת, כתם נגד מגבות נייר נקי.
    7. להוסיף 100 μL של העכבר TNF-α המספר המשלים כל טוב. מכסים עם דבק רצועת קומיקס חדשה.
    8. תקופת דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר.
    9. חזור על השאיפה/כביסה כמו שלב 7.4.4.
    10. להוסיף 100 μL של פתרון המצע מכל קידוח, תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור.
    11. להוסיף 100 μL של חומצת מלח מדוללת פתרון (להפסיק פתרון) כל טוב. טפח בעדינות את הצלחת כדי להבטיח ערבוב יסודי.
    12. למדוד את הצפיפות האופטית-450 nm (עם אורך הגל תיקון שוכן בגובה 560 ננומטר) שימוש בקורא microplate (כדי לבצע בתוך 30 דקות).
  5. הכדאיות תא
    1. לאחר הסרת supernatants PBMC או מונוציט ההכנות, להעריך את הכדאיות התא באמצעות מוכן לשימוש resazurin פתרון (oxidation-reduction מחוון) להוסיף ישירות התליה תא כדי הריכוז הסופי של 10%.
    2. תקופת דגירה של 1 עד 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
    3. לקרוא זריחה-590 nm (עירור 540 nm) באמצעות קורא microplate.

8. הכנת תרכובת

  1. דילול טורי עבור iMoDCs
    1. לדלל הפתרון מניות הטכנולוגי-827 (10 מ מ דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) לתוך בינונית להגיע 8 מיקרומטר בבת אחת (4 x מרוכז).
    2. מבצע לדילול טורי שישה שלבים 1:5, שימוש בינוני + דימתיל סולפוקסיד 0.08%. השתמש באותו בינוני + 0.08% דימתיל סולפוקסיד פתרון עבור התנאי רכב (אין מתחם).
  2. מנה אחת בדיקה של iMoDCs
    1. לדלל את הפתרונות מניות הטכנולוגי-827, AFN700, Cpd11 לתוך בינונית להגיע 4 מיקרומטר בבת אחת (4 x מרוכז).
  3. דילול טורי עבור תאי הטחול מאתר
    1. לדלל פתרון של המכון הטכנולוגי-827 10 מיקרומטר (להשיג פתרון מניות 10 מ מ בעקבות לדילול ללכת אחד בינוני) מיקרומטר 0.01, עם ריכוז סוף דימתיל סולפוקסיד של 0.1%.
    2. עבור הצעדים דילול, קח 2 µL של כל דילול, הוסף 38 µL RPMI pipet 5 µL לתוך הבאר.
      הערה: כל הטיפולים מבוצעים דולר.

9. גירויים הכנה

  1. Zymosan מדולדל (DZ)
    1. להוסיף 2 מיליליטר מים נטולי אנדוטוקסין סטרילי 10 מ"ג DZ.
    2. המערבולת homogenize הפתרון מניות, מערבולת גם לפני כל שימוש.
    3. Aliquots פתרון וחנות aliquot ב-20 ° C.
  2. טרהלוז-6,6-dibehenate (TDB)
    1. להוסיף 100 µL של דימתיל סולפוקסיד 1 מ ג TDB, חום ב 60 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים עבור s 15-30.
    2. מערבולת ולהוסיף מיד µL 900 ל- PBS סטרילי, מערבולת שוב.
    3. חום למשך 10-15 דקות ב 60 מעלות צלזיוס, homogenize על ידי vortexing לפני כל שימוש.
    4. לשמור את הפתרון ב 4 º C.
    5. ביצוע דילולים טורי והכנת מנה בודדת באשר למתחם המכון הטכנולוגי-827.
      הערה: כי TDB צריך להיות מוכן ב דימתיל סולפוקסיד, ריכוז דימתיל סולפוקסיד 1% הסופי הוא נוכח בזמן גירוי התא.

Representative Results

בתאי מיאלואידית, MALT1 ממסרים הפעלת אותות במורד הזרם של מספר קולטני לקטין דמוי C-type, כגון Dectin-1, Dectin-2 ו- MINCLE6. המסלולים הללו מסתמכים על (שולי) ITAM מוטיב המכילים קולטנים (למשל, Dectin-1) או מוטיב המכילים קולטנים שיתוף ITAM (למשל, FcRγ, Dectin-2 ו MINCLE) זה לגייס ולהפעיל את SYK קינאז (איור 1). זה מוביל הפעלה של חלבון קינאז C isoform, כלומר PKCδ, אשר phosphorylates CARD9, ובכך שמפעיל היווצרות מורכבות CARD9/BCL10/MALT1 והגיוס של TRAF6 NF-κB במורד הזרם הפעלה12. לעומת זאת, מסלול TLR-4 מגייס TRAF6 ב MALT1-עצמאית אבל MYD88/שמסכנים-תלוי באופן להפעלה NF-κB (איור 1). ראיות למעורבות דיפרנציאלית הזה של MALT1 הושג באמצעות דגמים גנטיים של מחסור MALT1, כמו גם טיפול תרופתי עם פעיל peptidic-מעכב z-VRPR-fmk11,13,14.

אנחנו נעשה שימוש דיווחו לאחרונה חזק, סלקטיבי MALT1 המדכא הטכנולוגי-82715 ושאל אם תרכובת זו לווסת TNF-ייצור במורד הזרם של C סוג לקטין וחגיגיים כמו אגרה רצפטורים, בהתאמה. PBMCs אנושיים ותאי הטחול העכבר היו מגורה עם zymosan מדולדל (DZ, אגוניסט הידוע של Dectin-1) או ליפופוליסכריד (LPS, אגוניסט הידוע של TLR-4) ואנחנו נמדד TNF-שחרור בתרבות supernatant לאחר 20 h. האדם והן את מבחני העכבר, הטכנולוגי-827 לחסום באופן סלקטיבי TNF-הפקה מונחה על ידי השביל Dectin-1, אך לא לפי מסלול TLR-4 (איור 2). אנו להשיג נתונים דומים על דגירה עם המתחם z-VRPR-fmk (משלים איור 1).

לקבלת מסלול תובנות, ערכנו לניסויים נוספים ומונוציטים האנושי, לא בוגר, נגזר ומונוציטים תאים דנדריטים (iMoDCs), משווה את ההשפעה של המכון הטכנולוגי-827 לזה של ה-מעכב Cpd11 SYK16 , לזו של החומר המדכא IKK AFN70015 . ומונוציטים מגורה עם התקליטים, ייצור של TNF-α היה יושב כמעט לחלוטין על-ידי AFN700 אך לא היה רגיש Cpd11 (איור 3 א), אשר עולה בקנה אחד עם התלות/עצמאותן של מסלול TLR-4 ב- NF-κB/SYK פעילות, בהתאמה ( ראה איור 1). לעומת זאת, TNF-α הפקה מונחה על-ידי-Dectin-1 ב- iMoDCs מוצג רגישות כדי Cpd11 בנוסף רגישות הטכנולוגי-827, AFN700 (איור 3B, משלים איור 2), לספק הוכחה נוספת למעורבות של איתות SYK/CBM מדורגים ב מסלול Dectin-1 (איור 1). ראוי לציון, ייצור של IL-1, IL-6 ו- IL-23 על גירוי Dectin-1 היה גם רגיש מעכבי שלוש, ובכך המציינת את מנגנוני הרגולציה דומה TNF-. עם זאת, השפעה מוגבלת של שלוש תרכובות על ייצור IL-8 הציע מנגנון רגולטורי ברורים ציטוקין (איור 3B, Supplementary איור 2).

בנוסף Dectin-1, CLLRs אחרים, כגון Dectin-2 ו- MINCLE, הפונקציה באמצעות גירוי של signalosome CARD97. לכן בדקנו הטכנולוגי-827 ב iMoDCs עם אגוניסט MINCLE טרהלוז-6,6-dibehenate (TBD). העלאת ריכוז TBD מעל 50 µg/mL הוביל הייצור של TNF-, IL-6, IL-1, אשר הסתמך על פעילות paracaspase MALT1, כפי שניתן לראות מן ההשפעה חסימה של המכון הטכנולוגי-827 (איור 4A). תוצאות עקביות התקבלו כאשר מאתגר iMoDCs עם הגדלת ריכוזים של הצניחה כדי לעורר Dectin-1 (איור 4B).

Figure 1
איור 1: NF-κB איתות במורד הזרם של Dectin-1, MINCLE TLR-4- הקריקטורה מתארת התכונות העיקריות של קנוניקל NF-κB הפעלה מסלולים במורד הזרם של Dectin-1, Dectin-2, MINCLE או TLR-4 בתאי מיאלואידית. ה המכילות hemITAM Dectin-1 קולטן17 יכול לעסוק ישירות SYK לעורר היווצרות מורכבות CBM (CARD9/BCL10/MALT1), המוביל אל TRAF6 תלויים NF-κB הפעלה. אחרים קולטנים לקטין דמוי C-type כגון Dectin-2 או MINCLE צריכים לגייס בשרשרת FcRγ המכילים ITAM לעסוק של CBM ולהפעיל NF-κB. קולטנים TLR-4 להשתמש במנגנון אחר עבור הפעלת NF-κB, בהסתמך על MYD88, IRAK1/IRAK4 kinases במעלה הזרם של TRAF6.

Figure 2
איור 2: Dectin-1 אותות דרך MALT1 לייצור של TNF-α-אנוש ותאים העכבר. (א) PBMCs האנושי נתונים כמו Unterreiner et al., 2017 (איור 2 א)11. PBMCs האנושי היו מגורה עם 1 ננוגרם למ"ל של LPS (TLR-4 אגוניסט) או 100 µg/mL DZ (Dectin-1 אגוניסט) עבור 20 h בנוכחות ריכוזים מדורגת של המכון הטכנולוגי-827. TNF-שוחרר את תגובת שיקוע הייתה לכמת על-ידי HTRF. העכבר (B) תאי הטחול טופלו עם ריכוז מגוון של המכון הטכנולוגי-827 במשך 30 דקות ולאחר מכן גירוי עם µg 30/mL DZ או LPS µg 1/mL + 10 ng/mL IFN - עבור 18 ה TNF-α בתרבות תא supernatant נמדדה על ידי אליסה. אחד הניסויים שני עם תוצאות דומות מוצג, כפי שאומר ± SEM של שלוש מדידות.

Figure 3
איור 3: IKK - ו/או SYK-התלות של ייצור ציטוקינים במורד הזרם של TLR-4 ו- Dectin-1- ומונוציטים אנושי (א) היו מראש שטופלו לשעה עם המכון הטכנולוגי-827 (1 מיקרומטר), Cpd11 (1 מיקרומטר), או AFN700 (3 מיקרומטר) או רכב (דימתיל סולפוקסיד). התאים היו מגורה עם 10 ננוגרם למ"ל LPS עבור 20 h ו- TNF-ב תגובת שיקוע הייתה לכמת על-ידי HTRF. (B) TNF-α, IL-1β, IL-6, ייצור IL-23 ו- IL-8 על ידי האדם, נגזר ומונוציטים תאים דנדריטים (iMoDCs) מגורה במשך 24 שעות ביממה עם הצניחה (100 µg/mL) לאחר דגירה קדם 1 h עם המכון הטכנולוגי-827, Cpd11, AFN700 (הכל ב 1 מיקרומטר) או דימתיל סולפוקסיד. רמות ציטוקינים הדגימות שטופלו דימתיל סולפוקסיד נקבעו ב- 100%. הנתונים הם SD ± באמצעים של שלוש מדידות, הם נציג של 3 ניסויים עצמאית. * P < 0.05; * * P < 0.01; P אינטראקצית < 0.001, מבחן t דו-זנבית של סטודנט.

Figure 4
איור 4: C מסוג ציטוקינים לקטין-תלויי-כמו הפקה iMoDCs. TNF-α, IL-1β וייצור IL-6 על-ידי iMoDCs מגורה במשך 24 שעות עם אגוניסט MINCLE טרהלוז-6,6-dibehenate (TDB, µg 100/mL) (A) או עם אגוניסט Dectin-1 DZ (100 µg/mL) (B) לאחר דגירה קדם 1 h עם המכון הטכנולוגי-827 (1 מיקרומטר) או דימתיל סולפוקסיד. נתונים SD ± באמצעים של שלוש מדידות והם נציג של 3 ניסויים עצמאית.

משלימה קובץ 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה קובץ 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלימה 3- אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

בעבודה זו, היינו הגדרות ניסיוני פשוטה ללמוד איתות המסלולים-אנוש ותאים מולדת העכבר, ולחקור את התלות פונקציית הפרוטאוליטי MALT1. הרחבת העבודה הקודמת11, המחקר שלנו הראה כי MALT1 paracaspase פעילות פקדי C-type קולטן דמוי לקטין בהשפעת ציטוקינים הייצור, כולל TNF-α. לעומת זאת, TNF-α TLR-4-induced היה עצמאי של MALT1 בשני המינים. באופן קולקטיבי, נתונים אלה לאשר את התרומה מפתח, סלקטיבי של MALT1/CBM signalosome במורד הזרם של קולטני לקטין דמוי C-type, אשר נחנך על ידי קודמות מחקרים6,12,18.

אם ברור עצמאותן של TLR-4 איתות על MALT1 בתאי מיאלואידית חל השני תא סוגי שרידים כדי להבטיח את הזמנתכם. למשל, ב- B-לימפוציטים, TLR איתות בעבר הוצגה לתרום תאי B הפעלה במורד הזרם של B-cell אנטיגן קולטן19. למעשה, אנחנו שלא פורסמו ראיות כי TLR-4 מגורה אנושי, העכבר B תאים להציג רגישות הטכנולוגי-827. לכן, נוסף מכניסטית תובנות במורד הזרם של הקולטן B-cell יהיה יקר. בהקשר זה, מחקר שנערך לאחרונה בלימפומה של תאי B סיפק ראיות עבור קיבוץ באשכולות של המסלולים איתות במורד הזרם של הקולטן B-cell, קולטן TLR920. TRAF6, אשר פועל כמתווך עבור NF-κB הפעלת הקולטן B-cell והן המסלולים TLR, עשוי להיות נקודת crosstalk, אשר יכול להסביר את הרגישות של שני מסלולים MALT1 פרוטאז עיכוב. לעומת זאת, TRAF6 הוא גם שחקן במורד הזרם הנפוץ של CLLRs ו TLRs עבור אינדוקציה של NF-κB אך שני המסלולים הללו לא מופיעים crosstalk באופן תלוי-paracaspase MALT1 בתאי מיאלואידית.

עבודה זו התמקדה ייצור ציטוקינים, אשר מספק של הבדיקה קלה עבור איתות המסלולים ניתן ליישם בקלות עבור יצירת פרופילים מורכבים. זה הדגישה את הערך של מעכבי סלקטיבי וחזקים של MALT1 עבור unravelling MALT1 ביולוגיה. קבלת עוד תובנות מכניסטית ידרוש עבודה נוספת ופיתוח של מבחני קרובים יותר, למשל, כדי לאפיין את סובסטרטים של MALT1 מעורב מולדת איתות תקנה.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים Elsevier לאישור שלהם (רשיון מס ' 4334770630127) להתרבות כאן איור 2A מ. Unterreiner et al. (2017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µm nylon cell strainer Sigma CLS431752
14 mL Falcon tube BD Falcon 352057
15 mL Falcon tube Falcon 352090
50 mL Falcon tube Falcon 352070
6 well plates Costar 3516
96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid Costar 3595
96 well V-bottom plate Costar 734-1798
Ammonium Chloride - NH4Cl Sigma A9434
Assay diluent RD1-W ELISA R&D 895038 Assay diluent
Cell culture microplate, 384 well, black Greiner 781986
Depleted Zymosan Invivogen tlrl-dzn now: tlrl-zyd
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650 DMSO
EDTA-Na2 Sigma E5134 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate
ELISA muTNF-α R&D SMTA00
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-03
gentleMACS C tubes MACS Miltenyi Biotec 130-096-334
gentleMACS dissociator MACS Miltenyi Biotec 130-093-235
GM-CSF Novartis -
Heat-inactivated Fetal bovine serum Gibco 10082 FBS
HTRF hu IL-23 CisBio 62HIL23PEG
HTRF hu TNF-α CisBio 62TNFPEC
HTRF reconstitution buffer CisBio 62RB3RDE 50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA
IFN-γ R&D L4516
IL-4 Novartis -
Isoflurane Abbott Forene
Lipopolysaccharides (LPS) Sigma L4391 LPS used in human samples
Lipopolysaccharides Sigma L4516 LPS used in murine samples
Lysis buffer Self-made - 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4
Magnet Stemcell 18001
Microplate, 384 well white Greiner 784075
Monocytes enrichment kit Stemcell 19059
Nalgene Mr. Frosty Cryo 1°C Freezing Container Nalgene 5100-0001 cooling device (containing Propanol-2)
PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2 Gibco 10010 Phosphate-buffered saline
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140 Pen/Strep
Potassium bicarbonate - KHCO3 Sigma P9144
PrestoBlue Invitrogen A13262 Resazurin solution for viability assessment
Propanol-2 Merck 1.09634
Read buffer MesoScale Discovery R92TC-3 Tris-based buffer containing tripropylamine
Recovery cell culture freezing medium Gibco 12648-010 freezing medium
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax Gibco 61870 + 10% FBS for iMoDCs
+ 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes
+ 10% FBS + Pen/Strep + 5 µM β-mercaptoethanol for murine splenocytes
Separation buffer Self-made - PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0
Sodium Pyruvate Gibco 11360
Trehalose-6,6-dibehenate Invivogen tlrl-tdb TDB
Tween 20 Sigma P7949 Polysorbate 20
UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen 15675 Ethylenediaminetetraacetic acid
Viewseal sealer Greiner BioOne 676070
V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit MesoScale Discovery K15049D electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8)
β-Mercaptoethanol Gibco 31350

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Coornaert, B., et al. T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20. Nature immunology. 9, (3), 263-271 (2008).
  2. Rebeaud, F., et al. The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation. Nature immunology. 9, (3), 272-281 (2008).
  3. Jaworski, M., Thome, M. The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition. Cellular and Molecular Life Sciences. 73, (3), 459-473 (2016).
  4. Meininger, I., Krappmann, D. Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome. Biological Chemistry. 397, (12), 1315-1333 (2016).
  5. Qiao, Q., et al. Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly. Molecular cell. 51, (6), 766-779 (2013).
  6. Gross, O., et al. Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity. Nature. 442, (7103), 651-656 (2006).
  7. Chiffoleau, E. C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets. Frontiers in Immunology. 9, (FEB), 1-9 (2018).
  8. Taylor, P. R., et al. Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection. Nature Immunology. 8, (1), 31-38 (2007).
  9. Lanternier, F., et al. Primary immunodeficiencies underlying fungal infections. Current opinion in pediatrics. 25, (6), 736-747 (2013).
  10. Thome, M. Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation. Nature reviews. Immunology. 8, (7), 495-500 (2008).
  11. Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-α production downstream of TLR-4 in myeloid cells. Immunology Letters. 48-51 (2017).
  12. Strasser, D., et al. Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-δ to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity. Immunity. 36, (1), 32-42 (2012).
  13. Jaworski, M., et al. Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity. The EMBO journal. 33, (23), 2765-2781 (2014).
  14. Yu, J. W., et al. MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses. PLoS ONE. 10, (5), 1-20 (2015).
  15. Bardet, M., et al. The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition. Immunology and Cell Biology. 96, (1), 81-99 (2018).
  16. Thoma, G., et al. Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor. Journal of Medicinal Chemistry. 58, (4), 1950-1963 (2015).
  17. Bauer, B., Steinle, A. HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch. Science Signaling. 10, (508), 1-10 (2017).
  18. Gringhuis, S. I., et al. Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2. PLoS Pathogens. 7, (1), (2011).
  19. Dufner, A., Schamel, W. W. B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model. Cell Communication and Signaling. 9, (1), 6 (2011).
  20. Phelan, J. D., et al. A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma. Nature. In press (2018).
תאים מיאלואידים מולדת איתות לשביל רגולציה על-ידי פעילות Paracaspase MALT1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Unterreiner, A., Touil, R., Anastasi, D., Dubois, N., Niwa, S., Calzascia, T., Bornancin, F. Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity. J. Vis. Exp. (143), e58439, doi:10.3791/58439 (2019).More

Unterreiner, A., Touil, R., Anastasi, D., Dubois, N., Niwa, S., Calzascia, T., Bornancin, F. Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity. J. Vis. Exp. (143), e58439, doi:10.3791/58439 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter